VIH-1 des études décapsidation dans le laboratoire Aiken ont été soutenus par des subventions des NIH AI40364, AI50423 et AI076121. Plusieurs matériaux clés, y compris les réactifs utilisés dans le test ELISA p24, ont été fournies par la recherche du NIH sida et du programme de référence, Division du sida, du NIAID, NIH.

1. Production de particules de VIH-1 Avant de procéder, vous devez obtenir la permission et suivez les directives du Bureau de la biosécurité de votre institution à travailler dans un établissement agréé pour la biosécurité VIH infectieux. Vous devez vous assurer que les soins et les précautions de sécurité sont suivies pendant le travail dans le laboratoire de biosécurité. Production de particules de VIH-1 est généralement effectuée par transfection transitoire de cellules 293T avec le VIH-1 ADN proviral en utilisant une méthode de transfection de phosphate de calcium 7, 8. Haute stocks de virus cultivés par titre culture de cellules infectées par T conviennent également. <ol><li> Culture des cellules 293T au moyen Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) contenant 10% de sérum fœtal bovin (FBS) et complété avec des antibiotiques [pénicilline (100 UI / ml) et streptomycine (100 ug / ml)] à 37 ° C, 5% de CO 2 . </li><li> Détachez les cellules à partir des plats de près de confluence avec 0,25% de trypsine-EDTA et des semences 2x10 6 </sjusqu&#39;à&gt; cellules dans 9 ml par 100 mm boîte de culture un jour avant la transfection. Graine six 100 boîtes de culture mm pour la production de virions. Si la préparation concentrée de cœurs est nécessaire, des plats plus pourraient être semées pour la transfection. </li><li> Le lendemain, les monocouches de cellules doit être d&#39;environ 25% de confluence et prêt pour la transfection. Pendant six plats de cellules à transfecter, amener 120 pg d&#39;ADN proviral jusqu&#39;à un volume de 2,7 ml d&#39;eau stérile. A ce mélange, ajouter 0,3 ml de 2,5 M CaCl 2 et 3 ml de 2XBBS, et bien mélanger par pipetage de haut en bas plusieurs fois. Laisser le mélange reposer à température ambiante pendant 10-20 minutes. </li><li> Ajouter 1 ml de la goutte à goutte le mélange résultant au centre de chaque plat tout en tourbillonnant doucement pour mélanger. Placez les plats pendant la nuit (~ 16 heures) dans un incubateur réglé à 35 ° C et 3% de CO 2. </li><li> Aspirer le milieu de culture et doucement, ajouter 5 ml de PBS. </li><li> Aspirer PBS et ajouter 5 ml de milieu frais. Culture des cellules dans un incubateur à 37 &amp;deg; C et 5% de CO 2 pour les 24-48 heures supplémentaires. </li><li> Recueillir le surnageant de culture contenant des particules virales, le transférer à un tube de 50 ml à centrifuger conique. Combinez les surnageants de tous les plats et centrifuger à 1500 xg pendant 5 min pour sédimenter les cellules et les débris. Filtrer le surnageant à l&#39;aide de filtres de 0,45 um seringue taille des pores. Des précautions doivent être prises pour minimiser la formation d&#39;aérosols tout en travaillant avec le virus vivant. Cela comprend l&#39;utilisation de tubes coniques avec joints toriques ou couvre benne rotor pendant l&#39;étape de centrifugation. Si cela n&#39;est pas possible, les bouchons à vis des tubes doivent être enveloppés avec du parafilm. </li></ol> 2. Concentration de virions VIH-1 par ultracentrifugation <ol><li> Placer le surnageant de culture (30 ml) dans un tube de 38,5 ml polyallomère centrifugeuse (pour Beckman SW32Ti rotor ou équivalent). Sous-couche doucement le surnageant contenant le virus avec 5 ml de solution de saccharose à 20% dans du PBS à l&#39;aide d&#39;une pipette de 5 ml. </li><li> Centrifuger pendant 3 heures à32000 rpm à 4 ° C (175 000 xg à r max) pour les particules de virus de granules. </li><li> Retirer le surnageant par aspiration, en prenant soin de ne pas perturber le culot au fond du tube. Ajouter 0,5 ml de 1XSTE tampon (10 mM Tris-HCl [pH 7,4], NaCl 100 mM, EDTA 1 mM) pour le tube et le lieu à 4 ° C pendant 1 heure à desserrer le culot. L&#39;utilisation d&#39;un large alésage une pipette ml délicatement la pipette haut et en bas à quelques reprises pour détacher le culot au fond du tube. Ensuite, le transfert de l&#39;desserré granulés à un tube de 1,5 ml, en prenant soin d&#39;éviter de faire mousser. Incuber à 4 ° C pour un autre 1-3 heures pour permettre aux petites touffes de virus à se disperser. Durant cette période, préparer le gradient de saccharose comme décrit dans l&#39;étape 3.1. </li><li> Délicatement la pipette la suspension de virus de haut en bas plusieurs fois et centrifuger à 8000 rpm (6000 xg) à 4 ° C dans une centrifugeuse réfrigérée pendant 1 min pour éliminer les grumeaux résiduels. Gardez le froid de l&#39;échantillon pendant ce processus. </li></ol> 3. Gradient de saccharosecentrifugation pour isoler des noyaux VIH-1 les noyaux sont isolés en utilisant un «spin-thru&quot; méthode 9 qui est une modification de la méthode décrite précédemment pour la purification du VIH-2 cœurs 10. <ol><li> Préparer un ml 12 linéaires de 30% à 70% dans un tampon de gradient de saccharose 1XSTE dans un tube 14,5 ml polyallomère centrifugeuse pour SW32.1Ti rotor. Pour préparer dégradé, utilisez un gradient de 20 ml ancienne, lieu de 6 ml de solution de saccharose à 70% sur le côté proche (à proximité de l&#39;orifice de sortie) et 6 ml de solution de saccharose à 30% de l&#39;autre côté. Assurez-vous que les bulles d&#39;air ne sont pas piégés dans le canal reliant les deux chambres. Utilisez la fonction Auto-Flow Densi gradient anciens pour pomper le dégradé de bas en haut du tube contenant 1 ml de solution de saccharose à 85% dans le fond. Placez délicatement le gradient à 4 ° C jusqu&#39;à refroidi (2-4 heures). </li><li> L&#39;utilisation d&#39;un large alésage une pipette ml délicatement superposition du gradient avec 0,25 ml de solution de saccharose à 15% à STE contenant 1% de Triton X-100. </li&gt; <li> Doucement superposition avec 0,25 ml de solution de saccharose à 7,5% en utilisant une gamme STE-alésage une pipette ml. Attention à ne pas mélanger les couches. </li><li> Doucement superposition avec 0,5 ml de suspension du virus de l&#39;étape 2.4. Cette étape doit être réalisée avec soin pour éviter toute perturbation dans la pente et le mélange des couches de saccharose underlaid. </li><li> Placer les tubes dans le seau de pré-refroidissement SW32.1Ti et centrifuger à 32000 rpm (187000 xg à r max) pendant la nuit (16-20 heures) à 4 ° C. Pour éviter une pause de la centrifugeuse, ne commencez pas la centrifugation jusqu&#39;à ce que le vide dans le centrifugeur atteint 250 um </li><li> Collecter des fractions de 1 ml de haut en bas de la pente en utilisant le gradient de fractionnement automatique Densi-Flow. Placer les tubes sur la glace immédiatement après la collecte. Mélanger le contenu des tubes en inversant quelques fois, et de retirer 50 ul de chaque fraction pour la quantification par ELISA ou inverser dosage de l&#39;activité transcriptase. </li></ol> 4. Localisation du VIH-1 des noyauxet le stockage des noyaux <ol><li> Avant de procéder à des dosages décapsidation, il est important de déterminer quelles fractions contiennent intacte VIH-1 des noyaux. Ceci peut être déterminé par ELISA p24 ou inverser dosage de l&#39;activité de la transcriptase utilisant les 50 aliquotes de l&#39;étape 3.6. </li><li> La reprise du CA associé avec les noyaux est souvent liée à la stabilité des noyaux. Mesurer le noyau associé CA par ELISA p24 9 en utilisant un échantillon de chaque fraction. Alternativement, mesurer l&#39;activité de la transcriptase inverse de chaque fraction. En utilisant les deux méthodes le pic devrait être d&#39;environ 10 fraction. </li><li> Piscine des fractions contenant des noyaux. Si les carottes ne doivent pas être utilisés pour la décapsidation dosage immédiatement, partie aliquote des noyaux regroupés en aliquots de 0,2 ml à 0,3, flash-gel en N2 liquide et conserver à -80 ° C. Les carottes congelés de cette manière sont adaptés pour le dosage décapsidation. Le rendement du CA core-associé est typiquement 1-2 mg par millilitre de p24 ou environ 15% du total des virions associésp24. </li></ol> 5. Test cinétique du VIH-1 décapsidation <ol><li> La quantité de VIH-1 carottes requises par réaction décapsidation est d&#39;environ 50 ng. Pour effectuer le dosage in vitro décapsidation, prédilué l&#39;aliquote de carottes avec un volume égal de tampon 1XSTE froide pour réduire la viscosité de la suspension et de minimiser les erreurs de pipetage. </li><li> Diluer 100 ml de l&#39;cœurs dans 0,15 ml de tampon 1XSTE froide contenant 10 pg / ml de BSA dans un tube de 1,5 ml. Nous complétons le tampon STE avec la BSA (10 pg / ml) afin de minimiser l&#39;adsorption de CA sur les parois du tube. Mélanger par moments le tube retournant plusieurs. Ne pas vortexer les échantillons. Incuber les tubes dans un bain d&#39;eau à 37 ° C pour les intervalles de temps (15, 30, 60 et 120 min). Les tubes doivent être immergés dans le bain d&#39;eau d&#39;au moins jusqu&#39;au niveau de l&#39;échantillon interne afin d&#39;assurer même le réchauffement. </li><li> Durant l&#39;incubation, mélanger délicatement le contenu du tube périodiquement (généralement 5 -10 min) en feuilletant le tube. Pour un contrôle de zéro minute, diluer 100 ul de cœurs dans 0,15 ml de tampon 1XSTE froide et laisser incuber dans la glace pendant toute la durée de l&#39;expérience (120 min). Le contrôle de zéro minute donne la valeur basale et décapsidation est utilisé pour déterminer augmentation décapsidation des carottes incubées à 37 ° C pour les différents intervalles de temps. </li><li> A la fin de la période d&#39;incubation, arrêter le processus de décapsidation en plaçant les tubes dans la glace pendant 10 minutes. </li><li> Centrifuger les tubes à 45 000 rpm (TLA-55 du rotor; 125 000 xg à r max) pendant 20 minutes à 4 ° C. Ce sera un culot de noyaux intacts et la libre circulation des CA publié à la suite de décapsidation de cœurs resteront dans le surnageant. Le rotor doit être préalablement refroidi à 4 ° C avant le chargement des échantillons. </li><li> Transférer le surnageant dans de nouveaux tubes de microcentrifugeuse prérefroidi de préférence en utilisant un gel de chargement astuces stockée à température ambiante. S&#39;il vous plaît noter que la pastille ne sera pas visible à l&#39;œil nu, afin de prendre un soin extrême wien de pipetage sur le surnageant. Resuspendre les pastilles dans 250 pl de diluant pour échantillons ELISA (0,5% de Triton X-100 et de 5% des donateurs de sérum de veau dans du PBS). Pour assurer une dissolution efficace de la pastille, vortex après l&#39;ajout du diluant pour échantillons ELISA. Quantifier le contenu CA du culot et du surnageant à l&#39;aide p24 ELISA comme décrit dans la section suivante. </li><li> L&#39;étendue de la décapsidation est obtenue en calculant la fraction du CA présents dans le surnageant. </li></ol> 6. Dosage de l&#39;AC par ELISA p24 <ol><li> Beaucoup de trousses commerciales ELISA sont disponibles et peuvent être utilisés pour quantifier CA. Utilisez n&#39;importe quel commerce ou «in-house&quot; ELISA et inclure des normes p24 pour déterminer la linéarité du dosage. Les dilutions des échantillons doivent être testés pour assurer l&#39;exactitude. </li><li> Nous avons développé un ELISA maison qui nous utilisent régulièrement le dosage de CA. La procédure est adapté d&#39;un précédent rapport 11 et est réalisée en utilisant des anticorps de capture et de détection disponibles de l&#39;AID NIHRecherche S and Référence Reagent Program. </li></ol> 7. Les résultats représentatifs: Un exemple de résultat de test ELISA pour la détermination des fractions contenant de base est montré dans la figure 1. Après avoir recueilli des fractions (1 ml chacune), 50 pl de l&#39;échantillon de chaque fraction a été utilisé pour faire des dilutions en série et analysées par ELISA. La p24 total obtenu en additionnant les valeurs de douze fractions a été de 14,5 ug. Comme le montre la figure dans les fractions 8 à 10 noyaux contenus. La valeur p24 pour les fractions de coeur contenant était de 2,17 mg. Le pourcentage de core-p24 associée (14,97%) a été déterminé en prenant le ratio de la valeur p24 pour les fractions de base (2,17 mg) à la valeur totale de p24 (14,5 mg). Fraction 1 ou 2 contiendra toujours plus grande quantité de p24, ce qui représente CA libre qui n&#39;est pas associée à des noyaux. Elle est suivie par une réduction progressive des valeurs de p24 avec chaque fraction subséquente, puis une forte hausse, et enfin une forte baisse de la p24valeurs. Si prise en charge adéquate pendant le chargement du gradient, puis le sommet du noyau associée CA se trouve autour fraction de 10. Un résultat typique obtenu par le dosage de la cinétique de décapsidation du VIH-1 noyaux est illustré à la Figure 2. Le graphique montre une augmentation en fonction du temps décapsidation de type sauvage du VIH-1 des noyaux. Le pour cent décapsidation valeur a été obtenue en calculant la fraction du CA présents dans le surnageant. Avec la pratique, le dosage est hautement reproductible et est utile pour déterminer la stabilité des noyaux virale in vitro. S&#39;il vous plaît noter que la reproductibilité de l&#39;essai est fortement tributaire de la manipulation des échantillons au cours de la procédure. Depuis les noyaux sont thermolabiles, les échantillons doivent être conservés à 4 ° C tout au long du test, sauf pendant la période d&#39;incubation. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3384/3384fig1.jpg" /> Figure 1 centrifugation par gradient de densité de l&#39;équilibreVIH-1 des noyaux. Une suspension de virus concentrée a été appliquée au sommet d&#39;un gradient de saccharose linéaire 30 à 70% recouverte de 1% de Triton-X-100. Après centrifugation nuit à 187 000 xg et 4 ° C, des fractions de 1 ml ont été recueillies de haut (Fraction 1) en bas (Fraction 12) et p24 a été quantifiée par ELISA. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3384/3384fig2.jpg" /> Figure 2 Évolution dans le temps du VIH-1 décapsidation in vitro. VIH-1 purifiée noyaux ont été dilués et incubées à 37 ° C pendant les intervalles de temps indiqués. L&#39;échantillon a été incubé à zéro min sur la glace pendant toute la durée de l&#39;expérience. Après incubation, les échantillons ont été soumis à une ultracentrifugation à 125 000 xg pendant 20 minutes à 4 ° C. Surnageant et de boulettes ont été séparés et analysés par ELISA p24. L&#39;étendue de la décapsidation a été déterminée comme décrit dans le texte du protocole. Chaque réaction décapsidation a été réalisée en double; barres d&#39;erreur couvrent la gamme des deux valeurs.

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	<li>Ganser, B. K., Li, S., Klishko, V. Y., Finch, J. T., Sundquist, W. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+and+analysis+of+conical+models+for+the+HIV-1+core.">Assembly and analysis of conical models for the HIV-1 core.</a> Science. 283, 80-83 (1999).</li><li>Li, S., Hill, C. P., Sundquist, W. I., Finch, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+reconstructions+of+helical+assemblies+of+the+HIV-1+CA+protein.">Image reconstructions of helical assemblies of the HIV-1 CA protein.</a> Nature. 407, 409-413 (2000).</li><li>Aiken, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+and+cellular+factors+that+regulate+HIV-1+uncoating.">Viral and cellular factors that regulate HIV-1 uncoating.</a> Curr. Opin. HIV. AIDS. 1, 194-199 (2006).</li><li>Forshey, B. M., Schwedler, U. v. o. n., Sundquist, W. 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Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

La méthode décrite ici pour purifier le VIH-1 pour étudier des noyaux décapsidation in vitro est utile pour étudier cette phase du cycle de vie du VIH-1, notamment en raison de l&#39;indisponibilité d&#39;une méthode validée d&#39;analyser le VIH-1 dans les cellules cibles décapsidation. Bien que cette méthode utilise pour purifier l&#39;équilibre ultracentrifugation noyaux, d&#39;autres ont utilisé granulation directe après lyse brièvement avec 1% de Triton-X-100 12, 13 ou granulation à travers un coussin de saccharose superposé avec 0,1% de Triton-X-100 14, 15. La récupération des noyaux obtenus par cette méthode est sujette à des variations expérimentales. Une variable dans la réussite de ce protocole est l&#39;efficacité de la transfection. Typiquement, nous charger une quantité de virus équivalente à au moins 7 pg de p24 sur le gradient. Notre laboratoire utilise une méthode de transfection de phosphate de calcium pour la production de virus. Bien que les méthodes de transfection d&#39;autres peuvent également convenir, nous ne les avons pas évalués pour l&#39;isolement des noyaux. Autres var importantsqui influencent le rendement iables de base sont le soin apporté à l&#39;application des couches de la pente et en gardant les échantillons froids. Le plus grand soin doit être pris lors de la préparation des gradients de sucrose pour éviter de mélanger du gradient. Toute perturbation tout en appliquant la suspension de virus concentrée peut conduire à tout contact indésirable et au début des virions avec un détergent sous la couche de saccharose barrière; telle contact prolongé peut briser les cœurs fragiles et conduire à réduire la capside association. Il est tout aussi important de garder le gradient de densité de sucrose et le froid suspension de virus pendant toute la procédure. La procédure a été maîtrisé et utilisé avec succès par de nombreux scientifiques dans notre laboratoire. VIH-1 sont des noyaux thermolabile 4, par conséquent, il est très important de fractionner le gradient de saccharose pendant qu&#39;il est froid et à placer les fractions collectées immédiatement sur ​​la glace. Depuis décapsidation de carottes est aussi dépendante du pH et la concentration en sel de la mémoire tampon4, il est fortement conseillé de mesurer le pH de tampon STE avant de procéder à l&#39;analyse. Le taux de décapsidation peuvent varier légèrement avec chaque lot de carottes. Réactions décapsidation doit être réalisée en deux exemplaires, et si les valeurs diffèrent de plus de 15%, puis les réactions devraient être effectués en triple jusqu&#39;à consistance est atteinte. Ca libre protéine a tendance à coller sur les parois intérieures des tubes, donc il est impératif d&#39;inclure la BSA à une concentration finale de 10 ug / ml dans le mélange réactionnel afin de minimiser l&#39;adsorption de CA sur les parois de ces tubes. Comme mentionné précédemment, le dosage décapsidation décrites ici peuvent être utilisées pour identifier et étudier les facteurs cellulaires qui affectent décapsidation. Il peut également être utilisée pour étudier l&#39;effet de la capside et de composés ciblant des facteurs cellulaires sur la transcription inverse en utilisant une analyse des noyaux endogènes inverse de la transcription. Isolement du VIH-1 des noyaux en quantité suffisante peut également permettre l&#39;analysedes interactions de la capside avec les facteurs cellulaires par immunomarquage à la microscopie électronique.

<table border="1"><tbody><tr><td width="190"> Nom du réactif </td><td width="197"> Société </td><td width="114"> Le numéro de catalogue </td><td width="161"> Commentaires (optionnel) </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Cellgro </td><td> 10 à 013-CV </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> Cellgro </td><td> 21 à 031-CV </td><td></td></tr><tr><td> Triton-X-100 </td><td> Mallinckrodt Baker Inc </td><td> 9002-93-1 </td><td></td></tr><tr><td> Tween 20 </td><td> Acros </td><td> 9005-64-5 </td><td></td></tr><tr><td> 0,25% de trypsine-EDTA </td><td> Cellgro </td><td> 25 à 053-CI </td><td></td></tr><tr><td> 2XBBS </td><td></td><td></td><td> Composition: 50mm BES [p H 6,95], 280 mM de NaCl et 1,5 mM Na 2 HPO 4. Ajuster le pH à 6,95à température ambiante. Stériliser par filtration et les stocker en aliquots à -20 ° C. </td></tr><tr><td> D&#39;anticorps de revêtement: anticorps monoclonal pour p24 (183-H12-5C) </td><td> NIH AIDS Research and Référence Reagent Program </td><td> 3537 </td><td></td></tr><tr><td> L&#39;anticorps primaire: le VIH-Ig (sérum hyperimmun patient humain) </td><td> NIH AIDS Research and Référence Reagent Program </td><td> 3957 </td><td></td></tr><tr><td> L&#39;anticorps secondaire: Chèvre anti-IgG humaine, conjuguée à la peroxydase </td><td> Pierce </td><td> 31130 </td><td></td></tr><tr><td> Substrat HRP </td><td> KPL Inc </td><td> 50-76-11 </td><td></td></tr><tr><td> Immulon 2HB plaques de 96 puits </td><td> Thermo Scientific </td><td> 3455 </td><td></td></tr><tr><td> SW32Ti et SW32.1 rotors Ti et ultracentrifugeuse compatibles </td> &lt;td&gt; Beckman Coulter </td><td></td><td></td></tr><tr><td> TLA-55 du rotor et ultracentrifugeuse de table </td><td> Beckman Coulter </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Haute microtubes de la vitesse </td><td> Beckman Coulter </td><td> 326823, 358123, 357448 </td><td></td></tr><tr><td> Auto-Densi fractionnement du gradient de densité de flux </td><td> Labconco Corp </td><td> 4517000 </td><td></td></tr><tr><td> Dégradé Ancien </td><td> CBS Scientific Co. Inc </td><td> GM-20 </td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro uncoating of hiv-1 cores

Le génome des rétrovirus est enfermé dans une capside entourée d&#39;une enveloppe lipidique. Pour lentivirus, comme le VIH-1, la coquille conique capside est composée de protéines CA disposés comme un treillis de l&#39;hexagone. La capside est fermé par 7 pentamères à la fin de large et 5 à l&#39;extrémité étroite du cône 1, 2. Enfermé dans cette coquille capside est le complexe de ribonucléoprotéines virales, et ensemble, ils constituent le cœur. Suite à la fusion de la membrane virale avec la membrane de la cellule cible, le VIH-1 est libérée dans le cytoplasme. La capside démonte puis en relâchant sans CA de la forme soluble 3 dans un processus appelé décapsidation. La localisation intracellulaire et le calendrier du VIH-1 décapsidation sont mal comprises. Simple substitutions d&#39;acides aminés dans les CA qui modifient la stabilité de la capside également nuire à la capacité du VIH-1 à infecter les cellules 4. Cela indique que la stabilité de la capside est critique pour le VIH-1. </p&gt; VIH-1 décapsidation a été difficile à étudier en raison du manque de disponibilité des tests sensibles et fiables pour ce processus. Nous décrivons ici une méthode quantitative pour l&#39;étude de décapsidation in vitro en utilisant des noyaux isolés de VIH-1 infectieux des particules. L&#39;approche implique l&#39;isolement des noyaux par sédimentation de virions concentrés à travers une couche de détergent et d&#39;un gradient de saccharose linéaire, dans le froid. Pour quantifier décapsidation, les noyaux isolés sont incubées à 37 ° C pour les différents intervalles de temps et ensuite sédimentées par ultracentrifugation. L&#39;étendue de la décapsidation est analysée par la quantification de la fraction du CA dans le surnageant. Cette approche a été employée pour analyser les effets des mutations virales sur le VIH-1 de la stabilité capside 4, 5, 6. Il devrait également être utile pour étudier le rôle des facteurs cellulaires du VIH-1 décapsidation.

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In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

Décapsidation est une étape essentielle dans la phase précoce du cycle de vie du VIH-1 et est défini comme le démontage de la coquille de capside et la libération des complexes de ribonucléoprotéines virales (vRNP). Ici, nous montrons des techniques pour isoler des noyaux intacts à partir de virions VIH-1 et pour quantifier leur décapsidation<em&gt; In vitro</em&gt;.

En décapsidation in vitro du VIH-1 Cores

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is ...

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

15.6K vues.  Vanderbilt University School of Medicine. Décapsidation est une étape essentielle dans la phase précoce du cycle de vie du VIH-1 et est défini comme le démontage de la coquille de capside et la libération des complexes de ribonucléoprotéines virales (vRNP). Ici, nous montrons des techniques pour isoler des noyaux intacts à partir de virions VIH-1 et pour quantifier leur décapsidation In vitro.

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Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her viral population uses the CCR5 coreceptor for cellular entry, and not an alternative coreceptor. One approach to tropism testing is to examine the sequence of the V3 region of the HIV envelope, which interacts with the coreceptor.
Methods: Viral RNA is extracted from blood plasma. The V3 region is amplified in triplicate with nested reverse transcriptase-PCR. The amplifications are then sequenced and analyzed using the software, RE_Call. Sequences are then submitted to a bioinformatic algorithm such as geno2pheno to infer viral tropism from the V3 region. Sequences are inferred to be non-R5 if their geno2pheno false positive rate falls below 5.75%. If any one of the three sequences from a sample is inferred to be non-R5, the patient is unlikely to respond to a CCR5-antagonist.

HIV tropism can be inferred from the V3 region of the viral envelope. V3 is PCR amplified in triplicate using nested RT-PCR, sequenced, and interpreted using bioinformatic software. Samples with with 1 or more sequence(s) with low g2P scores are classified as non-R5 virus.

Inférence génotypique de tropisme du VIH-1 en utilisant la population basée séquençage du V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Recherche

Immunologie et infection

Imaging of HIV-1 Envelope-induced Virological Synapse and Signaling on Synthetic Lipid Bilayers

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection occurs most efficiently via cell to cell transmission2,10,11. This cell to cell transfer between CD4+ T cells involves the formation of a virological synapse (VS), which is an F-actin-dependent cell-cell junction formed upon the engagement of HIV-1 envelope gp120 on the infected cell with CD4 and the chemokine receptor (CKR) CCR5 or CXCR4 on the target cell 8. In addition to gp120 and its receptors, other membrane proteins, particularly the adhesion molecule LFA-1 and its ligands, the ICAM family, play a major role in VS formation and virus transmission as they are present on the surface of virus-infected donor cells and target cells, as well as on the envelope of HIV-1 virions1,4,5,6,7,13. VS formation is also accompanied by intracellular signaling events that are transduced as a result of gp120-engagement of its receptors. Indeed, we have recently showed that CD4+ T cell interaction with gp120 induces recruitment and phosphorylation of signaling molecules associated with the TCR signalosome including Lck, CD3&zeta;, ZAP70, LAT, SLP-76, Itk, and PLC&gamma;15.
In this article, we present a method to visualize supramolecular arrangement and membrane-proximal signaling events taking place during VS formation. We take advantage of the glass-supported planar bi-layer system as a reductionist model to represent the surface of HIV-infected cells bearing the viral envelope gp120 and the cellular adhesion molecule ICAM-1. The protocol describes general procedures for monitoring HIV-1 gp120-induced VS assembly and signal activation events that include i) bi-layer preparation and assembly in a flow cell, ii) injection of cells and immunofluorescence staining to detect intracellular signaling molecules on cells interacting with HIV-1 gp120 and ICAM-1 on bi-layers, iii) image acquisition by TIRF microscopy, and iv) data analysis. This system generates high-resolution images of VS interface beyond that achieved with the conventional cell-cell system as it allows detection of distinct clusters of individual molecular components of VS along with specific signaling molecules recruited to these sub-domains.

This article describes a method to visualize formation of an HIV-1 envelope-induced virological synapse on glass supported planar bilayers by total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. The method can also be combined with immunofluorescence staining to detect activation and redistribution of signaling molecules that occur during HIV-1 envelope-induced virological synapse formation.

Imagerie de VIH-1 Enveloppe induite Synapse virologique et de signalisation sur bicouches lipidiques synthétiques

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection occurs most efficiently via cell to cell transmission2,10,11. This cell to cell transfer between ...

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

Plasmodium falciparum, the causative agent of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important health problems worldwide, being responsible for a total of 4 million deaths annually1. Due to their extensive overlap in developing regions, especially Sub-Saharan Africa, co-infections with malaria and HIV-1 are common, but the interplay between the two diseases is poorly understood. Epidemiological reports have suggested that malarial infection transiently enhances HIV-1 replication and increases HIV-1 viral load in co-infected individuals2,3. Because this viremia stays high for several weeks after treatment with antimalarials, this phenomenon could have an impact on disease progression and transmission.
The cellular immunological mechanisms behind these observations have been studied only scarcely. The few in vitro studies investigating the impact of malaria on HIV-1 have demonstrated that exposure to soluble malarial antigens can increase HIV-1 infection and reactivation in immune cells. However, these studies used whole cell extracts of P. falciparum schizont stage parasites and peripheral blood mononuclear cells (PBMC), making it hard to decipher which malarial component(s) was responsible for the observed effects and what the target host cells were4,5. Recent work has demonstrated that exposure of immature monocyte-derived dendritic cells to the malarial pigment hemozoin increased their ability to transfer HIV-1 to CD4+ T cells6,7, but that it decreased HIV-1 infection of macrophages8. To shed light on this complex process, a systematic analysis of the interactions between the malaria parasite and HIV-1 in different relevant human primary cell populations is critically needed.
Several techniques for investigating the impact of HIV-1 on the phagocytosis of micro-organisms and the effect of such pathogens on HIV-1 replication have been described. We here present a method to investigate the effects of P. falciparum-infected erythrocytes on the replication of HIV-1 in human primary monocyte-derived macrophages. The impact of parasite exposure on HIV-1 transcriptional/translational events is monitored by using single cycle pseudotyped viruses in which a luciferase reporter gene has replaced the Env gene while the effect on the quantity of virus released by the infected macrophages is determined by measuring the HIV-1 capsid protein p24 by ELISA in cell supernatants.

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

We have developed an in vitro malaria-HIV-1 co-infection model to study the impact of Plasmodium falciparum on the HIV-1 replicative cycle in human primary monocyte-derived macrophages. This versatile system can easily be adapted to other primary cell types susceptible to HIV-1 infection.

Un<em&gt; In vitro</em&gt; Co-infection modèle pour étudier<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt;-VIH-1 dans les interactions de l&#39;homme primaires dérivées de monocytes cellules immunitaires

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

New Tools to Expand Regulatory T Cells from HIV-1-infected Individuals

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to measurable increases in antigen-specific T cell responses in vaccine settings for cancer and infectious pathogens. However, their role in HIV-1 immuno-pathogenesis remains controversial, as they could either serve to suppress deleterious HIV-1-associated immune activation and thus slow HIV-1 disease progression or alternatively suppress HIV-1-specific immunity and thereby promote virus spread. Understanding and modulating Treg function in the context of HIV-1 could lead to potential new strategies for immunotherapy or HIV vaccines. However, important open questions remain on their role in the context of HIV-1 infection, which needs to be carefully studied.
Representing roughly 5% of human CD4+ T cells in the peripheral blood, studying the Treg population has proven to be difficult, especially in HIV-1 infected individuals where HIV-1-associated CD4 T cell and with that Treg depletion occurs. The characterization of regulatory T cells in individuals with advanced HIV-1 disease or tissue samples, for which only very small biological samples can be obtained, is therefore extremely challenging. We propose a technical solution to overcome these limitations using isolation and expansion of Tregs from HIV-1-positive individuals.
Here we describe an easy and robust method to successfully expand Tregs isolated from HIV-1-infected individuals in vitro. Flow-sorted CD3+CD4+CD25+CD127low Tregs were stimulated with anti-CD3/anti-CD28 coated beads and cultured in the presence of IL-2. The expanded Tregs expressed high levels of FOXP3, CTLA4 and HELIOS compared to conventional T cells and were shown to be highly suppressive. Easier access to large numbers of Tregs will allow researchers to address important questions concerning their role in HIV-1 immunopathogenesis. We believe answering these questions may provide useful insight for the development of an effective HIV-1 vaccine.

CD4+ Regulatory T cells are potent immune-modulators and serve important functions in immune homeostasis. The paucity of these cells in peripheral blood makes functional studies challenging, specifically in the context of HIV-1-infection. We here describe a method to isolate and expand functional CD4+ Tregs from peripheral blood from HIV-1-infected individuals.

De nouveaux outils pour multiplier des cellules T régulatrices de personnes VIH-1-infected

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to ...

A Restriction Enzyme Based Cloning Method to Assess the In vitro Replication Capacity of HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Viruses

The protective effect of many HLA class I alleles on HIV-1 pathogenesis and disease progression is, in part, attributed to their ability to target conserved portions of the HIV-1 genome that escape with difficulty. Sequence changes attributed to cellular immune pressure arise across the genome during infection, and if found within conserved regions of the genome such as Gag, can affect the ability of the virus to replicate in vitro. Transmission of HLA-linked polymorphisms in Gag to HLA-mismatched recipients has been associated with reduced set point viral loads. We hypothesized this may be due to a reduced replication capacity of the virus. Here we present a novel method for assessing the in vitro replication of HIV-1 as influenced by the gag gene isolated from acute time points from subtype C infected Zambians. This method uses restriction enzyme based cloning to insert the gag gene into a common subtype C HIV-1 proviral backbone, MJ4. This makes it more appropriate to the study of subtype C sequences than previous recombination based methods that have assessed the in vitro replication of chronically derived gag-pro sequences. Nevertheless, the protocol could be readily modified for studies of viruses from other subtypes. Moreover, this protocol details a robust and reproducible method for assessing the replication capacity of the Gag-MJ4 chimeric viruses on a CEM-based T cell line. This method was utilized for the study of Gag-MJ4 chimeric viruses derived from 149 subtype C acutely infected Zambians, and has allowed for the identification of residues in Gag that affect replication. More importantly, the implementation of this technique has facilitated a deeper understanding of how viral replication defines parameters of early HIV-1 pathogenesis such as set point viral load and longitudinal CD4+ T cell decline.

A Restriction Enzyme Based Cloning Method to Assess the In vitro Replication Capacity of HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Viruses

HIV-1 pathogenesis is defined by both viral characteristics and host genetic factors. Here we describe a robust method that allows for reproducible measurements to assess the impact of the gag gene sequence variation on the in vitro replication capacity of the virus.

Une enzyme de restriction basée sur le clonage méthode pour évaluer la<em&gt; In vitro</em&gt; Capacité de réplication du VIH-1 sous-type C Gag-MJ4 chimériques virus

The protective effect of many HLA class I alleles on HIV-1 pathogenesis and disease progression is, in part, attributed to their ability to target ...

Conformational Evaluation of HIV-1 Trimeric Envelope Glycoproteins Using a Cell-based ELISA Assay

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins are able to fuel the fusion process through their conformational changes could lead to the design of better, more effective immunogens for vaccine strategies. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows studying the recognition of trimeric HIV-1 Env by monoclonal antibodies. Following expression of HIV-1 trimeric Env at the surface of transfected cells, conformation specific anti-Env antibodies are incubated with the cells. A horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody and a simple chemiluminescence reaction are then used to detect bound antibodies. This system is highly flexible and can detect Env conformational changes induced by soluble CD4 or cellular proteins. It requires minimal amount of material and no highly-specialized equipment or know-how. Thus, this technique can be established for medium to high throughput screening of antigens and antibodies, such as newly-isolated antibodies.

Understanding viral surface antigens conformations is required to evaluate antibody neutralization and guide the design of effective vaccine immunogens. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows the study of the recognition of trimeric HIV-1 Env expressed at the surface of transfected cells by specific anti-Env antibodies.

Évaluation de conformation du VIH-1 trimère glycoprotéines d&#39;enveloppe l&#39;aide d&#39;un base de cellules test ELISA

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins ...

Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. They are found in a number of biological fluids and are known to carry a variety of proteins, lipids, and nucleic acid molecules. Originally thought to be little more than reservoirs for cellular debris, the roles of exosomes regulating biological processes and in diseases are increasingly appreciated.
Several methods have been described for isolating exosomes from cellular culture media and biological fluids. Due to their small size and low density, differential ultracentrifugation and/or ultrafiltration are the most commonly used techniques for exosome isolation. However, plasma of HIV-1 infected individuals contains both exosomes and HIV viral particles, which are similar in size and density. Thus, efficient separation of exosomes from HIV viral particles in human plasma has been a challenge.
To address this limitation, we developed a procedure modified from Cantin et. al., 2008 for purification of exosomes from HIV particles in human plasma. Iodixanol velocity gradients were used to separate exosomes from HIV-1 particles in the plasma of HIV-1 positive individuals. Virus particles were identified by p24 ELISA. Exosomes were identified on the basis of exosome markers acetylcholinesterase (AChE), and the CD9, CD63, and CD45 antigens. Our gradient procedure yielded exosome preparations free of virus particles. The efficient purification of exosomes from human plasma enabled us to examine the content of plasma-derived exosomes and to investigate their immune modulatory potential and other biological functions.

Techniques describing a gradient procedure to separate exosomes from human immunodeficiency virus (HIV) particles are described. This procedure was used to isolate exosomes away from HIV particles in human plasma from HIV-infected individuals. The isolated exosomes were analyzed for cytokine/chemokine content.

Isolement des exosomes dans le plasma du VIH-1 individus positifs

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. ...

Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle (GUV) Membranes

The structural protein of HIV-1, Pr55Gag (or Gag), binds to the plasma membrane in cells during the virus assembly process. Membrane binding of Gag is an essential step for virus particle formation, since a defect in Gag membrane binding results in severe impairment of viral particle production. To gain mechanistic details of Gag-lipid membrane interactions, in vitro methods based on NMR, protein footprinting, surface plasmon resonance, liposome flotation centrifugation, or fluorescence lipid bead binding have been developed thus far. However, each of these in vitro methods has its limitations. To overcome some of these limitations and provide a complementary approach to the previously established methods, we developed an in vitro assay in which interactions between HIV-1 Gag and lipid membranes take place in a &#34;cell-like&#34; environment. In this assay, Gag binding to lipid membranes is visually analyzed using YFP-tagged Gag synthesized in a wheat germ-based in vitro translation system and GUVs prepared by an electroformation technique. Here we describe the background and the protocols to obtain myristoylated full-length Gag proteins and GUV membranes necessary for the assay and to detect Gag-GUV binding by microscopy.

Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle GUV Membranes

We illustrate here an in vitro membrane binding assay in which interactions between HIV-1 Gag and lipid membranes are visually analyzed using YFP-tagged Gag synthesized in a wheat germ-based in vitro translation system and GUVs prepared by an electroformation technique.

Visualisation du VIH-1 Gag Reliure Giant unilamellaires vésiculaires (GUV) Membranes

The structural protein of HIV-1, Pr55Gag (or Gag), binds to the plasma membrane in cells during the virus assembly process. Membrane binding of Gag is an ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential to be used as drug therapies for HIV-1 infection. Post-integration inhibitors include ribozymes, short hairpin (sh) RNAs, small interfering (si) RNAs, U1 interference (U1i) RNAs and RNA aptamers. Many of these have been identified using transient co-transfection assays with an HIV-1 expression plasmid and some have advanced to clinical trials. In addition to measures of efficacy, small RNAs have been evaluated for their potential to affect the expression of human RNAs, alter cell growth and/or differentiation, and elicit innate immune responses. In the protocols described here, a set of transient transfection assays designed to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are described. We have used these assays to identify new ribozymes and optimize the format of shRNAs and siRNAs targeting HIV-1 RNA. The methods provide a quick set of assays that are useful for screening new anti-HIV-1 RNAs and could be adapted to screen other post-integration inhibitors of HIV-1 replication.

Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones.

Évaluation de l&#39;efficacité et la toxicité des ARNs Ciblage VIH-1 Production pour utilisation en thérapie génique ou des médicaments

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Phagosome Migration and Velocity Measured in Live Primary Human Macrophages Infected with HIV-1

Macrophages are phagocytic cells that play a major role at the crossroads between innate and specific immunity. They can be infected by the human immunodeficiency virus (HIV)-1 and because of their resistance to its cytopathic effects they can be considered to be persistent viral reservoirs. In addition, HIV-infected macrophages exhibit defective functions that contribute to the development of opportunistic diseases.
The exact mechanism by which HIV-1 impairs the phagocytic response of macrophages was unknown. We had previously shown that the uptake of various particulate material by macrophages was inhibited when they were infected with HIV-1. This inhibition was only partial and phagosomes did form within HIV-infected macrophages. Therefore, we focused on analyzing the fate of these phagosomes. Phagosome maturation is accompanied by migration of these compartments towards the cell center, where they fuse with lysosomes, generating phagolysosomes, responsible for degradation of the ingested material. We used IgG-opsonized Sheep Red Blood Cells as a target for phagocytosis. To measure the speed of centripetal movement of phagosomes in individual HIV-infected macrophages, we used a combination of bright field and fluorescence confocal microscopy. We established a method to calculate the distance of phagosomes towards the nucleus, and then to calculate the velocity of the phagosomes. HIV-infected cells were identified thanks to a GFP-expressing virus, but the method is applicable to non-infected cells or any type of infection or treatment.

We describe a method to measure the velocity of phagosomes moving towards the cell center in living cells infected with or without the human immunodeficiency virus (HIV) type 1, using spinning disk confocal fluorescence microscopy to identify fluorescent infected cells and bright field microscopy to detect phagosomes.