Agradecemos a U. Ganapati para a criação e testes da linha celular mStrawberry OP9. Além disso, agradecemos H. Shafifor sua assistência com o co-cultura. HP é apoiado por uma bolsa do Instituto Nacional do Coração, Pulmão e Sangue (F31HL087714) (HP). O conteúdo deste trabalho é da exclusiva responsabilidade do autor e não representam, necessariamente, a posição oficial do Instituto Nacional do Coração, Pulmão e Sangue ou o National Institutes of Health (NIH). O Fluxo UCLA Facility Núcleo Citometria é suportado pelo NIH (CA-16042 e AI-28697), o Jonsson Cancer Center, da UCLA AIDS Institute, e da Escola de Medicina da UCLA.

1. Preparação de células-tronco embrionárias <ol><li> Cultura de células ES de acordo com protocolo padrão para sua linha de celular particular. Certifique-se de preparar células ES suficiente para chapa para do mStrawberry OP9 células para o dia 0 (células-tronco embrionárias será banhado em 1x10 ^ 3 células por cm 2 no Dia 0) </li></ol> 2. Preparação de células OP9 <ol><li> Antes de crescimento mStrawberry OP9 células, preparar o OP9 meios de crescimento OP-9 meio de cultura celular <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Estoque </td><td> Conc final. </td><td> Volume (mL) </td></tr><tr><td> AMEM </td><td></td><td></td><td> 39,5 </td></tr><tr><td> FBS (OP-9 testado) </td><td> 100% </td><td> 20% </td><td> 10 </td></tr><tr><td> L-glutamina </td><td> 100X (200mm) </td><td> 2mM </td><td> 0,5 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 50mL </td></tr></tbody></table> Armazenar a 4 ° C e usar dentro de uma semana de preparação </li><li> A fim de manter mStrawberry OP9 células, meios de comunicação devem ser trocados a cada dois dias e células devem ser repicadas antes de atingir células confluência (subcultura em 70-90% confluência). mStrawberry OP9 culturas de células são cultivadas nunca além de 90% confluência como isso irá resultar em sua diferenciação em adipócitos. Veja a Figura 3. <ol class="lalpha"><li> Subcultura células por células de lavar 2X com PBS (1x ou com PBS 1x + 0,1% com Tripsina-EDTA) </li><li> Adicionar pré-aquecido 0,1% Tripsina-EDTA a 37 ° C por 5 minutos (ou até retirar células) </li><li> Quando as células têm destacado, adicione OP-9 meio de crescimento. Transferência de células para um tubo de 50 ml cônico. </li><li> Células pelota a 300 xg por 5 minutos em temperatura ambiente. Elimine o sobrenadante. </li><li> Ressuspender as células em fresco mStrawberry OP9 meios de crescimento </li><li> Células em placas a uma densidade mínima de 10 4 células / cm 2 </li><li> Crescer mStrawberry OP9 células a confluência de partida três dias antes do dia necessários para o cultivo de células co-ES (dia 0, dia 5, ou dia8 / 9 do experimento) </li></ol></li></ol> 3. ES / mStrawberry OP9 Co-cultura <ol><li> Prepare media Co-cultura de diferenciação <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Estoque </td><td> Final </td><td> Volume (mL) </td></tr><tr><td> AMEM </td><td></td><td></td><td> 39,5 </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 100% </td><td> 20% </td><td> 10 </td></tr><tr><td> L-glutamina </td><td> 200mM </td><td> 2mM </td><td> 0,5 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 50mL </td></tr></tbody></table></li><li> mStrawberry OP9 células (dia -3) <ol class="lalpha"><li> SEMPRE Subculture OP9 células em -3 Dia, para que você tenha camadas confluentes de células mStrawberry OP9 para 0 Dia da co-cultura. Ver Figura 4b. Placa mStrawberry OP9 células em 1x10 4 cm / 2 para confluência no Dia 0. Certifique-se de subcultura células extra para o dia 5 e dia 09/08 para o prosseguimento da co-cultura. </li></ol></li><li class="jove_content"> ES / mStrawberry OP9 co-cultura-Set-Up (Dia 0) <ol class="lalpha"><li class="jove_content"> Lave as células ES 2x com PBS </li><li> Trypsinize células-tronco embrionárias com pré-aquecido 0,25% de tripsina-EDTA, incubar por 5 min @ 37 ° C </li><li> Adicionar mídia Co-cultura de diferenciação para as células </li><li> Pellet células ES em 400xg, 5-7min, RT. Elimine o sobrenadante </li><li> Ressuspender as células em meios de co-cultura de diferenciação </li><li> Remova a mídia da mStrawberry OP9 células </li><li> Adicionar mídia Co-cultura de diferenciação para frascos mStrawberry OP9 </li><li> Placa de 1x10 3 células ES / cm 2 no balão da mStrawberry OP9 células. Incubar as células a 37 ° C, 5% CO 2 com a umidade. </li></ol></li><li> mStrawberry OP9 células (dia 2) <ol class="lalpha"><li> MStrawberry subcultura OP9 para que você tenha camadas confluentes de células mStrawberry OP9 para o dia 5 de co-cultura. Placa mStrawberry OP9 células em 1x10 4 cm / 2 para confluência no dia 5 (como no passo 3.2). Certifique-se de subcultura células extra para o dia 09/08, se necessário (como no passo 2.2). </li></ol></li><li> ES / mStrawberry OP9 co-cultura (dia 3) <ol class="lalpha"><li> Cuidadosamente remova o meio de co-cultura e substituir por meio de diferenciação fresco co-cultura </li></ol></li><li> ES / mStrawberry OP9 co-cultura (dia 5) <ol class="lalpha"><li> Lavar cuidadosamente co-culturas 2x com PBS </li><li> Trypsinize células com pré-aquecido 0,25% Tripsina-EDTA </li><li> Lave as células off frasco com media Co-cultura de diferenciação </li><li> Células de pelotização em 400xg, 7min, RT. Elimine o sobrenadante </li><li>Adicionar mídia Co-cultura de diferenciação para as células. Use uma agulha calibre 21 bluntended para ressuspender as células e para assegurar a suspensão única célula </li><li> Contagem de células utilizando um hemocitômetro. Deve ter aumento de 100-150 vezes no número de células ES desde o dia 0. </li><li> Re-semente centímetros 6.48x10 02/04 - 7.76x10 4 / cm 2 co-cultura de células em uma nova camada de confluentes, mStrawberry OP9 células </li><li> Dia 5 ENSAIOS-Restante co-cultura de células pode ser utilizado para análise de citometria de fluxo, cytopreps (30K células), ensaios de chip, etc </li></ol></li><li> ES / mStrawberry OP9 co-cultura (dia 09/08 e dia 12) <ol class="lalpha"><li> Remova a mídia de diferenciação do frasco e salvar. Lavar com PBS 1x monocamada para remover as células hematopoiéticas em suspensão. Não jogue fora as células hematopoiéticas. </li><li> Trypsinize células aderentes com pré-aquecido 0,25% Tripsina-EDTA </li><li> Lave as células off frasco com media diferenciação ES e adicione a células hematopoiéticas, encontradas em suspensão = </li><li> Células de pelotização em 400xg, 7min, RT. Elimine o sobrenadante </li><li> Adicionar Co-cultura de mídia ou PBS diferenciação para as células. Use uma agulha calibre 21 bluntended para ressuspender as células e para garantir a única célula de células em suspensão Conde utilizando um hemocitômetro. </li><li> Co-cultura pode ser continuado por 14 dias para avaliar mais maduro progenitores hematopoiéticos por re-semeadura co-cultura de células em uma nova camada de confluentes, mStrawberry OP9 células no dia 8 ou 9 e depois novamente no dia 12. Re-semente número de células otimizado com base na recuperação de células necessárias para o dia de ensaio. </li></ol></li><li> Avaliação do ES derivadas progênie (dia 14/01). ES derivadas progênie pode ser avaliado em qualquer dia da co-cultura pelo fluxo de classificar para fora mStrawberry células negativas (ES derivadas progênie). <ol class="lalpha"><li> Remova a mídia de diferenciação do frasco e salvar. Lavar com PBS 1x monocamada para remover as células hematopoiéticas em suspensão. Não jogue fora as células hematopoiéticas. </li><li> Trypsinize células aderentes com pré-aquecido 0,25% Tripsina-EDTA </li><li> Lave as células off frasco com media Co-cultura de diferenciação e adicionar às células hematopoiéticas, encontradas em suspensão </li><li> Células de pelotização em 400xg, 7min, RT. Elimine o sobrenadante </li><li> Ressuspender as células com 21-gauge agulha bluntended e contar </li><li> Progênie ES-derivada (mStrawberry células negativas) podem ser classificados de fluxo positivo mStrawberry OP9 células. Progênie ES-derivados podem ser caracterizados por análise de citometria de fluxo, cytopreps, ensaios chip, etc </li></ol></li></ol> 4. Resultados representativos: <img src="/files/ftp_upload/2559/2559fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. ES / mStrawberry OP9 Sistema de Co-cultura. Nosso laboratório utiliza um in vitro de células ES sistema de co-cultura para o desenvolvimento do modelo hematopoiéticas. Neste sistema de co-cultura, as células ES diferenciar, em hemangioblastos no 5 º dia, quando colocado em uma camada confluente de células mStrawberry OP9. Como o produto co-cultura, precursores hematopoiéticos estão presentes no dia 8, enquanto terminalmente diferenciadas linhagens hematopoiéticas aparecem por dia 14. Setas indicam dia de diferenciação quando passaging de ES derivadas progênie em novas camadas confluentes de células em mStrawberry OP9 necessário. <img src="/files/ftp_upload/2559/2559fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Diferenciação de células ES adequada. Células-tronco embrionárias são semeados em uma camada confluente de mStrawberry OP9 no Dia 0. ES derivadas progênie começa a tornar-se visível no dia 3 de diferenciação, com ES derivadas progênie parecendo um aglomerado de células com uma borda definida ou começando a se formar um padrão whorl. Hemangioblastos, que é o precursor comum mesodérmica para as linhagens endoteliais e hematopoiéticas, deve aparecer como amontoados espirais de células no dia 5. Para co-cultura períodos superiores a cinco dias, a ES-progênie derivada deve aparecer como aglomerados de células hematopoiéticas. Dois a quatro grupos unicelulares, no dia 07/06, deve aparecer e crescer em clusters maiores célula Dia 09/08 de co-cultura. Progênie ES outros derivados também são encontrados fortemente ligada à camada de células aderentes do estroma. <img src="/files/ftp_upload/2559/2559fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Diferenciação celular sem sucesso ES. Os resultados deste co-cultura refletem diferenciação celular imprópria ES. Observe como a progênie ES derivados não aparecem em um padrão whorl no dia 5. A ausência de células em um padrão whorl indica a formação hemangioblast impróprio. Se hemangioblast não se desenvolvem adequadamente, e depois continuou co-cultura vai resultar na diferenciação de linhagem hematopoiéticas atrofiado. Co-culturas com formação hemangioblast indevido deve ser descartada. <img src="/files/ftp_upload/2559/2559fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. mStrawberry OP9 culturas de células. (A) mStrawberry células são subcultivadas em OP970-90% confluência. (B) Para a diferenciação adequada, as células ES e ES-progênie derivadas são colocadas em uma camada muito confluentes de mStrawberry OP9 células. <img src="/files/ftp_upload/2559/2559fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5. Representante ES / mStrawberry OP9 perfil de fluxo co-cultura. Todos os descendentes ES-derivados são mStrawberry células negativas e podem ser classificadas a partir do fluxo de mStrawberry OP9 células. porta celular mStrawberry negativa foi determinada usando um ES/OP9 tradicionais co-cultura.

<ol>
	<li>Baron, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+origins+of+mammalian+hematopoiesis.">Embryonic origins of mammalian hematopoiesis.</a> Exp Hematol. 31, 1160-1160 (2003).</li><li>Baron, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+patterning+of+the+mouse+embryo:+implications+for+hematopoietic+commitment+and+differentiation.">Early patterning of the mouse embryo: implications for hematopoietic commitment and differentiation.</a> Exp Hematol. 33, 1015-1015 (2005).</li><li>Baron, M. H., Fraser, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+specification+of+early+hematopoiesis+in+the+mammal.">The specification of early hematopoiesis in the mammal.</a> Curr Opin Hematol. 12, 317-317 (2005).</li><li>Desbaillets, I., Ziegler, U., Groscurth, P., Gassmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryoid+bodies:+an+in+vitro+model+of+mouse+embryogenesis.">Embryoid bodies: an in vitro model of mouse embryogenesis.</a> Exp Physiol. 85, 645-645 (2000).</li><li>Ganapati, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+notch+signaling+in+normal+and+neoplastic+hematopoiesis:+global+gene+expression+profiling+in+response+to+activated+notch+expression.">Modeling notch signaling in normal and neoplastic hematopoiesis: global gene expression profiling in response to activated notch expression.</a> Stem Cells. 25, 1872-1872 (2007).</li><li>Hogan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manipulating the mouse embryo : a laboratory manual. , (1994).</li><li>Keller, G., Kennedy, M., Papayannopoulou, T., Wiles, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+commitment+during+embryonic+stem+cell+differentiation+in+culture.">Hematopoietic commitment during embryonic stem cell differentiation in culture.</a> Mol Cell Biol. 13, 473-473 (1993).</li><li>Keller, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+differentiation+of+embryonic+stem+cells.">In vitro differentiation of embryonic stem cells.</a> Curr Opin Cell Biol. 7, (1995).</li><li>Nakano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphohematopoietic+development+from+embryonic+stem+cells+in+vitro.">Lymphohematopoietic development from embryonic stem cells in vitro.</a> Semin Immunol. 7, 862-862 (1995).</li><li>Nakano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+development+of+hematopoietic+system+from+mouse+embryonic+stem+cells:+a+new+approach+for+embryonic+hematopoiesis.">In vitro development of hematopoietic system from mouse embryonic stem cells: a new approach for embryonic hematopoiesis.</a> Int J Hematol. 65, 1-1 (1996).</li><li>Nakano, T., Kodama, H., Honjo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+lymphohematopoietic+cells+from+embryonic+stem+cells+in+culture.">Generation of lymphohematopoietic cells from embryonic stem cells in culture.</a> Science. 265, 1098-1098 (1994).</li><li>Turksen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Embryonic stem cells : methods and protocols. , (2002).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Diferenciação adequada de células ES na camada confluente de mStrawberry OP9 células resulta na produção de Flk1 hemangioblastos + no dia 5 de co-cultura. Hemangioblastos deve aparecer como amontoados espirais de células, como observado na Figura 1. Para o restante da co-cultura, da progênie ES derivadas visível deve aparecer como aglomerados de células hematopoiéticas (Figura 1). No Day6 / 7 03:58 grupamentos celulares deve aparecer e crescer em clusters célula maior (tanto aderentes e em suspensão) no dia 09/08 de co-cultura. Progênie ES outros derivados também são encontrados fortemente ligada dentro da camada de células aderentes do estroma. Embora não incluída no protocolo, é essencial para pré-testar o FBS utilizado no meio de crescimento ES, o mStrawberry OP9 meios de crescimento e da ES / mStrawberry OP9 media diferenciação. Devidamente testados soro deve garantir um crescimento adequado de mStrawberry OP9 células, bem como, a diferenciação adequada de células ES em co-cultura até o dia 5 de diferenciação. Como uma alternativa ou para além mStrawberry OP9 células, OP9 células podem ser irradiados, em 8000 rads, antes da semeadura na confluência (7.8x10 4 células / cm 2). Irradiação de células OP9 permite a eliminação dos repetidos passos repique, bem como, permite a eliminação quase completa do velho, contaminando OP9 células de ensaios a jusante. OP9 células foram projetadas para expressar a proteína mStrawberry transduzindo OP9 células com 3ug/mL de um vector lentiviral mStrawberry expressar sob o controle de um promotor CMV (CMV pRRLsin-vector, vector UCLA core). Padrão ES/OP9 co-cultura protocolos implica a colocação de células-tronco embrionárias em uma camada confluente OP9 células, bem como, um dia passo replating 5, a fim de reduzir a idade, contaminando OP9 células de passagem de célula. Além disso, somente as células hematopoiéticas, encontradas em suspensão são removidos para a avaliação da ES derivadas progênie. No entanto, com tanto passo um repique ea colheita de células em suspensão potencialmente apenas um perde um número substancial de desenvolvimento ES-derivado células hematopoiéticas. Esta questão torna-se importante abordar quando se tenta caracterizar defeitos hematopoiéticas associadas com linhas ES nocaute. A fim de contornar este problema nosso laboratório usado uma versão modificada co-cultura, através do uso de mStrawberry expressando OP9 células. Isso garante que todos os descendentes ES são transferidos para o co-cultura continuou no dia 5, e para a colheita de todas as progênies derivadas ES para ensaios de downstream. Esta alteração prevê uma ferramenta útil na avaliação e caracterização de progênie hematopoiéticas derivadas de humanos e linhas ES mouse. Este ES-mStrawberry OP9 co-cultura recapitula o modelo de vários estágios primitivos e hematopoiese definitiva. Ao estudar as fases iniciais do desenvolvimento hematopoiético, muitas pessoas usam a BL-CFC (Blast-como células formadoras de colônia) de ensaio, que avaliam o desenvolvimento do hemangioblast da célula ES. Enquanto o ensaio BL-CFC é uma ferramenta útil na investigação de desenvolvimento hematopoiético cedo, o mStrawberry-ES sistemas de co-cultura apresenta utilitário aumentar à medida que permite a avaliação da hemangioblast, bem como, mais adulto linhagens hematopoiéticas. Trabalho anterior usando OP9/ES tradicionais e protocolos de diferenciação EB mostrou que fatores adicionais, talvez necessárias, como a superexpressão de HoxB4, a fim de obter a longo prazo repovoar células-tronco hematopoiéticas in vitro. Trabalho adicional é necessário avaliar se mStrawberry negativo, classificado ES derivadas populações contêm verdadeiras células-tronco hematopoéticas.

OP-9 celular Manutenção de Stock Componentes Médio <table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> AMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 12571-063 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Omega Scientific </td><td> FB01 </td><td> Pré-testados </td></tr><tr><td> L-glutamina </td><td> Cellgro </td><td> 25-005-CI </td><td> 200nM </td></tr><tr><td> Tripsina-EDTA </td><td> Stem Cell Technologies </td><td> 07901 </td><td></td></tr></tbody></table> ES/OP-9 Diferenciação Celular stock Componentes Médio <table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> AMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 12571-063 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Hyclone </td><td> SH30070 </td><td> Pré-testados </td></tr><tr><td> L-glutamina </td><td> Cellgro </td><td> 25-005-CI </td><td> 200mM </td></tr><tr><td> PBS (sem Ca 2 + e Mg 2 +) </td><td> Cellgro </td><td> 21-031-CV </td><td></td></tr><tr><td> Tripsina-EDTA </td><td> Stem Cell Technologies </td><td> 07901 </td><td></td></tr></tbody></table>

modified es / op9 co-culture protocol provides enhanced characterization of hematopoietic progeny

A diferenciação in vitro de células-tronco embrionárias para um destino de células hematopoiéticas é útil quando se estuda populações de células que são de difícil acesso e in vivo para caracterizar os primeiros genes envolvidos na hematopoiese, sem ter que lidar com letalidades embrionárias. O ES/OP9 sistema de co-cultura foi originalmente projetada para produzir progênie hematopoiéticas, sem o excesso de produção de macrófagos, como a linha de células do estroma OP9 é derivada da calvária de ratos mutantes osteopetrose que a falta funcional M-CSF. A in vitro ES/OP9 sistema de co-cultura pode ser usado, a fim de recapitular desenvolvimento hematopoiético cedo. Quando cultivadas em OP9 células do estroma, células-tronco embrionárias se diferenciam em Flk-1 + hemangioblastos, progenitores hematopoiéticos e, finalmente, maduro, linhagens terminalmente diferenciadas. O padrão ES/OP9 protocolo de co-cultura implica a colocação de células-tronco embrionárias em uma camada confluente de células OP9, bem como, periódicos passos repique, a fim de remover o velho, contaminando OP9 células. Além disso, os protocolos atuais envolvem avaliar apenas as células hematopoiéticas, encontradas na suspensão e não são otimizados para a avaliação da ES-derivados de progênie em cada dia de diferenciação. No entanto, com passos repique ea colheita de células em suspensão apenas um potencialmente perde uma grande parte ES derivadas progênie e desenvolvimento de células hematopoiéticas. Esta questão torna-se importante abordar quando se tenta caracterizar defeitos hematopoiéticas associadas com linhas ES nocaute. Aqui nós descrevemos uma versão modificada ES / mStrawberry OP9 co-cultura, que permite a eliminação de contaminantes OP9 células de ensaios a jusante. Este método permite a avaliação completa de todas as progênies derivadas ES em todos os dias de co-cultura, resultando em um padrão de diferenciação hematopoiética, que mais directamente corresponde ao padrão de diferenciação hematopoiética observado dentro do embrião.

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Modified ES / OP9 Co-Culture Protocol Provides Enhanced Characterization of Hematopoietic Progeny

mStrawberry OP9 células permitir uma avaliação completa de todos os descendentes ES-derivados de co-cultura.

Modificado ES / OP9 Co-Protocol Cultura Fornece Caracterização melhorada de Progênie Hematopoiéticas

The in vitro differentiation of ES cells towards a hematopoietic cell fate is useful when studying cell populations that are difficult to access in vivo ...

modified-es-op9-co-culture-protocol-provides-enhanced

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

20.6K visualizações.  University of California, Los Angeles. mStrawberry OP9 células permitir uma avaliação completa de todos os descendentes ES-derivados de co-cultura.

Vídeo: Modified ES / OP9 Co-Culture Protocol Provides Enhanced Characterization of Hematopoietic Progeny

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are derived from the blastocyst of the early embryo and are pluripotent in differentiative ability.  Their vast differentiative potential has made them the focus of much research centered on deducing how to coax them to generate clinically useful cell types.  The successful derivation of hematopoietic stem cells (HSC) from mouse ESC has recently been accomplished and can be visualized in this video protocol.  HSC, arguably the most clinically exploited cell population, are used to treat a myriad of hematopoietic malignancies and disorders.  However, many patients that might benefit from HSC therapy lack access to suitable donors.  ESC could provide an alternative source of HSC for these patients.  The following protocol establishes a baseline from which ESC-HSC can be studied and inform efforts to isolate HSC from human ESC.  In this protocol, ESC are differentiated as embryoid bodies (EBs) for 6 days in commercially available serum pre-screened for optimal hematopoietic differentiation.  EBs are then dissociated and infected with retroviral HoxB4.  Infected EB-derived cells are plated on OP9 stroma, a bone marrow stromal cell line derived from the calvaria of  M-CSF-/- mice, and co-cultured in the presence of hematopoiesis promoting cytokines for ten days.  During this co-culture, the infected cells expand greatly, resulting in the generation a heterogeneous pool of 100s of millions of cells.  These cells can then be used to rescue and reconstitute lethally irradiated mice.

This protocol details the derivation of transplantable hematopoietic stem cells from mouse embryonic stem cells (ESC) and their subsequent injection into lethally irradiated recipient mice. Briefly, ESC are differentiated as embryoid bodies, which are then infected with retroviral HoxB4 and co-cultured with OP9 stromal cells and hematopoietic cytokines.

Derivação de Células-Tronco Hematopoéticas murino de Células-Tronco Embrionárias

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Biologia

Initiating Differentiation in Immortalized Multipotent Otic Progenitor Cells

Use of human induced pluripotent stem cells (iPSC) or embryonic stem cells (ESC) for cell replacement therapies holds great promise. Several limitations including low yields and heterogeneous populations of differentiated cells hinder the progress of stem cell therapies. A fate restricted immortalized multipotent otic progenitor (iMOP) cell line was generated to facilitate efficient differentiation of large numbers of functional hair cells and spiral ganglion neurons (SGN) for inner ear cell replacement therapies. Starting from dissociated cultures of single iMOP cells, protocols that promote cell cycle exit and differentiation by basic fibroblast growth factor (bFGF) withdrawal were described. A significant decrease in proliferating cells after bFGF withdrawal was confirmed using an EdU cell proliferation assay. Concomitant with a decrease in proliferation, successful differentiation resulted in expression of molecular markers and morphological changes. Immunostaining of Cdkn1b (p27KIP) and Cdh1 (E-cadherin) in iMOP-derived otospheres was used as an indicator for differentiation into inner ear sensory epithelia while immunostaining of Cdkn1b and Tubb3 (neuronal &#946;-tubulin) was used to identify iMOP-derived neurons. Use of iMOP cells provides an important tool for understanding cell fate decisions made by inner ear neurosensory progenitors and will help develop protocols for generating large numbers of iPSC or ESC-derived hair cells and SGNs. These methods will accelerate efforts for generating otic cells for replacement therapies.

The current protocols to maintain immortalized multipotent otic progenitor (iMOP) cells and otic differentiation are described. Culture conditions and molecular markers that indicate differentiation into sensory epithelia and spiral ganglion neurons (SGN) are highlighted.

Iniciando A diferenciação em células multipotentes imortalizadas Otic progenitoras

Use of human induced pluripotent stem cells (iPSC) or embryonic stem cells (ESC) for cell replacement therapies holds great promise. Several limitations ...

Biologia do Desenvolvimento

Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with Transcription Factors to Induce a Hemogenic Program

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We first designed a reporter screen using MEFs from human CD34-tTA/TetO-H2BGFP (34/H2BGFP) double transgenic mice. CD34+ cells from these mice label H2B histones with GFP, and cease labeling upon addition of doxycycline (DOX). MEFS were transduced with candidate TFs and then observed for the emergence of GFP+ cells that would indicate the acquisition of a hematopoietic or endothelial cell fate. Starting with 18 candidate TFs, and through a process of combinatorial elimination, we obtained a minimal set of factors that would induce the highest percentage of GFP+ cells. We found that Gata2, Gfi1b, and cFos were necessary and the addition of Etv6 provided the optimal induction. A series of gene expression analyses done at different time points during the reprogramming process revealed that these cells appeared to go through a precursor cell that underwent an endothelial to hematopoietic transition (EHT). As such, this reprogramming process mimics developmental hematopoiesis "in a dish," allowing study of hematopoiesis in vitro and a platform to identify the mechanisms that underlie this specification. This methodology also provides a framework for translation of this work to the human system in the hopes of generating an alternative source of patient-specific hematopoietic stem cells (HSCs) for a number of applications in the treatment and study of hematologic diseases.

The protocol described here details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts via overexpression of a minimal set of transcription factors. This technology may be translated to the human system to provide platforms for future study of hematopoiesis, hematologic disease, and hematopoietic stem cell transplant.

Reprogramação do rato embrionárias fibroblastos com Fatores de transcrição para induzir um Programa hegemônicos

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem cells (hPSCs). Until recently, efforts to differentiate hPSCs into HSCs have predominantly generated hematopoietic progenitors that lack HSC potential, and instead resemble yolk sac hematopoiesis.&#160;These resulting hematopoietic progenitors may have limited utility for in vitro disease modeling of various adult hematopoietic disorders, particularly those of the lymphoid lineages. However, we have recently described methods to generate erythro-myelo-lymphoid multilineage definitive hematopoietic progenitors from hPSCs using a stage-specific directed differentiation protocol, which we outline here. Through enzymatic dissociation of hPSCs on basement membrane matrix-coated plasticware, embryoid bodies (EBs) are formed. EBs are differentiated to mesoderm by recombinant BMP4, which is subsequently specified to the definitive hematopoietic program by the GSK3&#946; inhibitor, CHIR99021. Alternatively, primitive hematopoiesis is specified by the PORCN inhibitor, IWP2. Hematopoiesis is further driven through the addition of recombinant VEGF and supportive hematopoietic cytokines. The resulting hematopoietic progenitors generated using this method have the potential to be used for disease and developmental modeling, in vitro.

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, used to differentiate hPSCs into CD34+ hematopoietic progenitors. This method uses stage-specific manipulation of canonical WNT signaling to specify cells exclusively to either the definitive or primitive hematopoietic program.

Dirigido a diferenciação de progenitores hematopoiéticos primitivo e definitiva de células pluripotentes humanas

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Clonal Analysis of Embryonic Hematopoietic Stem Cell Precursors Using Single Cell Index Sorting Combined with Endothelial Cell Niche Co-culture

The ability to study hematopoietic stem cell (HSC) genesis during embryonic development has been limited by the rarity of HSC precursors in the early embryo and the lack of assays that functionally identify the long-term multilineage engraftment potential of individual putative HSC precursors. Here, we describe methodology that enables the isolation and characterization of functionally validated HSC precursors at the single cell level. First, we utilize index sorting to catalog the precise phenotypic parameter of each individually sorted cell, using a combination of phenotypic markers to enrich for HSC precursors with additional markers for experimental analysis. Second, each index-sorted cell is co-cultured with vascular niche stroma from the aorta-gonad-mesonephros (AGM) region, which supports the maturation of non-engrafting HSC precursors to functional HSC with multilineage, long-term engraftment potential in transplantation assays. This methodology enables correlation of phenotypic properties of clonal hemogenic precursors with their functional engraftment potential or other properties such as transcriptional profile, providing a means for the detailed analysis of HSC precursor development at the single cell level.

Here we present methodology for the clonal analysis of hematopoietic stem cell precursors during murine embryonic development. We combine index sorting of single cells from the embryonic aorta-gonad-mesonephros region with endothelial cell co-culture and transplantation to characterize the phenotypic properties and engraftment potential of single hematopoietic precursors.

Análise clonal de precursores embrionárias células-tronco hematopoiéticas usando índice de célula única classificação combinada com células endoteliais nicho co-cultura

The ability to study hematopoietic stem cell (HSC) genesis during embryonic development has been limited by the rarity of HSC precursors in the early ...

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic progenitors of both mouse and human origin. It is now used to address a growing variety of complex genetic, cellular and molecular questions related to hematopoiesis, and is at the cutting edge of efforts to translate these basic findings to therapeutic applications. The procedures are straightforward and routinely yield robust results. However, achieving successful hematopoietic differentiation in vitro requires special attention to the details of reagent and cell culture maintenance. Furthermore, the protocol features technique sensitive steps that, while not difficult, take care and practice to master. Here we focus on the procedures for differentiation of T lymphocytes from mouse embryonic stem cells (mESC). We provide a detailed protocol with discussions of the critical steps and parameters that enable reproducibly robust cellular differentiation in vitro. It is in the interest of the field to consider wider adoption of this technology, as it has the potential to reduce animal use, lower the cost and shorten the timelines of both basic and translational experimentation.

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

Mouse embryonic stem cells can be differentiated to T cells in vitro using the OP9-DL1 co-culture system. Success in this procedure requires careful attention to reagent/cell maintenance, and key technique sensitive steps. Here we discuss these critical parameters and provide a detailed protocol to encourage adoption of this technology.

Derivação de células T<em&gt; In Vitro</em&gt; De Mouse Células-Tronco Embrionárias

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic ...

Imunologia e Infecção

Co-Culture and Transduction of Murine Thymocytes on Delta-Like 4-Expressing Stromal Cells to Study Oncogenes in T-Cell Leukemia

Transduced mouse immature thymocytes can be differentiated into T cells&#160;in vitro&#160;using the delta-like 4-expressing bone marrow stromal cell line co-culture system (OP9-DL4). As retroviral transduction requires dividing cells for transgene integration, OP9-DL4 provides a suitable in vitro environment for cultivating hematopoietic progenitor cells. This is particularly advantageous when studying the effects of the expression of a specific gene during normal T cell development and leukemogenesis, as it allows researchers to circumvent the time-consuming process of generating transgenic mice. To achieve successful outcomes, a series of coordinated steps involving the simultaneous manipulation of different types of cells must be carefully performed. Although these are very well-established procedures, the lack of a common source in the literature often means a series of optimizations are required, which can be time-consuming. This protocol has been shown to be efficient in transducing primary thymocytes followed by differentiation on OP9-DL4 cells. Detailed here is a protocol that can serve as a quick and optimized guide for the co-culture of retrovirally transduced thymocytes on OP9-DL4 stromal cells.

This protocol describes the isolation of double-negative thymocytes from the mouse thymus followed by retroviral transduction and co-culture on the delta-like 4-expressing bone marrow stromal cell line co-culture system (OP9-DL4) for further functional analysis.

Co-cultura e transdução de timócitos murinos em células estromais delta-like 4 expressando para estudo de oncogenes em leucemia de células T

Transduced mouse immature thymocytes can be differentiated into T cells&#160;in vitro&#160;using the delta-like 4-expressing bone marrow stromal cell line ...

Pesquisa do câncer

Identification and Isolation of Oligopotent and Lineage-committed Myeloid Progenitors from Mouse Bone Marrow

Myeloid progenitors that yield neutrophils, monocytes and dendritic cells (DCs) can be identified in and isolated from the bone marrow of mice for hematological and immunological analyses. For example, studies of the cellular and molecular properties of myeloid progenitor populations can reveal mechanisms underlying leukemic transformation, or demonstrate how the immune system responds to pathogen exposure. Previously described flow cytometry strategies for myeloid progenitor identification have enabled significant advances in many fields, but the fractions they identify are very heterogeneous. The most commonly used gating strategies define bone marrow fractions that are enriched for the desired populations, but also contain large numbers of &#34;contaminating&#34; progenitors. Our recent studies have resolved much of this heterogeneity, and the protocol we present here permits the isolation of 6 subpopulations of oligopotent and lineage-committed myeloid progenitors from 2 previously described bone marrow fractions. The protocol describes 3 stages: 1) isolation of bone marrow cells, 2) enrichment for hematopoietic progenitors by magnetic-activated cell sorting (lineage depletion by MACS), and 3) identification of myeloid progenitor subsets by flow cytometry (including fluorescence-activated cell sorting, FACS, if desired). This approach permits progenitor quantification and isolation for a variety of in vitro and in vivo applications, and has already yielded novel insight into pathways and mechanisms of neutrophil, monocyte, and DC differentiation.

We demonstrate how to identify and isolate 6 subsets of myeloid progenitors from murine bone marrow using a combination of magnetic and fluorescence sorting (MACS and FACS). This protocol can be used for in vitro culture assays (methylcellulose or liquid cultures), in vivo adoptive transfer experiments, and RNA/protein analyses.

Identificação e isolamento de oligopotentes e confirmada por linhagem mieloides progenitores da medula óssea de rato

Myeloid progenitors that yield neutrophils, monocytes and dendritic cells (DCs) can be identified in and isolated from the bone marrow of mice for ...

Simultaneous Assessment of Kinship, Division Number, and Phenotype via Flow Cytometry for Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

Few techniques can assess phenotype and fate for the same cell simultaneously. Most of the current protocols used to characterize phenotype, although able to generate large datasets, necessitate the destruction of the cell of interest, making it impossible to assess its functional fate. Heterogeneous biological differentiating systems like hematopoiesis are therefore difficult to describe. Building on cell division tracking dyes, we further developed a protocol to simultaneously determine kinship, division number, and differentiation status for many single hematopoietic progenitors. This protocol allows the assessment of the ex vivo differentiation potential of murine and human hematopoietic progenitors, isolated from various biological sources. Moreover, as it is based on flow cytometry and a limited number of reagents, it can quickly generate a large amount of data, at the single-cell level, in a relatively inexpensive manner. We also provide the analytical pipeline for single-cell analysis, combined with a robust statistical framework. As this protocol allows the linking of cell division and differentiation at the single-cell level, it can be used to quantitatively assess symmetric and asymmetric fate commitment, the balance between self-renewal and differentiation, and the number of divisions for a given commitment fate. Altogether, this protocol can be used in experimental designs aiming to unravel the biological differences between hematopoietic progenitors, from a single-cell perspective.

Simultaneous Assessment of Kinship, Division Number, and Phenotype via Flow Cytometry for Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

Presented here is a flow cytometry-based technique that allows for simultaneously measuring the number of cell divisions, surface cell phenotype, and cellular kinship. Those properties can be tested statistically using a permutation-based framework.

Avaliação Simultânea de Parentesco, Número de Divisão e Fenótipo por Citometria de Fluxo para Células-Tronco Hematopoéticas e Progenitoras

Few techniques can assess phenotype and fate for the same cell simultaneously. Most of the current protocols used to characterize phenotype, although able ...

Utilizing Low Oxygen Tension to Reduce Hematopoietic Cells in Murine Bone Marrow Stromal Cell Cultures

Currently, there remains a lack of universally accepted markers to prospectively isolate a homogeneous population of skeletal stem cells (SSCs). For this reason, BMSCs, which support hematopoiesis and contribute to all the functions of the skeleton, continue to be widely used to study multipotent mesenchymal progenitors (MMPs) and to infer SSC function. Moreover, given the breadth of transgenic murine models used to study musculoskeletal diseases, the use of BMSCs also serves as a powerful tool to examine the molecular mechanisms regulating MMPs and SSCs. However, common isolation procedures for murine BMSCs result in over 50% of recovered cells being of hematopoietic origins, potentially hindering the interpretation of the data generated during these studies. Here, we describe a method using low oxygen tension or hypoxia for the selective elimination of CD45+ cells in BMSC cultures. Importantly, this method can be easily implemented to not only reduce hemopoietic contaminants but to also enhance the percentage of MMPs and putative SSCs in BMSC cultures.

A routine culture of bone marrow stromal cells (BMSCs) leads to the isolation of heterogeneous cell populations, with many cells being of hematopoietic origins. Here, we describe a method that utilizes low oxygen tension to greatly reduce hematopoietic contaminants in murine BMSC cultures.

Currently, there remains a lack of universally accepted markers to prospectively isolate a homogeneous population of skeletal stem cells (SSCs). For this ...