HIV-1 מחקרים uncoating במעבדה אייקן נתמכו על ידי NIH מענקים AI40364, AI50423 ו AI076121. חומרים מרכזיים, כולל חומרים כימיים המשמשים את ELISA p24, סופקו על ידי איידס NIH מחקר תוכנית הפניה, אגף איידס, NIAID, NIH.

1. הפקה של HIV-1 חלקיקים לפני שתמשיך, אתה חייב לקבל אישור ובצע את ההנחיות ממשרד biosafety של המוסד שלך לעבוד במתקן biosafety אישר ל-HIV זיהומיות. עליך להבטיח כי טיפול נאות אמצעי בטיחות הם אחריו במהלך העבודה במעבדה biosafety. הפקה של HIV-1 החלקיקים מתבצע בדרך כלל על ידי transfection חולף של תאים 293T עם DNA-HIV-1 proviral בעזרת סידן פוספט transfection השיטה 7, 8. כייל הנגיף גבוהה במניות גדל בתרבות של תאים T נגועים גם הם מתאימים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 293T התרבות התאים השתנה Dulbecco הנשר בינוני (DMEM) המכיל 10% בסרום שור עוברית (FBS) שיושלם עם אנטיביוטיקה [פניצילין (100 IU / ml) וסטרפטומיצין (100 מיקרוגרם / מ&quot;ל)], בעמ &#39;37 ° C, CO 5% 2 . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוק תאים מנות כמעט ומחוברות באמצעות 0.25% טריפסין-EDTA וזרעי 2x10 6 </sעד&gt; 9 תאים מ&quot;ל לכל צלחת 100 מ&quot;מ תרבות יום לפני transfection. Six Seed 100 מ&quot;מ תרבות מנות לייצור virions. אם הכנה מרוכזת של ליבות נדרש, מנות יותר יכול להיות seeded עבור transfection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום הבא, monolayers התא צריך להיות בערך 25% ומחוברות ומוכן transfection. במשך שש מנות של תאים להיות transfected, להביא 120 מיקרוגרם של ה-DNA proviral עד נפח של 2.7 מ&quot;ל עם מים סטריליים. לתערובת זו להוסיף 0.3 מ&quot;ל של 2.5 מ &#39;CaCl 2 ו - 3 מ&quot;ל של 2XBBS, ומערבבים היטב על ידי pipetting למעלה ולמטה מספר פעמים. אפשר לתערובת לעמוד בטמפרטורת החדר למשך 10-20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ&quot;ל של dropwise את התערובת וכתוצאה מכך למרכז של כל מנה מתערבל תוך כדי לערבב בעדינות. מניחים את הכלים הלילה (~ 16 שעות) בקבוצת באינקובטור ב 35 ° C ו 3% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את המדיום תרבות בעדינות להוסיף 5 מ&quot;ל PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב PBS ולהוסיף 5 מ&quot;ל של מדיום חדש. התרבות התאים החממה ב 37 &amp;מעלות: C ו 5% CO 2 עבור 24-48 שעות נוספות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף את supernatant תרבות המכילה חלקיקים נגיפיים, להעביר אותו צינור מ&quot;ל 50 צנטריפוגות חרוטי. מערבבים את supernatants מן המנות כל צנטריפוגה XG ב 1500 עבור 5 דקות לתאי גלולה ופסולת. סינון באמצעות supernatant 0.45 נקבוביות בגודל מיקרומטר מסננים מזרק. אמצעי זהירות יש לנקוט כדי לצמצם את היווצרות תרסיס תוך כדי עבודה עם נגיף חי. זה כולל את השימוש של צינורות בצורת חרוט עם טבעות אטימה או מכסה דלי הרוטור במהלך השלב צנטריפוגה. אם זה לא אפשרי, כובעים את הבורג של צינורות צריך להיות עטוף parafilm. </li></ol> 2. ריכוז של HIV-1 virions ידי ultracentrifugation <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את supernatant תרבות (30 מ&quot;ל) ב צינור 38.5 polyallomer צנטריפוגות מ&quot;ל (עבור רוטור SW32Ti Beckman או שווה ערך). בעדינות ביסוד supernatant וירוס עם פתרון המכיל 5 מ&quot;ל סוכרוז 20% PBS באמצעות pipet 5 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה במשך 3 שעות32,000 סל&quot;ד ב 4 ° C (175,000 XG ב r מקסימום) לחלקיקים גלולה וירוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר supernatant על ידי שאיפה, נזהרת שלא להפריע את הכדור בחלק התחתון של הצינור. הוסף 0.5 מ&quot;ל של 1XSTE חיץ (10 mM טריס-HCl [pH 7.4], 100 mM NaCl, 1 mM EDTA) אל הצינור מקום 4 ° C למשך שעה 1 כדי לשחרר את גלולה. שימוש רחב בקוטר 1 pipet קצה מ&quot;ל pipet בעדינות מעלה ומטה כמה פעמים לנתק את הכדור מהחלק התחתון של הצינור. לאחר מכן, להעביר את גלולה התיר את צינור 1.5 microcentrifuge מ&quot;ל, לטפל כדי למנוע הקצפה. דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך 1-3 שעות כדי לאפשר גושים קטנים של הווירוס להתפזר. במהלך תקופה זו, להכין את שיפוע סוכרוז כפי שמתואר בשלב 3.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות pipet ההשעיה וירוס מעלה ומטה מספר פעמים צנטריפוגות ב 8000 סל&quot;ד (6,000 XG) בשעה 4 מעלות צלזיוס microfuge בקירור דקות 1 כדי להסיר גושים שיורית. שמור על קור המדגם במהלך תהליך זה. </li></ol> 3. סוכרוז שיפועצנטריפוגה כדי לבודד ליבות HIV-1 ליבות מבודדים באמצעות &quot;ספין-thru&quot; שיטת 9 המהווה שינוי של השיטה המתוארת לעיל לטיהור של HIV-2 ליבות 10. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 12 מ&quot;ל שיפוע ליניארי 30% עד 70% סוכרוז במאגר 1XSTE בתוך צינור 14.5 polyallomer צנטריפוגות מ&quot;ל עבור SW32.1Ti הרוטור. כדי להכין את שיפוע, להשתמש שיפוע 20 מ&quot;ל לשעבר: מקום 6 מ&quot;ל של תמיסת סוכרוז 70% בצד הקרוב (קרוב ליציאת לשקע) ו 6 מ&quot;ל של תמיסת סוכרוז 30% בצד הרחוק. ודא כי בועות אוויר לא לכודים ערוץ המחבר את שני חדרים. השתמש Densi-Flow אוטומטי הדרגתי לשעבר המשאבה הדרגתי מלמטה למעלה של שפופרת המכילה 1 מ&quot;ל של תמיסת סוכרוז 85% בתחתית. בעדינות במקום שיפוע ב 4 ° C עד מקורר (2-4 שעות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש רחב בקוטר 1 pipet קצה מ&quot;ל בעדינות שכבת צבע עם 0.25 מ&quot;ל של תמיסת סוכרוז 15% STE המכיל 1% טריטון X-100. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות את שכבת עם 0.25 מ&quot;ל של תמיסת סוכרוז 7.5% ב STE שימוש רחב לשעמם 1 pipet קצה מ&quot;ל. היזהרו שלא לערבב את השכבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות עם כיסוי ההשעיה 0.5 מ&quot;ל וירוס משלב 2.4. צעד זה צריך להתבצע בזהירות, כדי למנוע כל הפרעה השיפוע ערבוב של שכבות סוכרוז מודגשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את צינורות בדלי SW32.1Ti מראש מקורר צנטריפוגות ב 32,000 סל&quot;ד (187,000 XG ב r מקסימום) למשך הלילה (16-20 שעות) בשעה 4 ° C. כדי למנוע הפסקה של צנטריפוגות, אל תתחיל צנטריפוגה עד ואקום בצנטריפוגה מגיע 250 מיקרומטר </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף שברים 1 מ&quot;ל מלמעלה למטה של ​​שיפוע באמצעות fractionator אוטומטי Densi-Flow הדרגתי. מניחים את הצינורות על קרח מיד עם האוסף. מערבבים את התוכן של הצינורות על ידי כמה פעמים היפוך, ולסגת 50 μl של חלק עבור כל כימות של ELISA או assay להפוך פעילות transcriptase. </li></ol> 4. לוקליזציה של HIV-1 ליבותואחסון של ליבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני ביצוע מבחני uncoating, חשוב כדי לקבוע אילו שברים שלמים המכילים HIV-1 ליבות. זה יכול להיקבע על ידי ELISA p24 או transcriptase הפוכה פעילות assay באמצעות 50 aliquots μl משלב 3.6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ההתאוששות של CA הקשורים ליבות קשורה לעתים קרובות ליציבות של גרעינים. מדד הליבה הקשורים CA על ידי ELISA p24 9 באמצעות מדגם של כל חלק. לחלופין, למדוד את פעילות transcriptase הפוכה של כל חלק. באמצעות שתי השיטות השיא צריך להיות סביב חלק 10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בריכת שברים המכיל ליבות. אם ליבות אינם לשמש uncoating assay מיד, aliquot ליבות אספו לתוך 0.2-0.3 aliquots מ&quot;ל, פלאש הקפאת N2 נוזלי חנות ב -80 ° C. גרעינים קפואים בדרך זו מתאימים assay uncoating. התשואה של CA הליבה הקשורים הוא בדרך כלל 1-2 מיקרוגרם למיליליטר של לכל p24 או כ -15% מכלל virion הקשוריםp24. </li></ol> 5. Assay קינטי של uncoating-HIV-1 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסכום של HIV-1 ליבות הנדרש לכל תגובה uncoating הוא כ 50 ננוגרם. כדי לבצע את assay ב uncoating חוץ גופית, predilute aliquot של ליבות עם נפח שווה של חיץ 1XSTE קר כדי להפחית את הצמיגות של ההשעיה כדי למזער שגיאות pipetting. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בנוסף לדלל 100 μl של ליבות לתוך מ&quot;ל של 0.15 חיץ 1XSTE קר המכיל 10 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​BSA ב צינור microcentrifuge 1.5 מ&quot;ל. אנחנו משלימים את המאגר STE עם BSA (10 מיקרוגרם / מ&quot;ל) כדי למזער את ספיחה של CA על הקירות של הצינור. מערבבים על ידי פעמים את הצינור היפוך מספר. אל המערבולת דגימות. דגירה הצינורות באמבט מים 37 מעלות במרווחים מתוזמנים (15, 30, 60 ו 120 דקות). צינורות צריך להיות שקוע באמבט מים לפחות עד לרמה של המדגם פנימי על מנת להבטיח אפילו התחממות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך הדגירה, לערבב בעדינות את תוכן הצינור מעת לעת (בדרך כלל 5 -10 דק &#39;) על ידי מצליף את הצינורית. לשליטה דקה אפס, לדלל 100 μl של ליבות לתוך מ&quot;ל של 0.15 חיץ 1XSTE קר לדגור על הקרח לכל אורך הניסוי (120 דקות). השליטה דקה אפס נותן את הערך uncoating הבסיס, משמש לקביעת עליית uncoating ליבות מודגרות ב 37 מעלות במרווחים בעיתוי שונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתום תקופת הדגירה, לעצור את תהליך uncoating ידי הנחת צינורות קרח למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה צינורות ב 45,000 סל&quot;ד (רוטור TLA-55: 125,000 XG ב r מקסימום) במשך 20 דקות 4 ° C. זו תהיה גלולה ליבות שלם CA חינם שוחרר כתוצאה uncoating ליבות יישאר supernatant. הרוטור צריך להיות precooled ב 4 ° C לפני העמסת דגימות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את supernatant חדשים צינורות microfuge precooled רצוי בעזרת ג&#39;ל טעינת טיפים המאוחסן בטמפרטורת החדר. שים לב גלולה לא יהיה גלוי לעין, כך לטפל w קיצונייםבשעה שהייתי pipetting את supernatant. Resuspend את כדורי ב 250 μl של diluent מדגם ELISA (0.5% טריטון X-100 ו - 5% התורם עגל בסרום PBS). כדי להבטיח פיזור יעיל של גלולה, מערבולת לאחר הוספת diluent מדגם ELISA. לכמת את התוכן CA של גלולה ו supernatant באמצעות ELISA p24 כפי שמתואר בסעיף הבא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היקף uncoating מתקבל על ידי חישוב החלק היחסי של CA נוכח supernatant. </li></ol> 6. Assay עבור CA על ידי ELISA p24 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רבים ערכות ELISA מסחרי זמינים וניתן להשתמש בו כדי לכמת CA. כל שימוש מסחרי או &quot;בתוך הבית&quot; ELISA וכוללים סטנדרטים p24 כדי לקבוע את הליניאריות של assay. דילולים של דגימות צריך להיות assayed כדי להבטיח דיוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיתחנו ELISA תוצרת בית שבו אנו משתמשים באופן שגרתי כדי assay עבור CA. ההליך מותאם מדוח הקודם 11 ו מבוצע באמצעות גלאי ללכוד נוגדנים זמין מתרומת זרע NIHS מחקר מגיב תוכנית הפניה. </li></ol> 7. נציג תוצאות: דוגמה מכך מן ELISA לקביעת שברים המכיל ליבה מוצג באיור 1. לאחר איסוף שברים (1 מ&quot;ל כל אחד), 50 μl של כל חלק מן המדגם היה להשתמש בו כדי להפוך דילולים סדרתי ונותחו על ידי ELISA. P24 הכולל מתקבל על ידי הוספת ערכים במשך שתים עשרה שברים היה 14.5 מיקרוגרם. כפי שמוצג שברים דמות 8-10 ליבות הכיל. הערך p24 עבור הליבה המכילים שברים היה 2.17 מיקרוגרם. האחוז של הליבה הקשורים p24 (14.97%) נקבע על ידי לקיחת היחס בין ערך p24 עבור שברים הליבה (2.17 מיקרוגרם) לערך p24 הכולל (14.5 מיקרוגרם). חלק 1 או 2 תמיד מכילים כמות גבוהה של p24, זה מייצג CA חינם אשר אינו משויך ליבות. זה ואחריו הפחתה הדרגתית של ערכי p24 עם חלק אחד לאחר מכן, ולאחר מכן עלייה חדה ולבסוף ירידה חדה p24הערכים. אם טיפול נאות הוא נלקח בעת טעינת שיפוע אז בשיא הליבה הקשורים CA נמצא סביב חלק 10. תוצאה אופיינית מתקבל על ידי assaying את הקינטיקה של uncoating של HIV-1 ליבות מוצג באיור 2. הגרף מראה גידול תלוי זמן ב uncoating של wild-type HIV-1 ליבות. אחוז uncoating ערך הושג על ידי חישוב שבריר של CA נוכח supernatant. בעזרת תרגול, assay הוא לשעתקו מאוד שימושי לקביעת יציבות ליבות ויראלי במבחנה. יש לציין כי שחזור של assay תלויה מאוד בטיפול נאות של הדגימות במהלך ההליך. מאז ליבות הם חום יציב, הדגימות יש לשמור על 4 מעלות צלזיוס במשך assay למעט בתקופת הדגירה. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3384/3384fig1.jpg" /> איור 1 צפיפות שיווי משקל הדרגתי של צנטריפוגהHIV-1 ליבות. ההשעיה וירוס מרוכז היה מוחל על החלק העליון של מדרון 30-70% סוכרוז ליניארי ועליהן 1% Triton-X-100. לאחר צנטריפוגה ולינה XG 187,000 ו 4 ° C, 1 שברים מ&quot;ל נאספו מלמעלה (שבר 1) לתחתית (שבר 12) ו - p24 היה לכמת ידי ELISA. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3384/3384fig2.jpg" /> איור 2 כמובן זמן של uncoating HIV-1 במבחנה. מטוהרים HIV-1 ליבות היו בדילול וטופחו על 37 מעלות צלזיוס במשך מרווחי הזמן המצוין. המדגם דקות אפס הודגר על הקרח לכל אורך הניסוי. לאחר דגירה, דגימות היו ultracentrifuged ב XG 125,000 למשך 20 דקות ב 4 ° C. Supernatant וכדוריות הופרדו ונותחו על ידי ELISA p24. היקף uncoating נקבע כמתואר בטקסט פרוטוקול. התגובה של כל uncoating בוצעה לשכפל, ברים שגיאה תוחלת בטווח של שני ערכים.

<ol>
	<li>Ganser, B. K., Li, S., Klishko, V. Y., Finch, J. T., Sundquist, W. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+and+analysis+of+conical+models+for+the+HIV-1+core.">Assembly and analysis of conical models for the HIV-1 core.</a> Science. 283, 80-83 (1999).</li><li>Li, S., Hill, C. P., Sundquist, W. I., Finch, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+reconstructions+of+helical+assemblies+of+the+HIV-1+CA+protein.">Image reconstructions of helical assemblies of the HIV-1 CA protein.</a> Nature. 407, 409-413 (2000).</li><li>Aiken, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+and+cellular+factors+that+regulate+HIV-1+uncoating.">Viral and cellular factors that regulate HIV-1 uncoating.</a> Curr. Opin. HIV. AIDS. 1, 194-199 (2006).</li><li>Forshey, B. M., Schwedler, U. v. o. n., Sundquist, W. I., Aiken, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+a+human+immunodeficiency+virus+type+1+core+of+optimal+stability+is+crucial+for+viral+replication.">Formation of a human immunodeficiency virus type 1 core of optimal stability is crucial for viral replication.</a> J. Virol. 76, 5667-5677 (2002).</li><li>Forshey, B. M., Aiken, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disassembly+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+cores+in+vitro+reveals+association+of+Nef+with+the+subviral+ribonucleoprotein+complex.">Disassembly of human immunodeficiency virus type 1 cores in vitro reveals association of Nef with the subviral ribonucleoprotein complex.</a> J. Virol. 77, 4409-4414 (2003).</li><li>Wacharapornin, P., Lauhakirti, D., Auewarakul, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+capsid+mutations+on+HIV-1+uncoating.">The effect of capsid mutations on HIV-1 uncoating.</a> Virology. 358, 48-54 (2007).</li><li>Chen, C., Okayama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+transformation+of+mammalian+cells+by+plasmid+DNA.">High-efficiency transformation of mammalian cells by plasmid DNA.</a> Mol Cell Biol. 7, 2745-2752 (1987).</li><li>Aiken, C., Prasad, V. R., Ganjam, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Molecular Biology. 485, 41-53 (2009).</li><li>Kotov, A., Zhou, J., Flicker, P., Aiken, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+Nef+with+the+human+immunodeficiency+virus+type+1+core.">Association of Nef with the human immunodeficiency virus type 1 core.</a> J. Virol. 73, 8824-8830 (1999).</li><li>Kewalramani, V. N., Emerman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vpx+association+with+mature+core+structures+of+HIV-2.">Vpx association with mature core structures of HIV-2.</a> Virology. 218, 159-168 (1996).</li><li>Wehrly, K., Chesebro, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p24+antigen+capture+assay+for+quantification+of+human+immunodeficiency+virus+using+readily+available+inexpensive+reagents.">p24 antigen capture assay for quantification of human immunodeficiency virus using readily available inexpensive reagents.</a> Methods. 12, 288-293 (1997).</li><li>Welker, R., Hohenberg, H., Tessmer, U., Huckhagel, C., Kr&#228;usslich, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+and+structural+analysis+of+isolated+mature+cores+of+human+immunodeficiency+virus+type+1.">Biochemical and structural analysis of isolated mature cores of human immunodeficiency virus type 1.</a> J. Virol. 74, 1168-1177 (2000).</li><li>Briggs, J. A., Wilk, T., Welker, R., Kr&#228;usslich, H. G., Fuller, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+organization+of+authentic,+mature+HIV-1+virions+and+cores.">Structural organization of authentic, mature HIV-1 virions and cores.</a> EMBO J. 22, 1707-1715 (2003).</li><li>Auewarakul, P., Wacharapornin, P., Srichatrapimuk, S., Chutipongtanate, S., Puthavathana, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncoating+of+HIV-1+requires+cellular+activation.">Uncoating of HIV-1 requires cellular activation.</a> Virology. 337, 93-101 (2005).</li><li>Accola, M. A., Ohagen, A., G&#246;ttlinger, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+cores:+retention+of+Vpr+in+the+absence+of+p6(gag.">Isolation of human immunodeficiency virus type 1 cores: retention of Vpr in the absence of p6(gag.</a> J. Virol. 74, 6198-6202 (2000).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

השיטה המתוארת כאן כדי לטהר HIV-1 ליבות ללמוד uncoating במבחנה שימושי ללמוד את השלב הזה של מחזור HIV-1 החיים, בעיקר בשל חוסר זמינות של שיטה לנתח תוקף HIV-1 uncoating בתאי המטרה. אמנם שיטה זו משתמשת ultracentrifugation שיווי משקל לטהר ליבות, אחרים השתמשו pelleting ישיר לאחר תמוגה קצרה עם 1% טריטון X-100-12, 13 או pelleting באמצעות כרית סוכרוז ועליהן 0.1% טריטון X-100-14, 15. ההתאוששות של ליבות שהושגו בשיטה זו כפופה וריאציה ניסיוני. משתנה ההצלחה של פרוטוקול זה הוא יעילות transfection. בדרך כלל אנו לטעון כמות של הנגיף שווה ערך ל מיקרוגרם לפחות 7 של p24 על השיפוע. המעבדה שלנו משתמשת סידן פוספט transfection שיטה לייצור וירוס. בעוד שיטות transfection אחרים עשויים גם להיות מתאים, אנחנו לא העריכו אותם לבידוד של ליבות. Var חשובים נוספיםiables המשפיעים על התשואה הליבה הטיפול נלקח ביישום שכבות הדרגתי ובהתאם דגימות הקרה. בזהירות רבה יש לנקוט בעת הכנת הדרגתיים סוכרוז, כדי למנוע ערבוב של שיפוע. כל הפרעה תוך יישום ההשעיה וירוס מרוכז עלול להוביל מגע רצויים מוקדם של virions עם חומר ניקוי מתחת לשכבת סוכרוז מכשול; במגע ממושך כזה עלול להתפרק ליבות שברירי להוביל מופחת capsid העמותה. כמו כן, חשוב לא פחות לשמור על צפיפות סוכרוז שיפוע והקור ההשעיה וירוס לאורך ההליך. הנוהל כבר שולט בשימוש בהצלחה על ידי מדענים שונים במעבדה שלנו. HIV-1 ליבות הם חום יציב 4, ולכן חשוב מאוד הדרגתי סוכרוז fractionate כאשר הוא קר למקום שברים שנאספו באופן מיידי על הקרח. מאז uncoating ליבות תלוי גם pH וריכוז מלח למאגר4, מומלץ מאוד למדוד את pH של חיץ STE לפני שתמשיך assay. שיעור uncoating עשוי להשתנות מעט עם כל אצווה של ליבות. תגובות Uncoating צריכה להתבצע בשני עותקים, ואם ערכים שונים על ידי יותר מ -15%, אז את התגובות צריך להתבצע בשלושה עותקים עד עקביות מושגת. חלבון חינם CA יש נטייה להיצמד לקירות הפנימיים של הצינורות, ולכן קיים הכרח לכלול BSA בריכוז סופי של 10 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​בתערובת התגובה למזער ספיחה של CA על הקירות של החצוצרות. כאמור, assay uncoating המתואר כאן יכול לשמש כדי לזהות המחקר גורמים המשפיעים uncoating הסלולר. היא עשויה גם לשמש כדי לחקור את ההשפעה של תרכובות מיקוד capsid וגורמים הסלולר על שעתוק הפוך ליבות באמצעות assay אנדוגני שעתוק לאחור. בידוד של HIV-1 ליבות בכמויות מספיקות עשוי גם לאפשר ניתוחהאינטראקציות של capsid עם גורמים הסלולר על ידי מיקרוסקופית אלקטרונים immunogold.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td width="190"> שם מגיב </td><td width="197"> חברה </td><td width="114"> מספר קטלוג </td><td width="161"> הערות (אופציונלי) </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Cellgro </td><td> 10-013-CV </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> Cellgro </td><td> 21-031-CV </td><td></td></tr><tr><td> Triton-X-100 </td><td> Mallinckrodt בייקר Inc </td><td> 9002-93-1 </td><td></td></tr><tr><td> Tween 20 </td><td> Acros </td><td> 9005-64-5 </td><td></td></tr><tr><td> 0.25% טריפסין-EDTA </td><td> Cellgro </td><td> 25-053-CI </td><td></td></tr><tr><td> 2XBBS </td><td></td><td></td><td> הרכב: 50mm BES [p H 6.95], 280 mM NaCl ו - 1.5 mM Na 2 HPO 4. התאם את ה-pH 6.95בטמפרטורת החדר. סנן לעקר &amp; חנות aliquots ב -20 ° C. </td></tr><tr><td> נוגדן ציפוי: נוגדן חד שבטי כדי p24 (183-H12-5C) </td><td> NIH האיידס מחקר תוכנית הפניה מגיב </td><td> 3537 </td><td></td></tr><tr><td> הנוגדן העיקרי: HIV-איג (המטופל hyperimmune בסרום אדם) </td><td> NIH מחקר האיידס ו מגיב הפניה תוכנית </td><td> 3957 </td><td></td></tr><tr><td> משני הנוגדנים: אנטי אנושי עיזים IgG, peroxidase מצומדות </td><td> לנקב </td><td> 31130 </td><td></td></tr><tr><td> HRP המצע </td><td> KPL Inc </td><td> 50-76-11 </td><td></td></tr><tr><td> Immulon 2HB 96 צלחות טוב </td><td> Thermo Scientific </td><td> 3455 </td><td></td></tr><tr><td> SW32Ti ו SW32.1 הרוטורים טי ו ultracentrifuge תואם </td> &lt;td&gt; Beckman Coulter </td><td></td><td></td></tr><tr><td> TLA-55 הרוטור ultracentrifuge השולחן </td><td> Beckman Coulter </td><td></td><td></td></tr><tr><td> מהירות גבוהה microfuge צינורות </td><td> Beckman Coulter </td><td> 326823, 358123, 357448 </td><td></td></tr><tr><td> Auto-Densi צפיפות זרם שיפוע fractionator </td><td> Labconco קורפ </td><td> 4517000 </td><td></td></tr><tr><td> צבע לשעבר </td><td> הלשכה המרכזית לסטטיסטיקה מדעי ושות בע&quot;מ </td><td> GM-20 </td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro uncoating of hiv-1 cores

הגנום של רטרווירוסים הוא עטוף capsid מוקף במעטפת השומנים. עבור lentiviruses, כגון HIV-1, הקליפה חרוטי capsid מורכב החלבון CA מסודרים כמו סריג של משושה. Capsid סגור על ידי 7 pentamers בסוף רחב 5 בקצה הצר של חרוט 1, 2. עטוף במעטפת זו capsid הוא מורכב ribonucleoprotein ויראלי, ויחד הם מהווים את הליבה. בעקבות איחוי של קרום ויראלי עם קרום התא היעד, HIV-1 הוא שוחרר לתוך הציטופלסמה. Capsid אז מפרק שחרור CA חינם בצורה מסיסה 3 בתהליך המכונה uncoating. המיקום והעיתוי תאיים של uncoating-HIV-1 הם הבינו היטב. חומצה אמינית בודדת החלפות ב-CA אשר משנים את יציבות capsid גם לפגוע ביכולת של HIV-1 להדביק תאים 4. זה מצביע על יציבות capsid הוא קריטי עבור הידבקות ב-HIV-1. </p&gt; HIV-1 uncoating כבר קשה ללמוד בשל היעדר זמינות של מבחני רגיש ואמין עבור תהליך זה. כאן אנו מתארים שיטה כמותית ללימוד uncoating במבחנה באמצעות ליבות מבודד HIV-1 חלקיקים זיהומיות. גישה כוללת הבידוד של ליבות על ידי שקיעה של virions מרוכזת באמצעות שכבה של חומר הניקוי לתוך מפל סוכרוז ליניארי, בקור. כדי לכמת uncoating, גרעינים המבודד מודגרת ב 37 מעלות במרווחים מתוזמנים שונים pelleted לאחר מכן על ידי ultracentrifugation. היקף uncoating מנותח על ידי לכימות שבריר של CA ב supernatant. גישה זו כבר מועסק על מנת לנתח את ההשפעות של מוטציות ויראליות על יציבות HIV-1 capsid 4, 5, 6. זה צריך להיות שימושית גם עבור לומד את התפקיד של גורמים הסלולר uncoating-HIV-1.

Watch this Scientific Journal Video about In vitro Uncoating of HIV-1 Cores at JoVE.com

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

Uncoating היא צעד חיוני בשלב מוקדם של מחזור HIV-1 חיים מוגדר פירוק של הקליפה capsid ואת שחרורו של המתחם ribonucleoprotein ויראלי (vRNP). כאן, אנו מדגימים טכניקות לבידוד גרעינים שלמים מן HIV-1 ו virions לכימות uncoating שלהם<em&gt; במבחנה</em&gt;.

ב Uncoating במבחנה של HIV-1 ליבות

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is ...

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

15.6K Views.  Vanderbilt University School of Medicine. Uncoating היא צעד חיוני בשלב מוקדם של מחזור HIV-1 חיים מוגדר פירוק של הקליפה capsid ואת שחרורו של המתחם ribonucleoprotein ויראלי (vRNP). כאן, אנו מדגימים טכניקות לבידוד גרעינים שלמים מן HIV-1 ו virions לכימות uncoating שלהם במבחנה.

Video: In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her viral population uses the CCR5 coreceptor for cellular entry, and not an alternative coreceptor. One approach to tropism testing is to examine the sequence of the V3 region of the HIV envelope, which interacts with the coreceptor.
Methods: Viral RNA is extracted from blood plasma. The V3 region is amplified in triplicate with nested reverse transcriptase-PCR. The amplifications are then sequenced and analyzed using the software, RE_Call. Sequences are then submitted to a bioinformatic algorithm such as geno2pheno to infer viral tropism from the V3 region. Sequences are inferred to be non-R5 if their geno2pheno false positive rate falls below 5.75%. If any one of the three sequences from a sample is inferred to be non-R5, the patient is unlikely to respond to a CCR5-antagonist.

HIV tropism can be inferred from the V3 region of the viral envelope. V3 is PCR amplified in triplicate using nested RT-PCR, sequenced, and interpreted using bioinformatic software. Samples with with 1 or more sequence(s) with low g2P scores are classified as non-R5 virus.

הסקה Genotypic של כמיהות HIV-1 שימוש אוכלוסייה מבוססת רצף של V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Imaging of HIV-1 Envelope-induced Virological Synapse and Signaling on Synthetic Lipid Bilayers

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection occurs most efficiently via cell to cell transmission2,10,11. This cell to cell transfer between CD4+ T cells involves the formation of a virological synapse (VS), which is an F-actin-dependent cell-cell junction formed upon the engagement of HIV-1 envelope gp120 on the infected cell with CD4 and the chemokine receptor (CKR) CCR5 or CXCR4 on the target cell 8. In addition to gp120 and its receptors, other membrane proteins, particularly the adhesion molecule LFA-1 and its ligands, the ICAM family, play a major role in VS formation and virus transmission as they are present on the surface of virus-infected donor cells and target cells, as well as on the envelope of HIV-1 virions1,4,5,6,7,13. VS formation is also accompanied by intracellular signaling events that are transduced as a result of gp120-engagement of its receptors. Indeed, we have recently showed that CD4+ T cell interaction with gp120 induces recruitment and phosphorylation of signaling molecules associated with the TCR signalosome including Lck, CD3&zeta;, ZAP70, LAT, SLP-76, Itk, and PLC&gamma;15.
In this article, we present a method to visualize supramolecular arrangement and membrane-proximal signaling events taking place during VS formation. We take advantage of the glass-supported planar bi-layer system as a reductionist model to represent the surface of HIV-infected cells bearing the viral envelope gp120 and the cellular adhesion molecule ICAM-1. The protocol describes general procedures for monitoring HIV-1 gp120-induced VS assembly and signal activation events that include i) bi-layer preparation and assembly in a flow cell, ii) injection of cells and immunofluorescence staining to detect intracellular signaling molecules on cells interacting with HIV-1 gp120 and ICAM-1 on bi-layers, iii) image acquisition by TIRF microscopy, and iv) data analysis. This system generates high-resolution images of VS interface beyond that achieved with the conventional cell-cell system as it allows detection of distinct clusters of individual molecular components of VS along with specific signaling molecules recruited to these sub-domains.

This article describes a method to visualize formation of an HIV-1 envelope-induced virological synapse on glass supported planar bilayers by total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. The method can also be combined with immunofluorescence staining to detect activation and redistribution of signaling molecules that occur during HIV-1 envelope-induced virological synapse formation.

הדמיה של HIV-1 מעטפה הנגרמת סינפסה Virological והאיתות על bilayers שומנים סינתטי

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection occurs most efficiently via cell to cell transmission2,10,11. This cell to cell transfer between ...

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

Plasmodium falciparum, the causative agent of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important health problems worldwide, being responsible for a total of 4 million deaths annually1. Due to their extensive overlap in developing regions, especially Sub-Saharan Africa, co-infections with malaria and HIV-1 are common, but the interplay between the two diseases is poorly understood. Epidemiological reports have suggested that malarial infection transiently enhances HIV-1 replication and increases HIV-1 viral load in co-infected individuals2,3. Because this viremia stays high for several weeks after treatment with antimalarials, this phenomenon could have an impact on disease progression and transmission.
The cellular immunological mechanisms behind these observations have been studied only scarcely. The few in vitro studies investigating the impact of malaria on HIV-1 have demonstrated that exposure to soluble malarial antigens can increase HIV-1 infection and reactivation in immune cells. However, these studies used whole cell extracts of P. falciparum schizont stage parasites and peripheral blood mononuclear cells (PBMC), making it hard to decipher which malarial component(s) was responsible for the observed effects and what the target host cells were4,5. Recent work has demonstrated that exposure of immature monocyte-derived dendritic cells to the malarial pigment hemozoin increased their ability to transfer HIV-1 to CD4+ T cells6,7, but that it decreased HIV-1 infection of macrophages8. To shed light on this complex process, a systematic analysis of the interactions between the malaria parasite and HIV-1 in different relevant human primary cell populations is critically needed.
Several techniques for investigating the impact of HIV-1 on the phagocytosis of micro-organisms and the effect of such pathogens on HIV-1 replication have been described. We here present a method to investigate the effects of P. falciparum-infected erythrocytes on the replication of HIV-1 in human primary monocyte-derived macrophages. The impact of parasite exposure on HIV-1 transcriptional/translational events is monitored by using single cycle pseudotyped viruses in which a luciferase reporter gene has replaced the Env gene while the effect on the quantity of virus released by the infected macrophages is determined by measuring the HIV-1 capsid protein p24 by ELISA in cell supernatants.

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

We have developed an in vitro malaria-HIV-1 co-infection model to study the impact of Plasmodium falciparum on the HIV-1 replicative cycle in human primary monocyte-derived macrophages. This versatile system can easily be adapted to other primary cell types susceptible to HIV-1 infection.

<em&gt; במבחנה</em&gt; שיתוף זיהום דגם ללמוד<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt;-HIV-1 אינטראקציות אדם מונוציטים הנגזרות תאים ראשוניים החיסון

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

New Tools to Expand Regulatory T Cells from HIV-1-infected Individuals

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to measurable increases in antigen-specific T cell responses in vaccine settings for cancer and infectious pathogens. However, their role in HIV-1 immuno-pathogenesis remains controversial, as they could either serve to suppress deleterious HIV-1-associated immune activation and thus slow HIV-1 disease progression or alternatively suppress HIV-1-specific immunity and thereby promote virus spread. Understanding and modulating Treg function in the context of HIV-1 could lead to potential new strategies for immunotherapy or HIV vaccines. However, important open questions remain on their role in the context of HIV-1 infection, which needs to be carefully studied.
Representing roughly 5% of human CD4+ T cells in the peripheral blood, studying the Treg population has proven to be difficult, especially in HIV-1 infected individuals where HIV-1-associated CD4 T cell and with that Treg depletion occurs. The characterization of regulatory T cells in individuals with advanced HIV-1 disease or tissue samples, for which only very small biological samples can be obtained, is therefore extremely challenging. We propose a technical solution to overcome these limitations using isolation and expansion of Tregs from HIV-1-positive individuals.
Here we describe an easy and robust method to successfully expand Tregs isolated from HIV-1-infected individuals in vitro. Flow-sorted CD3+CD4+CD25+CD127low Tregs were stimulated with anti-CD3/anti-CD28 coated beads and cultured in the presence of IL-2. The expanded Tregs expressed high levels of FOXP3, CTLA4 and HELIOS compared to conventional T cells and were shown to be highly suppressive. Easier access to large numbers of Tregs will allow researchers to address important questions concerning their role in HIV-1 immunopathogenesis. We believe answering these questions may provide useful insight for the development of an effective HIV-1 vaccine.

CD4+ Regulatory T cells are potent immune-modulators and serve important functions in immune homeostasis. The paucity of these cells in peripheral blood makes functional studies challenging, specifically in the context of HIV-1-infection. We here describe a method to isolate and expand functional CD4+ Tregs from peripheral blood from HIV-1-infected individuals.

כלים חדשים כדי להרחיב תאי T רגולטוריים מאנשים HIV-1 נגוע-

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to ...

A Restriction Enzyme Based Cloning Method to Assess the In vitro Replication Capacity of HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Viruses

The protective effect of many HLA class I alleles on HIV-1 pathogenesis and disease progression is, in part, attributed to their ability to target conserved portions of the HIV-1 genome that escape with difficulty. Sequence changes attributed to cellular immune pressure arise across the genome during infection, and if found within conserved regions of the genome such as Gag, can affect the ability of the virus to replicate in vitro. Transmission of HLA-linked polymorphisms in Gag to HLA-mismatched recipients has been associated with reduced set point viral loads. We hypothesized this may be due to a reduced replication capacity of the virus. Here we present a novel method for assessing the in vitro replication of HIV-1 as influenced by the gag gene isolated from acute time points from subtype C infected Zambians. This method uses restriction enzyme based cloning to insert the gag gene into a common subtype C HIV-1 proviral backbone, MJ4. This makes it more appropriate to the study of subtype C sequences than previous recombination based methods that have assessed the in vitro replication of chronically derived gag-pro sequences. Nevertheless, the protocol could be readily modified for studies of viruses from other subtypes. Moreover, this protocol details a robust and reproducible method for assessing the replication capacity of the Gag-MJ4 chimeric viruses on a CEM-based T cell line. This method was utilized for the study of Gag-MJ4 chimeric viruses derived from 149 subtype C acutely infected Zambians, and has allowed for the identification of residues in Gag that affect replication. More importantly, the implementation of this technique has facilitated a deeper understanding of how viral replication defines parameters of early HIV-1 pathogenesis such as set point viral load and longitudinal CD4+ T cell decline.

A Restriction Enzyme Based Cloning Method to Assess the In vitro Replication Capacity of HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Viruses

HIV-1 pathogenesis is defined by both viral characteristics and host genetic factors. Here we describe a robust method that allows for reproducible measurements to assess the impact of the gag gene sequence variation on the in vitro replication capacity of the virus.

הגבלת אנזים מבוסס שיבוט שיטה להערכה<em&gt; במבחנה</em&gt; יכולת שכפול של HIV-1 Gag-MJ4 וירוסי כימרי C סוג משנה

The protective effect of many HLA class I alleles on HIV-1 pathogenesis and disease progression is, in part, attributed to their ability to target ...

Conformational Evaluation of HIV-1 Trimeric Envelope Glycoproteins Using a Cell-based ELISA Assay

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins are able to fuel the fusion process through their conformational changes could lead to the design of better, more effective immunogens for vaccine strategies. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows studying the recognition of trimeric HIV-1 Env by monoclonal antibodies. Following expression of HIV-1 trimeric Env at the surface of transfected cells, conformation specific anti-Env antibodies are incubated with the cells. A horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody and a simple chemiluminescence reaction are then used to detect bound antibodies. This system is highly flexible and can detect Env conformational changes induced by soluble CD4 or cellular proteins. It requires minimal amount of material and no highly-specialized equipment or know-how. Thus, this technique can be established for medium to high throughput screening of antigens and antibodies, such as newly-isolated antibodies.

Understanding viral surface antigens conformations is required to evaluate antibody neutralization and guide the design of effective vaccine immunogens. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows the study of the recognition of trimeric HIV-1 Env expressed at the surface of transfected cells by specific anti-Env antibodies.

הערכת קונפורמציה של HIV-1 trimeric מעטפת גליקופרוטאינים שימוש ELISA Assay מבוסס Cell

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins ...

Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. They are found in a number of biological fluids and are known to carry a variety of proteins, lipids, and nucleic acid molecules. Originally thought to be little more than reservoirs for cellular debris, the roles of exosomes regulating biological processes and in diseases are increasingly appreciated.
Several methods have been described for isolating exosomes from cellular culture media and biological fluids. Due to their small size and low density, differential ultracentrifugation and/or ultrafiltration are the most commonly used techniques for exosome isolation. However, plasma of HIV-1 infected individuals contains both exosomes and HIV viral particles, which are similar in size and density. Thus, efficient separation of exosomes from HIV viral particles in human plasma has been a challenge.
To address this limitation, we developed a procedure modified from Cantin et. al., 2008 for purification of exosomes from HIV particles in human plasma. Iodixanol velocity gradients were used to separate exosomes from HIV-1 particles in the plasma of HIV-1 positive individuals. Virus particles were identified by p24 ELISA. Exosomes were identified on the basis of exosome markers acetylcholinesterase (AChE), and the CD9, CD63, and CD45 antigens. Our gradient procedure yielded exosome preparations free of virus particles. The efficient purification of exosomes from human plasma enabled us to examine the content of plasma-derived exosomes and to investigate their immune modulatory potential and other biological functions.

Techniques describing a gradient procedure to separate exosomes from human immunodeficiency virus (HIV) particles are described. This procedure was used to isolate exosomes away from HIV particles in human plasma from HIV-infected individuals. The isolated exosomes were analyzed for cytokine/chemokine content.

בידוד של Exosomes מהפלזמה של HIV-1 אנשים חיוביים

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. ...

Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle (GUV) Membranes

The structural protein of HIV-1, Pr55Gag (or Gag), binds to the plasma membrane in cells during the virus assembly process. Membrane binding of Gag is an essential step for virus particle formation, since a defect in Gag membrane binding results in severe impairment of viral particle production. To gain mechanistic details of Gag-lipid membrane interactions, in vitro methods based on NMR, protein footprinting, surface plasmon resonance, liposome flotation centrifugation, or fluorescence lipid bead binding have been developed thus far. However, each of these in vitro methods has its limitations. To overcome some of these limitations and provide a complementary approach to the previously established methods, we developed an in vitro assay in which interactions between HIV-1 Gag and lipid membranes take place in a &#34;cell-like&#34; environment. In this assay, Gag binding to lipid membranes is visually analyzed using YFP-tagged Gag synthesized in a wheat germ-based in vitro translation system and GUVs prepared by an electroformation technique. Here we describe the background and the protocols to obtain myristoylated full-length Gag proteins and GUV membranes necessary for the assay and to detect Gag-GUV binding by microscopy.

Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle GUV Membranes

We illustrate here an in vitro membrane binding assay in which interactions between HIV-1 Gag and lipid membranes are visually analyzed using YFP-tagged Gag synthesized in a wheat germ-based in vitro translation system and GUVs prepared by an electroformation technique.

ויזואליזציה של HIV-1 Gag מחייב את הענק Unilamellar שלפוחיות (בוס) ממברנות

The structural protein of HIV-1, Pr55Gag (or Gag), binds to the plasma membrane in cells during the virus assembly process. Membrane binding of Gag is an ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential to be used as drug therapies for HIV-1 infection. Post-integration inhibitors include ribozymes, short hairpin (sh) RNAs, small interfering (si) RNAs, U1 interference (U1i) RNAs and RNA aptamers. Many of these have been identified using transient co-transfection assays with an HIV-1 expression plasmid and some have advanced to clinical trials. In addition to measures of efficacy, small RNAs have been evaluated for their potential to affect the expression of human RNAs, alter cell growth and/or differentiation, and elicit innate immune responses. In the protocols described here, a set of transient transfection assays designed to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are described. We have used these assays to identify new ribozymes and optimize the format of shRNAs and siRNAs targeting HIV-1 RNA. The methods provide a quick set of assays that are useful for screening new anti-HIV-1 RNAs and could be adapted to screen other post-integration inhibitors of HIV-1 replication.

Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones.

הערכת היעילות והרעילות של RNAs מיקוד ייצור HIV-1 לשימוש ב ג&#39;ין או טיפול תרופתי

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Phagosome Migration and Velocity Measured in Live Primary Human Macrophages Infected with HIV-1

Macrophages are phagocytic cells that play a major role at the crossroads between innate and specific immunity. They can be infected by the human immunodeficiency virus (HIV)-1 and because of their resistance to its cytopathic effects they can be considered to be persistent viral reservoirs. In addition, HIV-infected macrophages exhibit defective functions that contribute to the development of opportunistic diseases.
The exact mechanism by which HIV-1 impairs the phagocytic response of macrophages was unknown. We had previously shown that the uptake of various particulate material by macrophages was inhibited when they were infected with HIV-1. This inhibition was only partial and phagosomes did form within HIV-infected macrophages. Therefore, we focused on analyzing the fate of these phagosomes. Phagosome maturation is accompanied by migration of these compartments towards the cell center, where they fuse with lysosomes, generating phagolysosomes, responsible for degradation of the ingested material. We used IgG-opsonized Sheep Red Blood Cells as a target for phagocytosis. To measure the speed of centripetal movement of phagosomes in individual HIV-infected macrophages, we used a combination of bright field and fluorescence confocal microscopy. We established a method to calculate the distance of phagosomes towards the nucleus, and then to calculate the velocity of the phagosomes. HIV-infected cells were identified thanks to a GFP-expressing virus, but the method is applicable to non-infected cells or any type of infection or treatment.

We describe a method to measure the velocity of phagosomes moving towards the cell center in living cells infected with or without the human immunodeficiency virus (HIV) type 1, using spinning disk confocal fluorescence microscopy to identify fluorescent infected cells and bright field microscopy to detect phagosomes.