私たちは、設立とmStrawberry OP9細胞株のテストのためにU. Ganapatiに感謝。さらに、我々は、共培養でH. Shafifor彼女の援助に感謝。 HPは、国立心臓、肺、血液研究所（F31HL087714）（HP）からの交わりによってサポートされています。この作品の内容は、執筆者の責任であり、必ずしも国立心臓、肺、血液研究所や国立衛生研究所（NIH）の公式見解を表すものではありません。 UCLAのフローサイトメトリーコアファシリティーは、NIH（CA - 16042およびAI - 28697）、ジョンソンがんセンター、UCLAのエイズ研究所、および医学のUCLAの学校でサポートされています。

1。 ES細胞の調製<ol><li>特定の細胞株のための標準プロトコルにしたがって培養ES細胞。 0日目のためのmStrawberry OP9細胞の上にプレートするのに十分なES細胞を準備することを確認してください（ES細胞は、0日目に1cm 2当たり1 × 10 ^ 3細胞で播種されます） </li></ol> 2。 OP9細胞の調製<ol><li> mStrawberry OP9細胞を成長する前に、OP9増殖培地を準備 OP - 9細胞培養培地 <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> 在庫切れ </td><td> 最終濃度。 </td><td> 量（mL） </td></tr><tr><td> aMEM </td><td></td><td></td><td> 39.5 </td></tr><tr><td> FBS（OP - 9テスト済み） </td><td> 100パーセント</td><td> 20パーセント</td><td> 10 </td></tr><tr><td> L -グルタミン</td><td> 100X（200mmの） </td><td> 2mMの</td><td> 0.5 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 50mLの</td></tr></tbody></table> 準備の一週間以内に4℃と使用</li><li> mStrawberry OP9細胞を維持するために、メディアは2日ごとに変更する必要がありますし、細胞を前に（コンフルエント70から90パーセントで、サブカルチャー）コンフルエントに達した細胞の継代培養することがあります。 mStrawberry OP9細胞培養を越え​​て成長されることはありませんこのようなコンフルエント90％が脂肪細胞への分化になります。図3を参照してください。 <ol class="lalpha"><li> PBSで2倍の洗浄細胞による継代培養細胞（またはPBSで1 ×トリプシン- EDTAで+ 1 × 0.1％） </li><li> 37 予め温めておいた 0.1パーセントトリプシン- EDTAを追加℃で5分間（または細胞デタッチされるまで） </li><li>細胞がはがれるしたら、OP - 9増殖培地を加える。 50mLのコニカルチューブに細胞を移す。 </li><li>室温で5分間、300 xgで細胞をペレット化は。 上清を廃棄。 </li><li>新鮮なmStrawberry OP9増殖培地に懸濁し</li><li> 10 4細胞/ cm 2の最小密度で細胞をプレート</li><li>共培養したES細胞（0日、5日目、または実験のDay8 / 9）のために必要な日の前に3日間出発コンフルエントにmStrawberry OP9細胞を成長させる</li></ol></li></ol> 3。 ES / mStrawberry OP9共培養<ol><li>共培養の分化のメディアを準備します。 <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> 在庫切れ </td><td> 最終的な </td><td> 量（mL） </td></tr><tr><td> aMEM </td><td></td><td></td><td> 39.5 </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 100パーセント</td><td> 20パーセント</td><td> 10 </td></tr><tr><td> L -グルタミン</td><td> 200mmの</td><td> 2mMの</td><td> 0.5 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 50mLの</td></tr></tbody></table></li><li> mStrawberry OP9細胞（デイ-3） <ol class="lalpha"><li>常にその日-3でOP9細胞では、共培養の0日のためのmStrawberry OP9細胞のコンフルエントな層を持つように、サブカルチャー。図4bを参照してください。 0日目でコンフルエントのための1 × 10 4 / cm 2のプレートmStrawberry OP9細胞。 5日目と共培養の継続のため8日目/ 9サブカルチャーの余分な細胞にしてください。 </li></ol></li><li class="jove_content"> ES / mStrawberry OP9共培養のセットアップ（0日） <ol class="lalpha"><li class="jove_content"> PBSで2倍のES細胞を洗浄</li><li> 5分@ 37℃インキュベート、予め温めておいた0.25％トリプシン- EDTAでES細胞をトリプシン処理</li><li>細胞に共培養分化のメディアを追加します。 </li><li> 400xgでペレットES細胞、5 - 7分、RT。上清を捨てる</li><li>共培養分化培地中で細胞を再懸濁し</li><li> mStrawberry OP9細胞からメディアを削除する</li><li> mStrawberry OP9フラスコに共培養分化のメディアを追加します。 </li><li> mStrawberry OP9細胞のフラスコにプレート1 × 10 3 ES細胞/ cm 2である 。 37細胞をインキュベート° C、湿度5％CO 2を 。 </li></ol></li><li> mStrawberry OP9細胞（2日目） <ol class="lalpha"><li>サブカルチャーのmStrawberry OP9は、そのためには、共培養の5日目のためのmStrawberry OP9細胞のコンフルエント層を持っている。 5日目でコンフルエントのための1 × 10 4 / cm 2のプレートmStrawberryはOP9細胞（ステップ3.2として）。 8日目/ 9、必要に応じて（ステップ2.2のように）のためのサブカルチャーの余分な細胞にしてください。 </li></ol></li><li> ES / mStrawberry OP9共培養（3日目） <ol class="lalpha"><li>慎重に共存培養から培地を除去し、新鮮な共培養分化培地に交換してください</li></ol></li><li> ES / mStrawberry OP9共培養（5日目） <ol class="lalpha"><li>慎重にPBSで2倍の共培養を洗う</li><li>予め温めておいた0.25％トリプシン- EDTAで細胞をトリプシン処理</li><li>共培養の分化メディアを使用してフラスコから細胞を洗浄</li><li> 400xgで細胞をペレット化、7分、RTは。 上清を廃棄 </li><li>細胞に共培養分化のメディアを追加します。細胞を再懸濁させると、単一の細胞懸濁液のために確保するために21ゲージbluntended針を使用して、 </li><li>血球計算板を用いて細胞を数える。 0日目からのES細胞の数が100から150倍に増加している必要があります。 </li><li>再シード6.48x10 4 / cm 2と -コンフルエント、mStrawberry OP9細胞の新しい層の上に7.76x10 4 / cm 2と共培養細胞</li><li> 5日目アッセイ - 残りの共培養細胞はフローサイトメトリー分析、cytopreps（30K細胞）、ChIPアッセイなどに使用することができます。 </li></ol></li><li> ES / mStrawberry OP9共培養（日目8 / 9および12日目） <ol class="lalpha"><li>フラスコから分化のメディアを取り外し、保管します。懸濁液中の造血細胞を除去するためにPBSで洗浄単層1xは。 造血細胞を放り出すしないでください。 </li><li> 予め温めておいた 0.25％トリプシン- EDTAで接着細胞をトリプシン処理</li><li> ESの分化のメディアとのフラスコから細胞を洗浄し、サスペンション=で見つかった造血細胞に加える</li><li> 400xgで細胞をペレット化、7分、RTは。 上清を廃棄 </li><li> 細胞に共培養分化培地またはPBSを追加。細胞を再懸濁させると、血球計数器を用いて、単一の細胞懸濁液のカウントの細胞のために確保するために21ゲージbluntended針を使用してください。 </li><li>共培養は、12日目に再び8日または9で合流、mStrawberry OP9細胞の新しい層の上に再播種共培養細胞がより成熟した造血前駆細胞を評価し、14日間継続することができます。検定の日に必要な細胞の回復に基づいて再シード最適化されたセルの数。 </li></ol></li><li> ES由来の子孫（日1-14）の評価。 ES由来の子孫はmStrawberry陰性細胞（ES由来の子孫）選別の流れによって共培養のどの曜日でも評価することができます。 <ol class="lalpha"><li>フラスコから分化のメディアを取り外し、保管します。懸濁液中の造血細胞を除去するためにPBSで単層1 ×を洗ってください。造血細胞を投げてはいけません。 </li><li>予め温めておいた0.25％トリプシン- EDTAで接着細胞をトリプシン処理</li><li>共培養の分化のメディアとのフラスコから細胞を洗浄し、懸濁液に見られる造血細胞に加える</li><li> 400xgで細胞をペレット化、7分、RT。上清を捨てる</li><li> 21ゲージbluntended針とカウントで再懸濁し、細胞</li><li> ES由来の子孫は、（mStrawberry陰性細胞）mStrawberry正OP9細胞からソートされたフローすることができます。 ES由来の子孫は、その後、フローサイトメトリー解析、cytopreps、ChIPアッセイ、等によって特徴付けることができます。 </li></ol></li></ol> 4。代表的な結果： <img src="/files/ftp_upload/2559/2559fig1.jpg" alt="図1" /> 図1。 ES / mStrawberry OP9共培養系。私たちの研究室では造血開発をモデル化するためにin vitroで ES細胞共培養系で使用しています。 mStrawberry OP9細胞のコンフルエントな層に配置する場合は、この共培養系では、ES細胞は、Day5でhemangioblastsに、分化する。分化した造血系統は14日目で見えるけれども共培養が進行すると、造血前駆細胞は、8日目で存在している。必要にmStrawberry OP9細胞の新たな融合性層の上に、ES由来の子孫を継代するときの矢印は、分化の日数を示している。 <img src="/files/ftp_upload/2559/2559fig2.jpg" alt="図2" /> 図2。適切なES細胞の分化 。 ES細胞は、0日mStrawberry OP9のコンフルエント層上に播種されています。 ES由来の子孫は、ES由来の子孫が定義されている境界線を持つ細胞のクラスターのように見えるか渦巻きパターンを形成し始めて、分化の3日目で見えるようになるし始める。 5日目で細胞の渦巻きを積み上げたとして内皮および造血系統のための一般的な中胚葉前駆体であるHemangioblastsは、表示されるはずです。五日以上の共培養の期間については、ES由来の子孫は、造血細胞のクラスターとして表示されます。 2〜4単細胞のクラスターは、日6月7日で、表示されるはずと共培養の8 / 9日間で大規模な細胞クラスターに成長する。他のES由来の子孫にもしっかりと接着間質細胞層にバインドされ見られる。 <img src="/files/ftp_upload/2559/2559fig3.jpg" alt="図3" /> 図3。失敗したES細胞の分化。この共培養の結果から、不適切なES細胞の分化を反映している。 ES由来の後代が5日目で渦巻き模様に表示されていないか注意してください。渦巻き模様の細胞の欠如は、不適切な血管芽細胞の形成を示している。血管芽細胞が正常に発達しない場合には、共培養の継続は、発育を妨げ造血系の細胞分化になります。不適切な血管芽細胞の形成を伴う共培養は破棄されるべきである。 <img src="/files/ftp_upload/2559/2559fig4.jpg" alt="図4" /> 図4。 mStrawberry OP9細胞培養。（）mStrawberry OP9細胞がで継代培養されていますコンフルエントに70から90パーセント。 （B）適切な分化、ES細胞やES由来の子孫はmStrawberry OP9細胞の過度に密集​​層の上に配置されます。 <img src="/files/ftp_upload/2559/2559fig5.jpg" alt="図5" /> 図5。代表的なES / mStrawberry OP9共培養フローのプロファイル。すべてのES由来の子孫はmStrawberry陰性細胞であるとmStrawberry OP9細胞からソートされたフローすることができます。 mStrawberry陰性細胞のゲートは、従来のES/OP9共培養を用いて決定した。

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	<li>Baron, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+origins+of+mammalian+hematopoiesis.">Embryonic origins of mammalian hematopoiesis.</a> Exp Hematol. 31, 1160-1160 (2003).</li><li>Baron, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+patterning+of+the+mouse+embryo:+implications+for+hematopoietic+commitment+and+differentiation.">Early patterning of the mouse embryo: implications for hematopoietic commitment and differentiation.</a> Exp Hematol. 33, 1015-1015 (2005).</li><li>Baron, M. H., Fraser, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+specification+of+early+hematopoiesis+in+the+mammal.">The specification of early hematopoiesis in the mammal.</a> Curr Opin Hematol. 12, 317-317 (2005).</li><li>Desbaillets, I., Ziegler, U., Groscurth, P., Gassmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryoid+bodies:+an+in+vitro+model+of+mouse+embryogenesis.">Embryoid bodies: an in vitro model of mouse embryogenesis.</a> Exp Physiol. 85, 645-645 (2000).</li><li>Ganapati, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+notch+signaling+in+normal+and+neoplastic+hematopoiesis:+global+gene+expression+profiling+in+response+to+activated+notch+expression.">Modeling notch signaling in normal and neoplastic hematopoiesis: global gene expression profiling in response to activated notch expression.</a> Stem Cells. 25, 1872-1872 (2007).</li><li>Hogan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manipulating the mouse embryo : a laboratory manual. , (1994).</li><li>Keller, G., Kennedy, M., Papayannopoulou, T., Wiles, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+commitment+during+embryonic+stem+cell+differentiation+in+culture.">Hematopoietic commitment during embryonic stem cell differentiation in culture.</a> Mol Cell Biol. 13, 473-473 (1993).</li><li>Keller, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+differentiation+of+embryonic+stem+cells.">In vitro differentiation of embryonic stem cells.</a> Curr Opin Cell Biol. 7, (1995).</li><li>Nakano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphohematopoietic+development+from+embryonic+stem+cells+in+vitro.">Lymphohematopoietic development from embryonic stem cells in vitro.</a> Semin Immunol. 7, 862-862 (1995).</li><li>Nakano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+development+of+hematopoietic+system+from+mouse+embryonic+stem+cells:+a+new+approach+for+embryonic+hematopoiesis.">In vitro development of hematopoietic system from mouse embryonic stem cells: a new approach for embryonic hematopoiesis.</a> Int J Hematol. 65, 1-1 (1996).</li><li>Nakano, T., Kodama, H., Honjo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+lymphohematopoietic+cells+from+embryonic+stem+cells+in+culture.">Generation of lymphohematopoietic cells from embryonic stem cells in culture.</a> Science. 265, 1098-1098 (1994).</li><li>Turksen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Embryonic stem cells : methods and protocols. , (2002).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

共培養の5日目におけるFlk1 +のhemangioblastsの生産でmStrawberry OP9細胞の結果のコンフルエント層上にES細胞の適切な分化。 Hemangioblastsは、図1に観察された細胞の渦巻きを、積み上げた表示されます。共培養の残りの部分では、目に見えるES由来の子孫は、造血細胞のクラスター（図1）として表示されます。 Day6 / 7二から四時に細胞クラスターが表示され、その共培養の8 / 9日間で大規模な細胞クラスター（接着及び懸濁液中の両方）に成長する。他のES由来の子孫にもしっかりと接着間質細胞層内にバインドされていますされています。 プロトコールに記載されていないものの、それは、FBSは、ESの増殖培地、mStrawberry OP9増殖培地およびES / mStrawberry OP9分化のメディアで使用される事前テストに不可欠です。適切にテストされた血清は、分化の5日目までは、共培養におけるES細胞の適切な分化をmStrawberry OP9細胞の適切な成長を確保するだけでなく、してください。代替として、またはmStrawberry OP9細胞に加えて、OP9細胞は、前（7.8x10 4細胞/ cm 2）コンフルエントで播種する、8000ラドで、照射することができる。 OP9細胞の照射は、繰り返し再播種ステップの排除を可能にする、だけでなく、下流のアッセイからOP9細胞を汚染、古いのほぼ完全な排除が可能になります。 OP9細胞は、CMVプロモーターの制御（pRRLsin - CMVベクター、UCLAベクトルコア）の下にレンチウイルスベクターを発現するmStrawberryの3ug/mLとOP​​9細胞を形質導入することによってmStrawberryタンパク質を発現するように設計されました。 標準ES/OP9共培養のプロトコルは、細胞の継代からOP9細胞を汚染し、古い減らすために、同様に、コンフルエント層OP9細胞上に5日目再播種のステップをES細胞の配置を伴う。さらに、懸濁液中に見られるだけ造血細胞は、ES由来の子孫を評価するために削除されます。しかし、再播種ステップとだけ浮遊細胞の収穫両方では、ある者は、潜在的に開発し、ES由来の造血細胞のかなりの数をミス。この問題は、ノックアウトESラインに関連付けられている造血欠陥を特徴付けるしようとしたときに対処することが重要になります。この問題を回避するために、私たちの研究室はmStrawberry発現OP9細胞を使用して、修正された共培養を使用。これは、すべてのESの子孫は5日目、およびダウンストリームアッセイのためのすべてのES由来の子孫の収穫のために継続的に共培養するために転送されることを保証します。この変更は、ヒトとマウスのESラインの両方に由来する造血子孫の評価および特性評価に便利なツールを提供しています。 様々な段階プリミティブと決定的な造血このES - mStrawberry OP9共培養モデルを反復する。造血開発の初期段階の研究に、多くの人々は、ES細胞から血管芽細胞の発達を評価するBL - CFC（コロニー形成細胞ブラストのような）アッセイを、使用してください。初期造血開発を調査する際BL - CFCアッセイはmStrawberry - ESの共培養システム、便利なツールですが、それは血管芽細胞の評価を可能にするため、同様に、より多くの成人の造血系統を増加ユーティリティを示す。 伝統的なOP9/ESとEBの分化プロトコルを使用して前の仕事は、HoxB4の過剰発現など、多分必要な追加の因子がin vitroでの長期的なデータの再読込み造血幹細胞を導出するためにことを示している。追加作業はmStrawberry負、ソートされたES由来の集団が、真の造血幹細胞が含まれているかどうか評価する必要がある。

OP - 9細胞の維持培地ストックコンポーネント<table border="1"><tbody><tr><td>試薬の名前</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td> aMEM </td><td>インビトロジェン</td><td> 12571-063 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td>オメガサイエンティフィック</td><td> FB01 </td><td>事前テスト</td></tr><tr><td> L -グルタミン</td><td> Cellgro </td><td> 25から005 - CI </td><td> 200nmの </td></tr><tr><td>トリプシン- EDTA </td><td>セル技術を幹</td><td> 07901 </td><td></td></tr></tbody></table> ES/OP-9細胞の分化培地ストックコンポーネント<table border="1"><tbody><tr><td>試薬の名前</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td> aMEM </td><td>インビトロジェン</td><td> 12571-063 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Hyclone </td><td> SH30070 </td><td>事前テスト</td></tr><tr><td> L -グルタミン</td><td> Cellgro </td><td> 25から005 - CI </td><td> 200mmの</td></tr><tr><td> PBS（のCa 2 +及びMg 2 +なし） </td><td> Cellgro </td><td> 21から031 - CV </td><td></td></tr><tr><td>トリプシン- EDTA </td><td>セル技術を幹</td><td> 07901 </td><td></td></tr></tbody></table>

modified es / op9 co-culture protocol provides enhanced characterization of hematopoietic progeny

生体内および胚lethalitiesを扱うことなく、造血に関与する最も早い遺伝子を特徴づけるためのアクセスが困難な細胞集団を研究するときに造血細胞の運命に向かってES細胞のin vitroにおける分化と便利です。 OP9ストローマ細胞株が機能的なM - CSFを欠いている大理石骨病変異マウスの頭蓋冠から派生しているとしてES/OP9共培養系は、もともと、マクロファージの過剰産生することなく、造血子孫を生成するように設計されました。 体外 ES/OP9共培養系における初期造血発展を再現するために使用することができます。 OP9ストローマ細胞上で培養した場合、ES細胞は、FLK - 1 + hemangioblasts、造血前駆細胞、そして最終的に成熟し、最終分化の系統に分化する。標準ES/OP9共培養プロトコルは、OP9細胞のコンフルエントな層の上にES細胞の配置を伴う;だけでなく、定期的な再播種の手順を古い除去するためには、OP9細胞を汚染する。さらに、現在のプロトコルは、造血細胞懸濁液中に発見され、分化の毎日で、ES由来の子孫の評価用に最適化されていないを評価伴います。しかし、再播種ステップとだけ浮遊細胞の収穫では、ある者は、潜在的にES由来の子孫と発展途上造血細胞の大部分をミス。この問題は、ノックアウトESラインに関連付けられている造血欠陥を特徴付けるしようとしたときに対処することが重要になります。ここでは、ダウンストリームアッセイからOP9細胞を汚染の除去を可能にする改変ES / mStrawberry OP9共培養を、説明します。このメソッドは、より直接的に胚内で観察された造血分化のパターンに対応する造血分化のパターン、その結果、共培養のすべての日ですべてのES由来の子孫を完全に評価することができます。

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Modified ES / OP9 Co-Culture Protocol Provides Enhanced Characterization of Hematopoietic Progeny

mStrawberry OP9細胞は共培養からすべてのES由来の子孫の完全な評価が可能になります。

修正されたES / OP9共培養のプロトコルは、造血後代の強化された特性を提供します。

The in vitro differentiation of ES cells towards a hematopoietic cell fate is useful when studying cell populations that are difficult to access in vivo ...

modified-es-op9-co-culture-protocol-provides-enhanced

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

20.6K ビュー.  University of California, Los Angeles. mStrawberry OP9細胞は共培養からすべてのES由来の子孫の完全な評価が可能になります。

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Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are derived from the blastocyst of the early embryo and are pluripotent in differentiative ability.  Their vast differentiative potential has made them the focus of much research centered on deducing how to coax them to generate clinically useful cell types.  The successful derivation of hematopoietic stem cells (HSC) from mouse ESC has recently been accomplished and can be visualized in this video protocol.  HSC, arguably the most clinically exploited cell population, are used to treat a myriad of hematopoietic malignancies and disorders.  However, many patients that might benefit from HSC therapy lack access to suitable donors.  ESC could provide an alternative source of HSC for these patients.  The following protocol establishes a baseline from which ESC-HSC can be studied and inform efforts to isolate HSC from human ESC.  In this protocol, ESC are differentiated as embryoid bodies (EBs) for 6 days in commercially available serum pre-screened for optimal hematopoietic differentiation.  EBs are then dissociated and infected with retroviral HoxB4.  Infected EB-derived cells are plated on OP9 stroma, a bone marrow stromal cell line derived from the calvaria of  M-CSF-/- mice, and co-cultured in the presence of hematopoiesis promoting cytokines for ten days.  During this co-culture, the infected cells expand greatly, resulting in the generation a heterogeneous pool of 100s of millions of cells.  These cells can then be used to rescue and reconstitute lethally irradiated mice.

This protocol details the derivation of transplantable hematopoietic stem cells from mouse embryonic stem cells (ESC) and their subsequent injection into lethally irradiated recipient mice. Briefly, ESC are differentiated as embryoid bodies, which are then infected with retroviral HoxB4 and co-cultured with OP9 stromal cells and hematopoietic cytokines.

マウス胚性幹細胞から造血幹細胞の導出

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

生物学

Initiating Differentiation in Immortalized Multipotent Otic Progenitor Cells

Use of human induced pluripotent stem cells (iPSC) or embryonic stem cells (ESC) for cell replacement therapies holds great promise. Several limitations including low yields and heterogeneous populations of differentiated cells hinder the progress of stem cell therapies. A fate restricted immortalized multipotent otic progenitor (iMOP) cell line was generated to facilitate efficient differentiation of large numbers of functional hair cells and spiral ganglion neurons (SGN) for inner ear cell replacement therapies. Starting from dissociated cultures of single iMOP cells, protocols that promote cell cycle exit and differentiation by basic fibroblast growth factor (bFGF) withdrawal were described. A significant decrease in proliferating cells after bFGF withdrawal was confirmed using an EdU cell proliferation assay. Concomitant with a decrease in proliferation, successful differentiation resulted in expression of molecular markers and morphological changes. Immunostaining of Cdkn1b (p27KIP) and Cdh1 (E-cadherin) in iMOP-derived otospheres was used as an indicator for differentiation into inner ear sensory epithelia while immunostaining of Cdkn1b and Tubb3 (neuronal &#946;-tubulin) was used to identify iMOP-derived neurons. Use of iMOP cells provides an important tool for understanding cell fate decisions made by inner ear neurosensory progenitors and will help develop protocols for generating large numbers of iPSC or ESC-derived hair cells and SGNs. These methods will accelerate efforts for generating otic cells for replacement therapies.

The current protocols to maintain immortalized multipotent otic progenitor (iMOP) cells and otic differentiation are described. Culture conditions and molecular markers that indicate differentiation into sensory epithelia and spiral ganglion neurons (SGN) are highlighted.

不死化多能耳の前駆細胞に分化を開始

Use of human induced pluripotent stem cells (iPSC) or embryonic stem cells (ESC) for cell replacement therapies holds great promise. Several limitations ...

発生生物学

Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with Transcription Factors to Induce a Hemogenic Program

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We first designed a reporter screen using MEFs from human CD34-tTA/TetO-H2BGFP (34/H2BGFP) double transgenic mice. CD34+ cells from these mice label H2B histones with GFP, and cease labeling upon addition of doxycycline (DOX). MEFS were transduced with candidate TFs and then observed for the emergence of GFP+ cells that would indicate the acquisition of a hematopoietic or endothelial cell fate. Starting with 18 candidate TFs, and through a process of combinatorial elimination, we obtained a minimal set of factors that would induce the highest percentage of GFP+ cells. We found that Gata2, Gfi1b, and cFos were necessary and the addition of Etv6 provided the optimal induction. A series of gene expression analyses done at different time points during the reprogramming process revealed that these cells appeared to go through a precursor cell that underwent an endothelial to hematopoietic transition (EHT). As such, this reprogramming process mimics developmental hematopoiesis "in a dish," allowing study of hematopoiesis in vitro and a platform to identify the mechanisms that underlie this specification. This methodology also provides a framework for translation of this work to the human system in the hopes of generating an alternative source of patient-specific hematopoietic stem cells (HSCs) for a number of applications in the treatment and study of hematologic diseases.

The protocol described here details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts via overexpression of a minimal set of transcription factors. This technology may be translated to the human system to provide platforms for future study of hematopoiesis, hematologic disease, and hematopoietic stem cell transplant.

転写因子との再プログラミングマウス胚線維芽細胞造血プログラムを誘導するために

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem cells (hPSCs). Until recently, efforts to differentiate hPSCs into HSCs have predominantly generated hematopoietic progenitors that lack HSC potential, and instead resemble yolk sac hematopoiesis.&#160;These resulting hematopoietic progenitors may have limited utility for in vitro disease modeling of various adult hematopoietic disorders, particularly those of the lymphoid lineages. However, we have recently described methods to generate erythro-myelo-lymphoid multilineage definitive hematopoietic progenitors from hPSCs using a stage-specific directed differentiation protocol, which we outline here. Through enzymatic dissociation of hPSCs on basement membrane matrix-coated plasticware, embryoid bodies (EBs) are formed. EBs are differentiated to mesoderm by recombinant BMP4, which is subsequently specified to the definitive hematopoietic program by the GSK3&#946; inhibitor, CHIR99021. Alternatively, primitive hematopoiesis is specified by the PORCN inhibitor, IWP2. Hematopoiesis is further driven through the addition of recombinant VEGF and supportive hematopoietic cytokines. The resulting hematopoietic progenitors generated using this method have the potential to be used for disease and developmental modeling, in vitro.

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, used to differentiate hPSCs into CD34+ hematopoietic progenitors. This method uses stage-specific manipulation of canonical WNT signaling to specify cells exclusively to either the definitive or primitive hematopoietic program.

ひと多能性幹細胞からプリミティブかつ決定的な造血前駆細胞の分化を監督

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Clonal Analysis of Embryonic Hematopoietic Stem Cell Precursors Using Single Cell Index Sorting Combined with Endothelial Cell Niche Co-culture

The ability to study hematopoietic stem cell (HSC) genesis during embryonic development has been limited by the rarity of HSC precursors in the early embryo and the lack of assays that functionally identify the long-term multilineage engraftment potential of individual putative HSC precursors. Here, we describe methodology that enables the isolation and characterization of functionally validated HSC precursors at the single cell level. First, we utilize index sorting to catalog the precise phenotypic parameter of each individually sorted cell, using a combination of phenotypic markers to enrich for HSC precursors with additional markers for experimental analysis. Second, each index-sorted cell is co-cultured with vascular niche stroma from the aorta-gonad-mesonephros (AGM) region, which supports the maturation of non-engrafting HSC precursors to functional HSC with multilineage, long-term engraftment potential in transplantation assays. This methodology enables correlation of phenotypic properties of clonal hemogenic precursors with their functional engraftment potential or other properties such as transcriptional profile, providing a means for the detailed analysis of HSC precursor development at the single cell level.

Here we present methodology for the clonal analysis of hematopoietic stem cell precursors during murine embryonic development. We combine index sorting of single cells from the embryonic aorta-gonad-mesonephros region with endothelial cell co-culture and transplantation to characterize the phenotypic properties and engraftment potential of single hematopoietic precursors.

並べ替え内皮細胞ニッチ共培養と組み合わせて 1 つのセル インデックスを使用して胚性造血幹細胞前駆体のクローン解析

The ability to study hematopoietic stem cell (HSC) genesis during embryonic development has been limited by the rarity of HSC precursors in the early ...

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic progenitors of both mouse and human origin. It is now used to address a growing variety of complex genetic, cellular and molecular questions related to hematopoiesis, and is at the cutting edge of efforts to translate these basic findings to therapeutic applications. The procedures are straightforward and routinely yield robust results. However, achieving successful hematopoietic differentiation in vitro requires special attention to the details of reagent and cell culture maintenance. Furthermore, the protocol features technique sensitive steps that, while not difficult, take care and practice to master. Here we focus on the procedures for differentiation of T lymphocytes from mouse embryonic stem cells (mESC). We provide a detailed protocol with discussions of the critical steps and parameters that enable reproducibly robust cellular differentiation in vitro. It is in the interest of the field to consider wider adoption of this technology, as it has the potential to reduce animal use, lower the cost and shorten the timelines of both basic and translational experimentation.

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

Mouse embryonic stem cells can be differentiated to T cells in vitro using the OP9-DL1 co-culture system. Success in this procedure requires careful attention to reagent/cell maintenance, and key technique sensitive steps. Here we discuss these critical parameters and provide a detailed protocol to encourage adoption of this technology.

T細胞の導出<em&gt;体外</em&gt;マウス胚性幹細胞からの

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic ...

免疫・感染学

Co-Culture and Transduction of Murine Thymocytes on Delta-Like 4-Expressing Stromal Cells to Study Oncogenes in T-Cell Leukemia

Transduced mouse immature thymocytes can be differentiated into T cells&#160;in vitro&#160;using the delta-like 4-expressing bone marrow stromal cell line co-culture system (OP9-DL4). As retroviral transduction requires dividing cells for transgene integration, OP9-DL4 provides a suitable in vitro environment for cultivating hematopoietic progenitor cells. This is particularly advantageous when studying the effects of the expression of a specific gene during normal T cell development and leukemogenesis, as it allows researchers to circumvent the time-consuming process of generating transgenic mice. To achieve successful outcomes, a series of coordinated steps involving the simultaneous manipulation of different types of cells must be carefully performed. Although these are very well-established procedures, the lack of a common source in the literature often means a series of optimizations are required, which can be time-consuming. This protocol has been shown to be efficient in transducing primary thymocytes followed by differentiation on OP9-DL4 cells. Detailed here is a protocol that can serve as a quick and optimized guide for the co-culture of retrovirally transduced thymocytes on OP9-DL4 stromal cells.

This protocol describes the isolation of double-negative thymocytes from the mouse thymus followed by retroviral transduction and co-culture on the delta-like 4-expressing bone marrow stromal cell line co-culture system (OP9-DL4) for further functional analysis.

T細胞白血病における癌遺伝子研究のためのデルタ様4発現間質細胞上でのマウス胸腺細胞の共培養と形質導入

Transduced mouse immature thymocytes can be differentiated into T cells&#160;in vitro&#160;using the delta-like 4-expressing bone marrow stromal cell line ...

がん研究

Identification and Isolation of Oligopotent and Lineage-committed Myeloid Progenitors from Mouse Bone Marrow

Myeloid progenitors that yield neutrophils, monocytes and dendritic cells (DCs) can be identified in and isolated from the bone marrow of mice for hematological and immunological analyses. For example, studies of the cellular and molecular properties of myeloid progenitor populations can reveal mechanisms underlying leukemic transformation, or demonstrate how the immune system responds to pathogen exposure. Previously described flow cytometry strategies for myeloid progenitor identification have enabled significant advances in many fields, but the fractions they identify are very heterogeneous. The most commonly used gating strategies define bone marrow fractions that are enriched for the desired populations, but also contain large numbers of &#34;contaminating&#34; progenitors. Our recent studies have resolved much of this heterogeneity, and the protocol we present here permits the isolation of 6 subpopulations of oligopotent and lineage-committed myeloid progenitors from 2 previously described bone marrow fractions. The protocol describes 3 stages: 1) isolation of bone marrow cells, 2) enrichment for hematopoietic progenitors by magnetic-activated cell sorting (lineage depletion by MACS), and 3) identification of myeloid progenitor subsets by flow cytometry (including fluorescence-activated cell sorting, FACS, if desired). This approach permits progenitor quantification and isolation for a variety of in vitro and in vivo applications, and has already yielded novel insight into pathways and mechanisms of neutrophil, monocyte, and DC differentiation.

We demonstrate how to identify and isolate 6 subsets of myeloid progenitors from murine bone marrow using a combination of magnetic and fluorescence sorting (MACS and FACS). This protocol can be used for in vitro culture assays (methylcellulose or liquid cultures), in vivo adoptive transfer experiments, and RNA/protein analyses.

寡能性と系列拘束されたマウスの骨髄から骨髄前駆細胞の分離と同定

Myeloid progenitors that yield neutrophils, monocytes and dendritic cells (DCs) can be identified in and isolated from the bone marrow of mice for ...

Simultaneous Assessment of Kinship, Division Number, and Phenotype via Flow Cytometry for Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

Few techniques can assess phenotype and fate for the same cell simultaneously. Most of the current protocols used to characterize phenotype, although able to generate large datasets, necessitate the destruction of the cell of interest, making it impossible to assess its functional fate. Heterogeneous biological differentiating systems like hematopoiesis are therefore difficult to describe. Building on cell division tracking dyes, we further developed a protocol to simultaneously determine kinship, division number, and differentiation status for many single hematopoietic progenitors. This protocol allows the assessment of the ex vivo differentiation potential of murine and human hematopoietic progenitors, isolated from various biological sources. Moreover, as it is based on flow cytometry and a limited number of reagents, it can quickly generate a large amount of data, at the single-cell level, in a relatively inexpensive manner. We also provide the analytical pipeline for single-cell analysis, combined with a robust statistical framework. As this protocol allows the linking of cell division and differentiation at the single-cell level, it can be used to quantitatively assess symmetric and asymmetric fate commitment, the balance between self-renewal and differentiation, and the number of divisions for a given commitment fate. Altogether, this protocol can be used in experimental designs aiming to unravel the biological differences between hematopoietic progenitors, from a single-cell perspective.

Simultaneous Assessment of Kinship, Division Number, and Phenotype via Flow Cytometry for Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

Presented here is a flow cytometry-based technique that allows for simultaneously measuring the number of cell divisions, surface cell phenotype, and cellular kinship. Those properties can be tested statistically using a permutation-based framework.

フローサイトメトリー による 造血幹細胞と前駆細胞の血縁関係、分裂数、表現型の同時評価

Few techniques can assess phenotype and fate for the same cell simultaneously. Most of the current protocols used to characterize phenotype, although able ...

Utilizing Low Oxygen Tension to Reduce Hematopoietic Cells in Murine Bone Marrow Stromal Cell Cultures

Currently, there remains a lack of universally accepted markers to prospectively isolate a homogeneous population of skeletal stem cells (SSCs). For this reason, BMSCs, which support hematopoiesis and contribute to all the functions of the skeleton, continue to be widely used to study multipotent mesenchymal progenitors (MMPs) and to infer SSC function. Moreover, given the breadth of transgenic murine models used to study musculoskeletal diseases, the use of BMSCs also serves as a powerful tool to examine the molecular mechanisms regulating MMPs and SSCs. However, common isolation procedures for murine BMSCs result in over 50% of recovered cells being of hematopoietic origins, potentially hindering the interpretation of the data generated during these studies. Here, we describe a method using low oxygen tension or hypoxia for the selective elimination of CD45+ cells in BMSC cultures. Importantly, this method can be easily implemented to not only reduce hemopoietic contaminants but to also enhance the percentage of MMPs and putative SSCs in BMSC cultures.

A routine culture of bone marrow stromal cells (BMSCs) leads to the isolation of heterogeneous cell populations, with many cells being of hematopoietic origins. Here, we describe a method that utilizes low oxygen tension to greatly reduce hematopoietic contaminants in murine BMSC cultures.

Currently, there remains a lack of universally accepted markers to prospectively isolate a homogeneous population of skeletal stem cells (SSCs). For this ...

修正されたES / OP9共培養のプロトコルは、造血後代の強化された特性を提供します。

要約

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この動画の章

マウス胚性幹細胞から造血幹細胞の導出

不死化多能耳の前駆細胞に分化を開始

転写因子との再プログラミングマウス胚線維芽細胞造血プログラムを誘導するために

ひと多能性幹細胞からプリミティブかつ決定的な造血前駆細胞の分化を監督

並べ替え内皮細胞ニッチ共培養と組み合わせて 1 つのセルインデックスを使用して胚性造血幹細胞前駆体のクローン解析

T細胞の導出

T細胞白血病における癌遺伝子研究のためのデルタ様4発現間質細胞上でのマウス胸腺細胞の共培養と形質導入

寡能性と系列拘束されたマウスの骨髄から骨髄前駆細胞の分離と同定

フローサイトメトリーによる造血幹細胞と前駆細胞の血縁関係、分裂数、表現型の同時評価

Utilizing Low Oxygen Tension to Reduce Hematopoietic Cells in Murine Bone Marrow Stromal Cell Cultures

修正されたES / OP9共培養のプロトコルは、造血後代の強化された特性を提供します。

要約

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マウス胚性幹細胞から造血幹細胞の導出

不死化多能耳の前駆細胞に分化を開始

転写因子との再プログラミングマウス胚線維芽細胞造血プログラムを誘導するために

ひと多能性幹細胞からプリミティブかつ決定的な造血前駆細胞の分化を監督

並べ替え内皮細胞ニッチ共培養と組み合わせて 1 つのセル インデックスを使用して胚性造血幹細胞前駆体のクローン解析

T細胞の導出

T細胞白血病における癌遺伝子研究のためのデルタ様4発現間質細胞上でのマウス胸腺細胞の共培養と形質導入

寡能性と系列拘束されたマウスの骨髄から骨髄前駆細胞の分離と同定

フローサイトメトリー による 造血幹細胞と前駆細胞の血縁関係、分裂数、表現型の同時評価

Utilizing Low Oxygen Tension to Reduce Hematopoietic Cells in Murine Bone Marrow Stromal Cell Cultures

並べ替え内皮細胞ニッチ共培養と組み合わせて 1 つのセルインデックスを使用して胚性造血幹細胞前駆体のクローン解析

フローサイトメトリーによる造血幹細胞と前駆細胞の血縁関係、分裂数、表現型の同時評価