植物のフィトクロム反応にモンゴメリーラボでの作業は、国立科学財団（助成金BLMにない。MCB - 0919100）と化学科学、地球科学およびバイオサイエンス部門、基礎エネルギー科学局、科学局、米国エネルギー省によってサポートされていますエネルギー（BLMへの助成金がない。DE FG02 91ER20021）。我々は共焦点の支援のためのシロイヌナズナプロトプラストの選別と博士メリンダフレームのプロトコルをソート蛍光活性化細胞の開発と最適化を支援するため博士はルイ王、実験的な援助のために、ステファニーコスティガンを撮影中に技術支援のためにメリッサウィテカーを感謝し、批判的に原稿を読んで顕微鏡。我々は編集支援のためのグラフィカルな設計の支援とカレンの鳥のためにマレーネキャメロンに感謝。

1。植物の成長<ol><li> 4（概要は図1参照）と野生型または親の行を説明するように単離した確認UAS - BVR X GAL4 - GFPエンハンサートラップライン、すなわちラインごと〜2000滅菌種子を、土壌に播種されています。 </li><li>植物は、22で100μmolm-2 s -1の白色照明° Cと70％の湿度下での土壌で5週間栽培されている。 </li></ol> 2。葉プロトプラスト単離（Deneckeとヴィタール9から適応） <ol><li>プロトプラストを単離するために、TEXのバッファを用意する。 - （N -モルホリノ）エタンスルホン酸（MES、2.56 mM）で、0.75 gの塩化カルシウム二水和物（塩化カルシウム2 · 2H 2 O、6.75 3.1グラムGamborgのB5塩、0.5 G 2：1リットルTEXのバッファの場合は、次のコンポーネントを重量を量るmM）を、0.25 gの硝酸アンモニウム（NH 4 NO 3、3.12 mM）で、136.9グラムのショ糖（0.4M）が。脱イオン、蒸留水の〜900ミリリットル（のddH 2 O）でコンポーネントを完全に溶解し、1で5.7にpHをもたらすM KOH。 1リットル、真空ポンプに接続さ0.2μmのボトルトップフィルターと殺菌フィルターに最終的なボリュームをもたらす。 </li><li>植物から緑、健康な葉を（緩くビーカーに充填葉の〜250 ml）を収集し、〜40ミリリットルのddH 2 O 4回で洗い流し、滅菌のddH 2 Oで二回リンスが続く細い短冊状に＃20メス、カット葉を使用し、均等に2個の50 mlの滅菌プラスチックチューブに組織を分割する。 10倍の葉の消化のストック溶液を5mlのアリコートを追加することにより、1 ×葉の消化液を調製する（10倍の葉の消化のストック溶液：2％（w / v）のMacerozyme R - 10、4％（w / v）のセルラーゼ&quot;小野塚&quot;TEXバッファでR - 10を、溶解0.2μmのフィルターで滅菌し、45 mlの新鮮なTEXのバッファは-80で5 mlのアリコート° C）を凍結フィルタ。すべての葉組織をカバーし、50 mlチューブあたり1 ×葉の消化ミックスの〜25 mlを加え。 </li><li>穏やかに振盪しながらロッカーに室温で3時間のインキュベーションに続いて水ポンプに接続された真空デシケーターを用いて室温で1時間開いてチューブ内の消化液中の葉組織を浸潤する掃除機。 1X葉の消化ミックスの葉組織を持つキャップチューブは、光への暴露を防止するためにこのプロセスの間にアルミホイルに包んで保存されています。 </li><li> 3時間後、プロトプラストを解放するために〜2分間ロッカーの速度を増加させる。残渣を除去し、無菌のガラスビーカーにろ液を収集するために滅菌チーズクロスの二つの層を通して原油プロトプラスト懸濁液をフィルターします。滅菌シャーレに無菌100μmのナイロンメッシュを通してろ液をフィルタします。フロースルーを収集し、新しい滅菌50 mlチューブに移す。滅菌シャーレを洗浄し、表面に付着したプロトプラストを収集するために新鮮なTEXのバッファの15〜20 ml程度使用してください。 </li><li> 10で100xgでスイングバケットローターを使用して℃で15分（加速度6、減速0）のためにフロースルーを心する。 </li><li>無菌9&quot;ガラスパスツールピペットは、フローティングプロトプラストの層を乱さないと〜10を離れることなく、蠕動ポンプに接続した状態で、残留してペレット破片が含まれているフローティングプロトプラストの層、下に液体を30ml - - 15mlの体積〜25を削除します。 </li><li>優しくプロトプラストを懸濁させる一方40mlの最終容量に新鮮なTEXのバッファを追加。 </li><li>できる限り多くの細胞残渣を除去するステップを2.5から2.7を2回繰り返します。遠心時間は、最初の繰り返しで10分に及び、最終的な繰り返しで5分に短縮されます。 </li><li>カット、新しい15mlのチューブに滅菌1 mlの転送ピペットでフローティングプロトプラストを吸引除去する。 4℃で2時間ソートするまでCまでのソートまたは暗所で店舗に直接進む。 </li></ol> 3。蛍光活性化細胞選別（FACS）によるソ​​ートプロトプラスト<ol><li>ソートする前に、プロトプラストの整合性とプロトプラストのプール内のGFP蛍光の有無を確認するために励起用の488 nmのレーザーを使用して共焦点レーザー走査顕微鏡（CLSM）でプロトプラストを調べます。最小限の残骸は、FACSソーティングノズルを目詰まりを避けるために必要です。 </li><li>適応プロトコル10を以下の約9 psiのシステム圧力で、6,000と15,000の間でイベントのレートでマクロソートの頭の上に200μmのノズルを用いてFACS経由TEXバッファー（BD FACSVantage SE、BD Biosciences社）でソート孤立プロトプラスト。 </li><li>野生型非GFPのプロトプラストは、自家蛍光のしきい値を決定するために使用されます。 </li><li> GFP陽性プロトプラスト、30分の530バンドを使用してGFP蛍光を識別するために、488 nmのアルゴンラインでの空冷アルゴンレーザー（スペクトラフィジックスモデル177、ニューポート社、カリフォルニア州アーバイン）は100 mWで動作を使用してソートの細胞を収集するにはフィルタを通過する。 </li><li> GFP陽性のプロトプラストのコレクションに続いて、ステップ3.1で説明するようにCLSMでソートプロトプラストを調べます。 </li><li>キアゲンしたRNeasy植物ミニキットを使用してソートされたプロトプラストからトータルRNAを抽出する。アフィメトリクスGeneChip exprに説明されているようにcDNAをハイブリダイゼーション用に調製することができるession解析技術マニュアル、その後ATH1シロイヌナズナアフィメトリクスの全ゲノム配列にハイブリダイズした。 </li></ol>代表的な結果我々は、FACSによるGFPのチャネルでGFP陽性細胞（図2）のかなりの数を検出する。血管や皮膚の発現に伴い、J1071は、〜1.4％のGFP陽性プロトプラストを持っていたのに対し、GFPエンハンサートラップの両親、構成的にGFPを発現するライン、J0571、表示された〜17％〜24パーセントのGFP陽性プロトプラストを用いた最適化アッセイで（表1）。 1時間J0571プロトプラストの3 ×500μlの（プロトプラスト懸濁液の約1.5 mlの合計）のソートは〜100,000 GFP陽性プロトプラストを与えた。 1.5時間J1071プロトプラストの3 × 500μlの（〜1.5ミリリットルの合計プロトプラスト懸濁液）のソートは、約3,000 GFP陽性プロトプラストを与えた。ソートが（図3Cと3E）に実施される前に、共焦点画像はJ0571とJ1071の両方のサンプルのプロトプラストの非常に高い収率を示し、ソートされたフラクションは、唯一の明るいGFP蛍光プロトプラストを（図3Gと示されていないデータ）が含まれていました。この発見は、無傷のGFP陽性プロトプラストを確認FACSを経由して並べ替えることができます。非GFPのプロトプラストはまたソートし、別々のチャンネルに集めることができます。非GFPのプロトプラストはholophytochromeレベルの減少によって遺伝子発現の特定の変更を検出するために、その後のマイクロアレイ解析のための理想的なネガティブコントロールとして機能する。分離されたプロトプラストからのRNA抽出（1 ml）をfluorospectrometry（図4）による検出のための十分な量のRNAが得られます。単離されたRNAは、光度計計器（光度計1000、サーモサイエンティフィック）を用いて評価し、光度計3.7.1 RNAの定量のソフトウェアにより定量した。 RNAの収量は、C24野生型プロトプラストまたは事前ソートされたFACSをソートから、GFP陽性のエンハンサートラップのプロトプラストは、マイクロアレイ用のRNAラベリングアッセイ（表2）で使用するために必要な最小20 ngを超えました。 <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td>エンハンサートラップライン</td><td> GFP陽性のプロトプラストの％ </td><td>ソートされたGFPのプロトプラストの数</td></tr><tr><td> J0571 </td><td> 17.18パーセント〜24.06パーセント</td><td> 26400〜36000 </td></tr><tr><td> J1071 </td><td> 〜1.43パーセント</td><td> 1,000〜1300 </td></tr></tbody></table>ソートおよび蛍光活性化細胞ソーター（FACSVantage、BD）を介してプロトプラスト懸濁液500μLを実行することにより、収集したGFP陽性プロトプラストの数の前に2エンハンサートラップ系統のGFP陽性プロトプラストの表1。割合。 <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td>工場のライン</td><td> RNA収量（NG） </td></tr><tr><td> C24 WT </td><td> 12486.5 </td></tr><tr><td> J0571 </td><td> 60 </td></tr><tr><td> J1071 </td><td> 71.5 </td></tr></tbody></table> 表2。プロトプラストからのRNA分離からの収量。 RNAは、2つのエンハンサートラップラインから事前にソートされたC24野生型またはソートされたGFP陽性のプロトプラストから分離し、定量した。 <img src="/files/ftp_upload/1925/1925fig1.jpg" alt="図1" /> 図1。 ビリベルジン還元酵素（BVR）トランスジェニックシロイヌナズナ植物における発現のGAL4エンハンサートラップベースの誘導。 （A）。 GAL4応答性GFPマーカー遺伝子を含むGAL4ベースエンハンサートラップ系統、、のライブラリーから選択された個々のマークGAL4含有細胞で標的遺伝子の発現を誘導するGAL4応答性標的遺伝子を含む系統と交配することができますGFP蛍光による。博士ジムHaseloff（http://www.plantsci.cam.ac.uk/Haseloff/geneControl/GAL4Frame.html）から図に基づいて。親系統におけるフィトクロム発色団、phytochromobilin（PΦB）とholophytochromeの（B）生産。 （C）左、ビリベルジン還元酵素（BVR）BRとPΦRに活動してビリベルジンIXα（BVIXα）とPΦBの削減、それぞれ。 PΦBの枯渇でBVRの活動の結果と光の生産holophytochromeの低下を導く。右、BVRによって触媒される反応が示されています。 <img src="/files/ftp_upload/1925/1925fig2.jpg" alt="図2" /> 図2。蛍光活性化細胞選別（FACS）取得のドットプロット。 C24野生型（）、J0571（B）およびJ1071（C）のソートプロトプラストの細胞の比較。 （A）非GFP蛍光C24野生型プロトプラストの取得ドットプロットでは、488 nmのアルゴンレーザーで励起し、自家蛍光閾値を決定するために使用。 （B）と（C）取得のドットプロットは、488 nmレーザーで励起に応答してGFP陽性であるプロトプラストの比率を示す。 R3は、BとC区切るのゲート蛍光活性化セルソーター（FACSVantage、BD）でソートし、収集されたGFP陽性のターゲットを選別。赤のチャネルには、vを示していますプロトプラストと緑のチャンネルからのクロロフィルの自家蛍光用alues​​は、GFP蛍光の値を示します。 <img src="/files/ftp_upload/1925/1925fig3.jpg" alt="図3" /> 図3。細胞選別のために使用される植物プロトプラストの共焦点顕微鏡。共焦点レーザーは、蛍光活性化セルソーター（FACS）を経由して（G）ソートする前に（A、C、E）と後のプロトプラストの画像をスキャン。 B、​​D、F及びHは、DICイメージです。 C24野生型（A、B）、J1071（C、D）およびJ0571（E、F、G、H）のプロトプラストが表示されます。 488 nmレーザーで励起から得られると自家蛍光（LP 650 nmの） - 画像C、EおよびGは、GFP蛍光（575 nmのBP 505 nm）の画像をマージされます。 Hを介して63x油下4スキャンの平均です。バー= 10μmの。 <img src="/files/ftp_upload/1925/1925fig4.jpg" alt="図4" /> 図4。fluorospectrometryによってプロトプラストから単離されたRNAの定量。 RNAは、（）C24野生型、（B）J0571、および（C）J1071から抽出。事前にソートされた野生型プロトプラストのためのRNAを示している。 BとCは、蛍光活性化細胞選別（FACS）でソートGFP陽性プロトプラストからRNAを示している。 RNAの定量のソフトウェア、光度計3.7.1、（エルエムエス1000、サーモサイエンティフィック）。

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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Right+place,+right+time:+Spatiotemporal+light+regulation+of+plant+growth+and+development.">Right place, right time: Spatiotemporal light regulation of plant growth and development.</a> Plant Signal Behav. 3, 1053-1060 (2008).</li><li>Laplaze, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GAL4-GFP+enhancer+trap+lines+for+genetic+manipulation+of+lateral+root+development+in+Arabidopsis+thaliana.">GAL4-GFP enhancer trap lines for genetic manipulation of lateral root development in Arabidopsis thaliana.</a> J. Exp. Bot. 56, 2433-2442 (2005).</li><li>Costigan, S., Warnasooriya, S. N., Montgomery, B. 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Methods. 2, 615-619 (2005).</li><li>Ma, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+control+of+Arabidopsis+development+entails+coordinated+regulation+of+genome+expression+and+cellular+pathways.">Light control of Arabidopsis development entails coordinated regulation of genome expression and cellular pathways.</a> Plant Cell. 13, 2589-2607 (2001).</li><li>Chen, M., Chory, J., Fankhauser, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+signal+transduction+in+higher+plants.">Light signal transduction in higher plants.</a> Annu. Rev. 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マイクロアレイ（1）を介して遺伝子発現プロファイリングは、11規制シロイヌナズナ実生の遺伝子の30％以上が光であることが分かっていますし、（2）、13フィトクロムシグナル伝達カスケード12に関与する光シグナル伝達タンパク質をコードする遺伝子の広大なグループを特定している。そのような実験は、光が遺伝子発現の急激かつ長期的変化を誘導することを示唆している。フィトクロムの各プールには、発達と適応応答のサブセットのみを制御してもよい。また、下流のシグナル伝達成分が細胞と組織特異的様式2、14、15のフィトクロムと相互作用する可能性があります。 下流候補遺伝子の発現は、アップまたは標的BVRの発現の際にダウンレギュレートすることができます。 UAS - BVR X GAL4 - GFPの子孫と親系統における遺伝子発現の変化の比較分析を通じ、我々は遺伝子発現に明らかな変化を識別することができますどこにローカライズされたフィトクロム欠陥からそのような変更の結果。遺伝子発現プロファイルに基づいて、我々は、フィトクロムを介した細胞間シグナル伝達の負と正の因子をコードする遺伝子を識別することができます。最近のデータでは、数百の転写産物を植物組織16のprotoplastingにより誘導されることを示唆している。このように、マイクロアレイ解析のための理想的なネガティブコントロールRNAは、並べ替え中に収集された非GFPのプロトプラストから分離されています。植物組織からprotoplastingにより誘導される転写産物は、特に組織や器官に固有のフィトクロムシグナリングおよび/または応答に関与する標的遺伝子の同定、その結果、これらのコントロールを使用してデータ分析から除外することができます。細胞型特異的発現プロファイリングを経由して同定された遺伝子の発現における定常状態の変化を確認するには、定量RT - PCRは、ソートされたGFP陽性およびGFP陰性プロトプラストからポリ（A）RNAで行うことができる。 その発現マイクロアレイ解析で大幅に変更され、定量RT - PCRによって確認された遺伝子は、離散的なフィトクロムを介した細胞間シグナル伝達に関与する候補として識別されます。 T - DNA挿入変異体は、候補遺伝子で既に利用可能な場合は、それらが光の不自由な表現型を分析することができます。候補遺伝子と野生型に知られているフィトクロム変異体の変異を持つ変異体の表現型を比較す​​ることによって、我々は、候補遺伝子の調節的役割を持つ、特定の応答を識別することができます。候補遺伝子の変異を持つ変異体はフィトクロム欠損表現型を表示する場合、これは特定された下流の標的遺伝子が異なるフィトクロム調節応答を仲介に関与していることを確認させていただきます。

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Anti-BVR antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>QED Bioscience Inc.</td>
<td>56257-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cellulase &#x201C;Onozuka&#x201D; R-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>SERVA Electrophoresis GmbH, Crescent Chemical Company</td>
<td>MSPC 0930</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gamborg&#x2019;s B5 basal salt mixture</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G5768</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Macerozyme R-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>SERVA Electrophoresis GmbH, Crescent Chemical Company</td>
<td>PTC 001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MES, low moisture content</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>M3671</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Murashige and Skoog salts</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Caisson Laboratories</td>
<td>74904</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phytablend</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Caisson Laboratories</td>
<td>28302</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RNeasy Plant Minikit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>16419</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

investigating tissue- and organ-specific phytochrome responses using facs-assisted cell-type specific expression profiling in arabidopsis thaliana

光を媒介する植物のライフサイクルを通じての発達と適応のプロセスの配列。植物は光受容体が感知し、光に適応するために呼ばれる光吸収分子を利用する。赤色/遠赤色光吸収フィトクロム光受容体が広く研究されている。フィトクロムは、彼らが研究されている、すべての高等植物のシステムで異なると重複する機能を持つ蛋白質の家族として存在<sup&gt; 1</sup&gt;。種子の発芽から開花と老化の範囲フィトクロムを介した光反応は、しばしば特定の植物組織または器官に局在している<sup&gt; 2</sup&gt;。変異の分析を通じて、個々と冗長なフィトクロム機能の発見と解明にもかかわらず、photoperceptionと空間固有のフィトクロム応答を仲介するフィトクロムのローカライズされたプールの分子メカニズムの異なるサイトでの決定的な報告は限られている。我々は、フィトクロムphotoperceptionの特定の部位は組織や光形態形成の臓器特異的な側面、およびそのローカライズされたフィトクロムプールは細胞間のシグナル伝達の下流の標的遺伝子の異なるサブセットを従事を調節することが仮説に基づいて実験を設計した。我々は、選択的臓器、またはトランスジェニック植物内で組織特異的に機能的なフィトクロムを減らすために生化学的アプローチを開発した。我々の研究は、転写活性化因子GAL4による上流活性化配列（UAS）の要素の制御下にある遺伝子の発現のトランスをもたらすことが二部エンハンサートラップのアプローチに基づいています<sup&gt; 3</sup&gt;。ビリベルジン還元酵素（<em&gt; BVR</em&gt; UASの制御下にある）遺伝子は、黙ってUAS - BVRの親のGAL4トランス活性化のない状態で維持されている<sup&gt; 4</sup&gt;。 UAS - BVRトランスジェニックラインとの特異的発現のGAL4 - GFPエンハンサートラップラインの結果との間の遺伝的交雑<em&gt; BVR</emによってマークされた細胞の&gt;遺伝子<em&gt; GFP</em&gt;表現<sup&gt; 4</sup&gt;。フィトクロム発色団欠乏症におけるシロイヌナズナの結果でBVRの蓄積<em&gt;植物体の</em<sup&gt; 5月7日</sup&gt;。従って、我々が生産されていることをトランスジェニック植物は、GAL4 -依存性の活性化を示す<em&gt; BVR</em&gt;フィトクロムの生化学的不活性化で得られた遺伝子だけでなく、GAL4依存<em&gt; GFP</em&gt;表現。の光生物学と分子遺伝学的解析<em&gt; BVR</em&gt;トランスジェニックラインでは、組織とphotoperceptionの対応する部位に関連付けられている臓器特異的なフィトクロムを介する応答への洞察を生み出している<sup&gt; 4、7、8</sup&gt;。 GFP陽性の蛍光活性化細胞選別（FACS）、エンハンサートラップによって誘導される<em&gt; BVR</emマイクロアレイ解析を通じて、細胞型特異的遺伝子発現プロファイリングと相まって&gt;発現植物プロトプラストは、空間的な固有のフィトクロム反応を媒介に関与推定下流の標的遺伝子を同定するために使用されています。この研究は、様々な組織や器官が光によって調節された植物の成長と発展に協力するメカニズム、光覚の部位の我々の理解を拡大し、複雑なフィトクロムを介した細胞間のシグナル伝達カスケードの分子解剖を進めています。

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Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

空間固有のフィトクロム応答の分子基盤は、組織および器官特異的フィトクロムの欠陥を示すトランスジェニック植物を用いて検討されている。マイクロアレイ解析に続いてソート蛍光活性化細胞により誘導されるフィトクロム発色団の枯渇を示す特定の細胞の単離は、空間的な固有のフィトクロム反応に関与する遺伝子を同定するために活用されています。

でFACSアシスト細胞型特異的発現プロファイリングを使用して組織と器官特異フィトクロム応答を調査シロイヌナズナ</em

Light mediates an array of developmental and adaptive processes throughout the life cycle of a plant. Plants utilize light-absorbing molecules called ...

investigating-tissue-organ-specific-phytochrome-responses-using-facs

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

15.7K ビュー.  Michigan State University (MSU). 空間固有のフィトクロム応答の分子基盤は、組織および器官特異的フィトクロムの欠陥を示すトランスジェニック植物を用いて検討されている。マイクロアレイ解析に続いてソート蛍光活性化細胞により誘導されるフィトクロム発色団の枯渇を示す特定の細胞の単離は、空間的な固有のフィトクロム反応に関与する遺伝子を同定するために活用されてい?...

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Floral-dip Transformation of Arabidopsis thaliana to Examine pTSO2::&beta;-glucuronidase Reporter Gene Expression

The ability to introduce foreign genes into an organism is the foundation for modern biology and biotechnology. In the model flowering plant Arabidopsis thaliana, the floral-dip transformation method1-2 has replaced all previous methods because of its simplicity, efficiency, and low cost. Specifically, shoots of young flowering Arabidopsis plants are dipped in a solution of Agrobacterium tumefaciens carrying specific plasmid constructs. After dipping, the plants are returned to normal growth and yield seeds, a small percentage of which are transformed with the foreign gene and can be selected for on medium containing antibiotics. This floral-dip method significantly facilitated Arabidopsis research and contributed greatly to our understanding of plant gene function. In this study, we use the floral-dip method to transform a reporter gene, &beta;-glucuronidase (GUS), under the control of TSO2 promoter. TSO2, coding for the Ribonucleotide Reductase (RNR) small subunit3, is a cell cycle regulated gene essential for dNDP biosynthesis in the S-phase of the cell cycle. Examination of GUS expression in transgenic Arabidopsis seedlings shows that TSO2 is expressed in actively dividing tissues. The reported experimental method and materials can be easily adapted not only for research but also for education at high school and college levels.

Floral-dip Transformation of Arabidopsis thaliana to Examine pTSO2::&#946;-glucuronidase Reporter Gene Expression

This article illustrates the floral-dip method of Agrobacterium tumefaciens -mediated transformation of Arabidopsis thaliana. By introducing a cell-cycle regulated promoter-reporter, pTSO2::&beta;-glucuronidase (GUS), into Arabidopsis, we illustrates how one detects GUS reporter expression in transgenic seedlings.

フローラルディップ変換のシロイヌナズナ調べに pTSO2：：β-グルクロニダーゼレポーター遺伝子発現

The ability to introduce foreign genes into an organism is the foundation for modern biology and biotechnology. In the model flowering plant Arabidopsis ...

生物学

Heterokaryon Technique for Analysis of Cell Type-specific Localization

A significant number of proteins are regulated by subcellular trafficking or nucleocytolasmic shuttling. These proteins display a diverse array of cellular functions including nuclear import/export of RNA and protein, transcriptional regulation, and apoptosis. Interestingly, major cellular reorganizations including cell division, differentiation and transformation, often involve such activities3,4,8,10. The detailed study of these proteins and their respective regulatory mechanisms can be challenging as the stimulation for these localization changes can be elusive, and the movements themselves can be quite dynamic and difficult to track. Studies involving cellular oncogenesis, for example, continue to benefit from understanding pathways and protein activities that differ between normal primary cells and transformed cells6,7,11,12. As many proteins show altered localization during transformation or as a result of transformation, methods to efficiently characterize these proteins and the pathways in which they participate stand to improve the understanding of oncogenesis and open new areas for drug targeting.
Here we present a method for the analysis of protein trafficking and shuttling activity between primary and transformed mammalian cells. This method combines the generation of heterokaryon fusions with fluorescence microscopy to provide a flexible protocol that can be used to detect steady-state or dynamic protein localizations. As shown in Figure 1, two separate cell types are transiently transfected with plasmid constructs bearing a fluoroprotein gene attached to the gene of interest. After expression, the cells are fused using polyethylene glycol, and protein localizations may then be imaged using a variety of methods. The protocol presented here is a fundamental approach to which specialized techniques may be added.

A flexible and efficient method for the characterization of cell type-specific protein localization and nucleocytoplasmic shuttling is described. This heterokaryon approach uses fluorescently-labeled fusion proteins to image protein localizations after cell fusion. The protocol is amenable to steady-state localizations or more dynamic determinations based on live cell imaging.

細胞種特異的局在の解析のためのヘテロカリオンのテクニック

A significant number of proteins are regulated by subcellular trafficking or nucleocytolasmic shuttling.  These proteins display a diverse array of ...

Arabidopsis thaliana Polar Glycerolipid Profiling by Thin Layer Chromatography (TLC) Coupled with Gas-Liquid Chromatography (GLC)

Biological membranes separate cells from the environment. From a single cell to multicellular plants and animals, glycerolipids, such as phosphatidylcholine or phosphatidylethanolamine, form bilayer membranes which act as both boundaries and interfaces for chemical exchange between cells and their surroundings. Unlike animals, plant cells have a special organelle for photosynthesis, the chloroplast. The intricate membrane system of the chloroplast contains unique glycerolipids, namely glycolipids lacking phosphorus: monogalactosyldiacylglycerol (MGDG), digalactosyldiacylglycerol (DGDG), sulfoquinovosyldiacylglycerol (SQDG)4. The roles of these lipids are beyond simply structural. These glycolipids and other glycerolipids were found in the crystal structures of photosystem I and II indicating the involvement of glycerolipids in photosynthesis8,11. During phosphate starvation, DGDG is transferred to extraplastidic membranes to compensate the loss of phospholipids9,12.
Much of our knowledge of the biosynthesis and function of these lipids has been derived from a combination of genetic and biochemical studies with Arabidopsis thaliana14. During these studies, a simple procedure for the analysis of polar lipids has been essential for the screening and analysis of lipid mutants and will be outlined in detail. A leaf lipid extract is first separated by thin layer chromatography (TLC) and glycerolipids are stained reversibly with iodine vapor. The individual lipids are scraped from the TLC plate and converted to fatty acyl methylesters (FAMEs), which are analyzed by gas-liquid chromatography coupled with flame ionization detection (FID-GLC) (Figure 1). This method has been proven to be a reliable tool for mutant screening. For example, the tgd1,2,3,4 endoplasmic reticulum-to-plastid lipid trafficking mutants were discovered based on the accumulation of an abnormal galactoglycerolipid: trigalactosyldiacylglycerol (TGDG) and a decrease in the relative amount of 18:3 (carbons : double bonds) fatty acyl groups in membrane lipids 3,13,18,20. This method is also applicable for determining enzymatic activities of proteins using lipids as substrate6.

Arabidopsis thaliana Polar Glycerolipid Profiling by Thin Layer Chromatography TLC Coupled with Gas-Liquid Chromatography GLC

Composition of polar lipid extracts and the fatty acid composition of individual glycerolipids are determined in a simple and robust lipid profiling experiment. For this purpose, glycerolipids are isolated by thin layer chromatography and subjected to transmethylation of their acyl groups. Fatty acyl methylesters are quantified by gas-liquid chromatography.

気-液クロマトグラフィー（GLC）とあいまって薄層クロマトグラフィー（TLC）によりシロイヌナズナポーラーグリセロ脂質プロファイリング

Biological membranes separate cells from the environment. From a single cell to multicellular plants and animals, glycerolipids, such as ...

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the Arabidopsis leaf is a complex organ made up of many different cell types and several structures. At the same time, the growing leaf contains cells at different stages of development, with the cells furthest from the petiole being the first to stop expanding and undergo senescence1. Different cells within the leaf are therefore dividing, elongating or differentiating; active, stressed or dead; and/or responding to stimuli in sub-sets of their cellular type at any one time. This makes genomic study of the leaf challenging: for example when analyzing expression data from whole leaves, signals from genetic networks operating in distinct cellular response zones or cell types will be confounded, resulting in an inaccurate profile being generated.
To address this, several methods have been described which enable studies of cell specific gene expression. These include laser-capture microdissection (LCM)2 or GFP expressing plants used for protoplast generation and subsequent fluorescence activated cell sorting (FACS)3,4, the recently described INTACT system for nuclear precipitation5 and immunoprecipitation of polysomes6.
FACS has been successfully used for a number of studies, including showing that the cell identity and distance from the root tip had a significant effect on the expression profiles of a large number of genes3,7. FACS of GFP lines have also been used to demonstrate cell-specific transcriptional regulation during root nitrogen responses and lateral root development8, salt stress9 auxin distribution in the root10 and to create a gene expression map of the Arabidopsis shoot apical meristem11. Although FACS has previously been used to sort Arabidopsis leaf derived protoplasts based on autofluorescence12,13, so far the use of FACS on Arabidopsis lines expressing GFP in the leaves has been very limited4. In the following protocol we describe a method for obtaining Arabidopsis leaf protoplasts that are compatible with FACS while minimizing the impact of the protoplast generation regime. We demonstrate the method using the KC464 Arabidopsis line, which express GFP in the adaxial epidermis14, the KC274 line, which express GFP in the vascular tissue14 and the TP382 Arabidopsis line, which express a double GFP construct linked to a nuclear localization signal in the guard cells (data not shown; Figure 2). We are currently using this method to study both cell-type specific expression during development and stress, as well as heterogeneous cell populations at various stages of senescence.

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

A method for producing Arabidopsis leaf protoplasts that are compatible with fluorescence activated cell sorting (FACS), allowing for studies of specific cell populations. This method is compatible with any Arabidopsis line that expresses GFP in a subset of cells.

の細胞特異的な分析<em&gt;シロイヌナズナ</em&gt;蛍光活性化細胞選別を使用した葉

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the ...

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a consequence, the isolation of plant embryos at early stages (1 cell to globular stage) is technically challenging due to their relative inaccessibility. Efficient manual dissection at early stages is strongly impaired by the small size of young Arabidopsis seeds and the adhesiveness of the embryo to the surrounding tissues. Here, we describe a method that allows the efficient isolation of young Arabidopsis embryos, yielding up to 40 embryos in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. Embryos are released into isolation buffer by slightly crushing 250-750 seeds with a plastic pestle in an Eppendorf tube. A glass microcapillary attached to either a standard laboratory pipette (via a rubber tube) or a hydraulically controlled microinjector is used to collect embryos from droplets placed on a multi-well slide on an inverted light microscope. The technical skills required are simple and easily transferable, and the basic setup does not require costly equipment. Collected embryos are suitable for a variety of downstream applications such as RT-PCR, RNA sequencing, DNA methylation analyses, fluorescence in situ hybridization (FISH), immunostaining, and reporter gene assays.

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

We report an efficient and simple method to isolate embryos at early stages of development from Arabidopsis thaliana seeds. Up to 40 embryos can be isolated in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. The procedure is suitable for transcriptome, DNA methylation, reporter gene expression, immunostaining and fluorescence in situ hybridization analyses.

から初期段階の胚の効率的かつ迅速な単離<em&gt;シロイヌナズナ</em&gt;種子

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a ...

Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements

Arabidopsis thaliana is a model organism commonly used to understand and manipulate various cellular processes in plants, and it has been used extensively in the study of secondary cell wall formation. Secondary cell wall deposition occurs after the primary cell wall is laid down, a process carried out exclusively by specialized cells such as those forming vessel and fiber tissues. Most secondary cell walls are composed of cellulose (40&#8211;50%), hemicellulose (25&#8211;30%), and lignin (20&#8211;30%). Several mutations affecting secondary cell wall biosynthesis have been isolated, and the corresponding mutants may or may not exhibit obvious biochemical composition changes or visual phenotypes since these mutations could be masked by compensatory responses. Staining procedures have historically been used to show differences on a cellular basis. These methods are exclusively visual means of analysis; nevertheless their role in rapid and critical analysis is of great importance. Congo red and calcofluor white are stains used to detect polysaccharides, whereas M&#228;ule and phloroglucinol are commonly used to determine differences in lignin, and toluidine blue O is used to differentially stain polysaccharides and lignin. The seemingly simple techniques of sectioning, staining, and imaging can be a challenge for beginners. Starting with sample preparation using the A. thaliana model, this study details the protocols of a variety of staining methodologies that can be easily implemented for observation of cell and tissue organization in secondary cell walls of plants.

Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements

Plant cell wall composition varies between tissue types and can include lignin, cellulose, hemicelluloses, and pectin. Various staining techniques have been developed to visualize differences at the cell-type level. This paper is a compilation of commonly used cell wall staining techniques.

の組織化学的染色<em&gt;シロイヌナズナ</em&gt;二次細胞壁の要素

Arabidopsis thaliana is a model organism commonly used to understand and manipulate various cellular processes in plants, and it has been used extensively ...

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix containing polysaccharides that include cellulose microfibrils that form both crystalline structures and cellulose chains of amorphous organization. The orientation of the cellulose fibers and their concentrations dictate the mechanical properties of the cell. Several methods are used to determine the levels of crystalline cellulose, each bringing both advantages and limitations. Some can distinguish the proportion of crystalline regions within the total cellulose. However, they are limited to whole-organ analyses that are deficient in spatiotemporal information. Others relying on live imaging, are limited by the use of imprecise dyes. Here, we report a sensitive polarized light-based system for specific quantification of relative light retardance, representing crystalline cellulose accumulation in cross sections of Arabidopsis thaliana roots. In this method, the cellular resolution and anatomical data are maintained, enabling direct comparisons between the different tissues composing the growing root. This approach opens a new analytical dimension, shedding light on the link between cell wall composition, cellular behavior and whole-organ growth.

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Crystalline cellulose is an important constituent of the plant cell wall. However, its quantification at a cellular resolution is technically challenging. Here, we report the use of polarized light technology and root cross sections to obtain information of cell wall composition at a spatiotemporal resolution.

結晶セルロース蓄積中の高解像度の定量化<em&gt;シロイヌナズナ</em&gt;ルーツは、組織特異的な細胞壁の変更を監視します

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix ...

Analysis of Arabidopsis thaliana Growth Behavior in Different Light Qualities

Plant biologists often need to observe the growth behavior of their chosen species. To this end, the plants need constant environmental and stable light conditions, which are preferably variable in quantity and quality so that studies under different setups can be conducted. These requirements are met by climatic chambers featuring light emitting diodes (LED) lights, which can &#8211; in contrast to fluorescent lights &#8211; be set to different wavelengths. LEDs are energy conserving and emit virtually no heat even at light intensities, which often constitutes a problem with other light sources. The presented protocol provides a step-by-step guidance of how to program a climatic chamber equipped with variable LED lights as well as describing several approaches for in depth analysis of growth phenotypes. Depending on the experimental set-up various characteristics of the growing plants can be observed and analyzed. Here we describe how to determine fresh weight, leaf area, photosynthetic activity, and stomatal density. We demonstrate that in order to obtain reliable data and draw valid conclusions it is mandatory to use a sufficient number of individuals for statistical evaluation. Taking too few plants for this kind of analysis results in high statistical errors and consequently in less clear interpretations of the data.

Analysis of Arabidopsis thaliana Growth Behavior in Different Light Qualities

Here, we present a protocol for studying plant growth behavior and especially phenotypes in a reproducible manner. We show how to provide variable and at the same time stable light conditions. Proper analyses depend on sufficient sample numbers and valid statistical evaluations.

異なる光質におけるシロイヌナズナ成長挙動の解析

Plant biologists often need to observe the growth behavior of their chosen species. To this end, the plants need constant environmental and stable light ...

TChIP-Seq: Cell-Type-Specific Epigenome Profiling

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological functions have been extensively studied. Indeed, the advent of next-generation deep sequencing and chromatin immunoprecipitation (ChIP) via specific histone modification antibodies has revolutionized our view of epigenetic regulation across the genome. Conversely, tissues typically consist of diverse cell types, and their complex mixture poses analytic challenges to investigating the epigenome in a particular cell type. To address the cell type-specific chromatin state in a genome-wide manner, we recently developed tandem chromatin immunoprecipitation sequencing (tChIP-Seq), which is based on the selective purification of chromatin by tagged core histone proteins from cell types of interest, followed by ChIP-Seq. The goal of this protocol is the introduction of best practices of tChIP-Seq. This technique provides a versatile tool for tissue-specific epigenome investigation in diverse histone modifications and model organisms.

We describe a step-by-step protocol for tandem chromatin immunoprecipitation sequencing (tChIP-Seq) that enables the analysis of cell-type-specific genome-wide histone modification.

TChIP-Seq: 細胞型特異エピゲノムのプロファイリング

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological ...

Cell Type-specific Gene Expression Profiling in the Mouse Liver

Liver repopulation after injury is a crucial feature of mammals which prevents immediate organ failure and death after exposure of environmental toxins. A deeper understanding of the changes in gene expression that occur during repopulation could help identify therapeutic targets to promote the restoration of liver function in the setting of injuries. Nonetheless, methods to isolate specifically the repopulating hepatocytes are inhibited by a lack of cell markers, limited cell numbers, and the fragility of these cells. The development of translating ribosome affinity purification (TRAP) technology in conjunction with the Fah-/- mouse model to recapitulate repopulation in the setting of liver injury allows gene expression profiling of the repopulating hepatocytes. With TRAP, cell type-specific translating mRNA is rapidly and efficiently isolated. We developed a method that utilizes TRAP with affinity-based isolation of translating mRNA from hepatocytes that selectively express the green fluorescent protein (GFP)-tagged ribosomal protein (RP), GFP:RPL10A. TRAP circumvents the long time period required for fluorescence-activated cell sorting that could change the gene expression profile. Furthermore, since only the repopulating hepatocytes express the GFP:RPL10A fusion protein, the isolated mRNA is devoid of contamination from the surrounding injured hepatocytes and other cell types in the liver. The affinity-purified mRNA is of high quality and allows downstream PCR- or high-throughput sequencing-based analysis of gene expression.

Translating ribosome affinity purification (TRAP) enables rapid and efficient isolation of cell type-specific translating mRNA. Here, we demonstrate a method that combines hydrodynamic tail-vein injection in a mouse model of liver repopulation and TRAP to examine the expression profile of repopulating hepatocytes.

マウス肝臓における細胞型特異的遺伝子発現プロファイリング

Liver repopulation after injury is a crucial feature of mammals which prevents immediate organ failure and death after exposure of environmental toxins. A ...

でFACSアシスト細胞型特異的発現プロファイリングを使用して組織と器官特異フィトクロム応答を調査シロイヌナズナ

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フローラルディップ変換のシロイヌナズナ調べに pTSO2：：β-グルクロニダーゼレポーター遺伝子発現

細胞種特異的局在の解析のためのヘテロカリオンのテクニック

気-液クロマトグラフィー（GLC）とあいまって薄層クロマトグラフィー（TLC）によりシロイヌナズナポーラーグリセロ脂質プロファイリング

の細胞特異的な分析

から初期段階の胚の効率的かつ迅速な単離

の組織化学的染色

結晶セルロース蓄積中の高解像度の定量化

異なる光質におけるシロイヌナズナ成長挙動の解析

TChIP-Seq: 細胞型特異エピゲノムのプロファイリング

マウス肝臓における細胞型特異的遺伝子発現プロファイリング