Damos las gracias a Shao-Ming Lu y A. Harris Gelbard para el uso de una bomba peristáltica y vibratome, así como Karen L. Bentley y Schneider Gayle en el Fondo para el núcleo Microscopio Electrónico de Investigación de la Universidad de Rochester Medical Center para la asistencia técnica. Este trabajo fue financiado por subvenciones del NIH (EY019277), la Fundación de Whitehall, Burroughs Wellcome Fund, y la Fundación Alfred P. Sloan de AKM. M.-È.T. es financiado por una Fonds de la recherche en santé du Québec (FRSQ) Premio formación postdoctoral.

1. Los animales fueron perfundidos <ol><li> El día antes de la perfusión, preparar: - 2 L de tampón fosfato (PB; 100 mM, pH 7,4) y 1 l de sodio fosfato (PBS, 0,9% de NaCl en 50 mM PB, pH 7,4) con agua destilada. Guarde el PBS y 1 litro de PB a 4 ° C. Estos serán utilizados para la perfusión y la inmunocitoquímica pre-inclusión. - 1 litro de 4,0% de paraformaldehído (PFA, pH 7,4), la solución de fijación, que permitirá a la perfusión de 6 ratones. A tal efecto, calentar 1 L de PB en una campana extractora. Pesar 40 g de paraformaldehído granular (PFA) y se vierte en la solución de PB cuando llega a 60 ° C. Cuando la solución es clara, con la PFA completamente disuelta, enfriar a temperatura ambiente (TA) y se almacenan a 4 ° C. </li><li> En el día de la perfusión, preparar 500 ml de solución de acroleína 3,5% en PB bajo una campana extractora. A continuación, filtrar el 3,5% y 4,0% acroleína soluciones PFA con papel de filtro. </li><li> Para la anestesia del ratón, se inyectan pentobarbital sódico (80 mg / kg) en el peritoneo con una calibre 27 ½ &quot;de la aguja. </li><li> Durante la perfusión, 50 ml de PBS, 75 ml de acroleína, y 150 ml de PFA secuencialmente pasar a la circulación del ratón. Para configurar la bomba peristáltica, llenar el tubo con PBS y fijar un calibre 23 ¾ &quot;aguja de mariposa en un extremo. Sumerja el otro extremo de la tubería en la solución de perfusión (PBS, acroleína o PFA). Ajuste la velocidad de la peristáltica bomba a 20-25 ml / min para los ratones jóvenes y adultos. A lo largo de la perfusión, con cuidado de evitar cualquier burbujas de aire que se forman en el tubo. </li><li> Espere hasta que el ratón anestesiado ya no responde a los estímulos dolorosos, como una pizca de cola, antes de proceder. Coloque el animal en una bandeja de disección y fijar las patas con cinta adhesiva. Con pinzas y tijeras, abrir la piel y la cavidad torácica para exponer el corazón. Para minimizar la isquemia cerebral, la perfusión debe iniciarse rápidamente. Abrir la aurícula derecha con unas tijeras pequeñas y arrancar la bomba peristáltica. Mientras sostiene el corazón con unas pinzas, insertar la aguja de mariposa en el ápex del ventrículo izquierdo. </li><li> Cuando se cambia la solución, detenga la bomba peristáltica, la transferencia de los tubos de una solución a otra, y reiniciar inmediatamente la bomba. </li><li> Cuando 150 ml de PFA, pare la bomba peristáltica. Con la tijera pequeña, corte la cabeza, abrir la piel, y romper el cráneo entre los ojos. Con unas pinzas pequeñas, con cuidado de chips pequeños pedazos del cráneo hasta el cerebro se puede quitar fácilmente. Después de fijar el cerebro durante 2 horas a 4 ° C en PFA. Lavar 3 veces 10 minutos en PBS. </li><li> Inmediatamente corte transversal en el cerebro (50 secciones micras de espesor) en PBS enfriado con hielo usando un vibratome. Con un pincel fino, la transferencia de las secciones seleccionadas para inmunocitoquímica en un frasco de vidrio que contiene PBS. Guarde el resto de las secciones a -20 ° C en el crioprotector (30% glicol de etileno y 30% de glicerol en PBS) durante un máximo de varios años. </li></ol> 2. Pre-incrustación inmunocitoquímica <ol><li> Por inmunocitoquímica, se elaboran secciones de flotación libre en frascos de vidrio. A lo largo del procedimiento, hay que evitar con cuidado dejando que las secciones se sequen. </li><li> En primer lugar, eliminar el PBS utilizando una pipeta de transferencia y de inmediato sustituirlo por una nueva solución de borohidruro de sodio al 0,1% en PBS durante 30 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Aclarar las secciones con PBS 3 veces 10 minutos, eliminando todas las burbujas, y se incuba durante 2 horas a temperatura ambiente en una solución de bloqueo de PBS que contenía 0,5% de gelatina y 5% de suero normal de los animales en los que el anticuerpo secundario se ha generado (suero normal de cabra en el ejemplo actual de Iba1-tinción). </li><li> Incubar durante 48 horas con el anticuerpo primario en solución de bloqueo. Para Iba1-inmunoticción, el uso de conejo anti-Iba1 anticuerpos (1:1000). </li><li> Aclarar las secciones con PBS 3 veces 10 minutos y se incuban en anticuerpo secundario conjugado con biotina (1:1000) en solución de bloqueo durante 2 horas a temperatura ambiente. Para Iba1-inmunoticción, el uso de cabra anti-conejo IgG. </li><li> Aclarar las secciones con PBS 3 veces 10 minutos y se incuban en estreptavidina-peroxidasa (1:1000) en solución de bloqueo durante 1 hora a temperatura ambiente. </li><li> Aclarar las secciones con PBS de 10 minutos y con Tris / HCl-buffer salino (TBS, 50 mM, pH 7,4), 2 veces 10 minutos. Para revelar el etiquetado, se incuban las secciones con un 0,05% y 0,01% DAB peróxido de hidrógeno en TBS (solución recién preparada). Cuando la mancha es de color marrón oscuro (ver ejemplo en Figura 1), detener la reacción mediante lavado en TBS. En cualquier caso, poner fin a la reacción después de un máximo de 5 minutos. Aclarar las secciones con TBS 10 minutos y con PB 2 veces 10 minutos. </li></ol> 3. Procesamiento para microscopía electrónica <ol><li> Transferencia de las secciones en el PP en una placa de cultivo multipocillo con un pincel fino. Prepare una solución de tetróxido de osmio% en PB bajo una campana echando humo. Quitar PB de los pozos de la placa de cultivo y<html> difundir las secciones planas con un pincel fino. Secciones inmediatamente sumergirse en el 1% de osmio durante 30 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Transferencia de las secciones en viales de vidrio, enjuague con PB 3 veces 10 minutos, y se deshidratan a través de dos inmersiones minutos en subir las concentraciones de etanol: 2 veces el 35%, una vez cada uno de 50%, 70%, 80%, 90% y el 95 %, 3 veces al 100%, seguido por tres veces de óxido de propileno. </li><li> Para preparar la resina Durcupan, se combinan 20 g del componente A, 20 g de componente B, 0,6 g de componente C, y 0,4 g de componente D en un vaso desechable, mezclar bien hasta que el color se vuelve uniforme, y se vierte en una lata de aluminio pesan plato. Si es necesario, los bloques de resina se puede preparar mediante el vertido de resina en los moldes y la incrustación de curado en un horno a 55 ° C durante 48-72 horas. </li><li> El uso de un pincel fino enjuagarse con óxido de propileno, eliminar las secciones del óxido de propileno y sumergirse en la resina de impregnación Durcupan durante la noche a temperatura ambiente. </li><li> Al día siguiente, poner el aluminio pesar la cápsula en un horno a 55 ° C durante 10 minutos para ablandar la resina. El uso de un cepillo de enjuagarse con óxido de propileno, una película de capa de incrustación ACLAR con una fina capa de resina, establecer las secciones, cubrir con otra película de inserción, y distribuir uniformemente el peso ligero (alrededor de 2 g, por ejemplo las tapas de plástico de los viales de vidrio) en la parte superior para ayudar a la difusión de resina. De polimerización de la resina, se incuban en el horno durante 48-72 horas (a 55 ° C). </li><li> Después de la polimerización, quite los pesos ligeros y el cine incrustar en la parte superior de las secciones. Bajo un microscopio binocular, seleccionar las áreas de interés cuadrados (aproximadamente 2x2 mm) y con cuidado especial de la película con una cuchilla de afeitar. </li><li> Pegue las áreas de interés en la punta de bloques de resina con un pegamento y la curación en el 55 ° C horno durante 1 hora. </li><li> En preparación para el corte, recorte el bloque de resina a la forma de un trapecio isósceles con una cuchilla de afeitar. </li><li> El uso de un ultramicrótomo y un cuchillo de vidrio, quitar el pegamento y la resina en la superficie del tejido. Llenar el bote de la cuchilla de vidrio con agua destilada y cortar algunos semi-secciones delgadas (0,5 a 1 m de espesor). </li><li> Transferencia de las secciones a una diapositiva SuperFrost con un bucle perfecto. Seca las secciones mediante la colocación de la diapositiva en una placa de calentamiento a 80 º C durante 1 minuto. Cubrir con unas gotas de 0,1% la mancha azul de toluidina (2 g de borato de sodio y 0,2 g de azul de toluidina en 200 ml de agua bidestilada) durante 1 minuto. Enjuague el exceso de colorante con agua destilada. El examen de las secciones con un microscopio de luz permitirá distinguir los tejidos teñidos de la resina (Figura 2). </li><li> Reanudar el corte hasta la frontera entre el tejido y la resina llega a la mitad de las secciones. Tenga en cuenta que el siguiente procedimiento requiere de un entrenamiento. Vuelva a colocar el cuchillo de vidrio con un cuchillo de diamante y llenar el bote con agua destilada. Tazón de plata de cortes ultrafinos de oro y plata (60-80 nm de espesor) y con cuidado se acumulan en las redes de malla de cobre con unas pinzas finas invertido. Seca las redes en un papel filtro. </li><li> Para mejorar el contraste, las secciones ultrafinas pueden ser teñidas con citrato de plomo (0,03 g citrato de plomo y 0,1 ml de hidróxido de sodio 10 N en 10 ml de agua destilada doble 1). Utilizando unas pinzas finas invertida, la transferencia de una red a una caída del citrato de plomo durante 2 minutos. Retire la rejilla y delicadamente enjuague con tres baños sucesivos de agua destilada. Por último, secar las redes en un papel de filtro y almacenarlas en una celda de la malla hasta que el examen de microscopía electrónica (Figuras 3-6). </li></ol> 4. Resultados representante <img src="/files/ftp_upload/2021/2021fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Iba1 manchado de la sección a nivel microscópico de luz. La distribución de celulares Iba1 se limita a la microglía, lo que demuestra la especificidad de la tinción. Barra de escala = 100 micras. <img src="/files/ftp_upload/2021/2021fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Toluidina azul manchado de semi-sección delgada a nivel microscópico de luz. Nota de la frontera entre el tejido y la resina en la inmunomarcación se parecen más intensos en el microscopio electrónico. <img src="/files/ftp_upload/2021/2021fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Ultrafinos sección que muestra Iba1-inmunopositivas pericarion la microglia y los procesos a nivel de microscopía electrónica. Elementos estructurales Iba1 positivos se reconocen por su inmunoperoxidasa-DAB electrón-densos precipitado. Barra de escala = 2 micras. <img src="/files/ftp_upload/2021/2021fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Ultrafinos sección mostrando Iba1-inmunopositivas procesos microgliales de diferentes tamaños y formas a nivel de microscopía electrónica. Barra de escala = 2 micras. e 5 &quot;/&gt; Figura 5. Sección ultrafina que muestra a mayor aumento de un proceso microglial Iba1 positivo en la Figura 4, que permita la identificación de los organelos intracelulares. Barra de escala = 1 micra. <img src="/files/ftp_upload/2021/2021fig6.jpg" alt="Figura 6" /> Figura 6. Ultrafinos sección revelar a mayor aumento de las relaciones ultraestructurales entre un proceso de microglial Iba1 positivos y elementos cercanos de neuropilo como sinapsis. Barra de escala = 1μm.

<ol>
	<li>Venable, J. H., Coggeshall, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+lead+citrate+stain+for+use+in+electron+microscopy.">A simplified lead citrate stain for use in electron microscopy.</a> J Cell Biol. 25, 407-407 (1965).</li><li>Riad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatodendritic+localization+of+5-HT1A+and+preterminal+axonal+localization+of+5-HT1B+serotonin+receptors+in+adult+rat+brain.">Somatodendritic localization of 5-HT1A and preterminal axonal localization of 5-HT1B serotonin receptors in adult rat brain.</a> J Comp Neurol. 417 (2), 181-181 (2000).</li><li>Tremblay, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+EphA4+in+axon+terminals+and+dendritic+spines+of+adult+rat+hippocampus.">Localization of EphA4 in axon terminals and dendritic spines of adult rat hippocampus.</a> J Comp Neurol. 501 (5), 691-691 (2007).</li><li>Tremblay, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+course+of+EphA4+cellular+and+subcellular+localization+in+the+postnatal+rat+hippocampus.">Developmental course of EphA4 cellular and subcellular localization in the postnatal rat hippocampus.</a> J Comp Neurol. 512 (6), 798-798 (2009).</li><li>Bouvier, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-synaptic+and+post-synaptic+localization+of+EphA4+and+EphB2+in+adult+mouse+forebrain.">Pre-synaptic and post-synaptic localization of EphA4 and EphB2 in adult mouse forebrain.</a> J Neurochem. 106 (2), 682-682 (2008).</li><li>Bouvier, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EphA4+is+localized+in+clathrin-coated+and+synaptic+vesicles+in+adult+mouse+brain.">EphA4 is localized in clathrin-coated and synaptic vesicles in adult mouse brain.</a> J Neurochem. , (2010).</li></ol>

Aquí hemos descrito un protocolo de preparación de tejido ratón cerebro para microscopía immunoelectron que proporciona un excelente compromiso entre conservación óptima ultraestructurales y detección inmunocitoquímicas, cuando los procedimientos son rigurosamente realizado. Combinado con TEM, este método permite distinguir elementos celulares con pocos características distintivas y criterios identificación. En particular, el tinción inmunoperoxidasa-DAB de Iba1 permite identificar microglial perikarya y procesos, dentro del neuropilo, así como analizar su morfología, organelos intracelulares y relaciones ultraestructurales con otros elementos celulares (Figuras 3-6). Adicionalmente, este protocolo permite analizar la ubicaciones ultraestructurales de proteínas solubles o de membrana en elementos gliales o neuronal, así como su asociación con orgánulos intracelulares. Hecho, utilizando este protocolo con anticuerpos específicos, hemos previamente reveló la localización ultraestructural de 5-HT1A y 5-HT1B receptores serotoninérgicos en el neuronal perikarya, dendritas, espinas dendríticas, axones unmyelinated y células endoteliales de adulto rata rafe dorsalis núcleo, sustancia nigra, globus pallidus y hipocampo 2. También hemos demostrado la localización ultraestructural de EphA4 y EphB2 receptores quinasa tirosina en clatrina recubiertos vesículas y diferentes elementos astrocíticos y neuronal en ratón y hipocampo rata y corteza cerebral, durante desarrollo postnatal y adultez 3,4,5,6. Último, este protocolo puede combinar con pre-embedding inmunooro analizar las relaciones ultraestructurales entre dos proteínas simultáneamente etiquetados, por ejemplo la co-localización de Vglut1 transportador glutamatérgica y receptor EphA4 en terminales axón de ratón adulto corteza cerebral 6. Tanto, esta técnica puede aplicarse satisfactoriamente, solo o en combinación con etiquetado inmunooro, para el análisis ultraestructurales de varias proteínas dentro diferentes regiones y tipos celulares del sistema nervioso central, todo vida postnatal, en salud y enfermedad.

* Siempre se debe trabajar bajo una campana de humos y usar guantes de nitrilo al manipular la acroleína, paraformaldehído, y el osmio y también debe disponer de sus residuos adecuadamente.

preparation of mouse brain tissue for immunoelectron microscopy

Microscopía electrónica de transmisión (TEM) es extremadamente útil para la visualización de los compartimentos microglial, subcelular oligodendrocíticos, astrocitos y neuronas (las dendritas, la espina dendrítica, axón, axón terminal, pericarion), así como sus organelos intracelulares y el citoesqueleto, en el sistema nervioso central en alta resolución espacial. En combinación con TEM, pre-incrustación inmunocitoquímica permite la discriminación de los elementos celulares con algunos rasgos distintivos y los criterios de identificación (por ejemplo, la microglia perikarya y procesos, cuando se utiliza un anticuerpo contra el marcador de microglia específicos Iba1 (molécula ionizada de unión de calcio adaptador 1, tal como se presenta aquí)), la identificación de los contenidos de neurotransmisores de los elementos celulares (por ejemplo, serotoninérgicos) y su localización ultraestructural de las proteínas solubles o de membrana (por ejemplo, 5 HT1A y los receptores de EphA4). Aquí se describe un protocolo para la perfusión transcardiaca de ratones con acroleína fijador, la eliminación y la sección del cerebro, así como inmunoperoxidasa-tinción Diaminobencidina (DAB), la incrustación de resina, y ultrafinas de seccionamiento de las secciones del cerebro. Al término de estos procedimientos, el material immunostained está listo para el examen de TEM. Cuando se realiza con rigor, esta técnica proporciona un excelente compromiso entre la conservación óptima ultraestructurales y detección inmunohistoquímica.

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Preparation of Mouse Brain Tissue for Immunoelectron Microscopy

Se describe un protocolo para la perfusión transcardiaca de los ratones, la eliminación y la sección del cerebro, así como la tinción con inmunoperoxidasa, la incrustación de resina, y ultrafinas de seccionamiento de las secciones del cerebro. Al término de estos procedimientos, el material immunostained está listo para el examen con microscopio electrónico de transmisión.

Preparación del tejido de cerebro de ratón para inmunomicroscopía

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

36.8K vistas.  University of Rochester. Se describe un protocolo para la perfusión transcardiaca de los ratones, la eliminación y la sección del cerebro, así como la tinción con inmunoperoxidasa, la incrustación de resina, y ultrafinas de seccionamiento de las secciones del cerebro. Al término de estos procedimientos, el material immunostained está listo para el examen con microscopio electrónico de transmisión.

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Focussed Ion Beam Milling and Scanning Electron Microscopy of Brain Tissue

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron microscope (FIB/SEM). The samples are fixed with aldehydes, heavy metal stained using osmium tetroxide and uranyl acetate. They are then dehydrated with alcohol and infiltrated with resin, which is then hardened. Using a light microscope and ultramicrotome with glass knives, a small block containing the region interest close to the surface is made. The block is then placed inside the FIB/SEM, and the ion beam used to roughly mill a vertical face along one side of the block, close to this region. Using backscattered electrons to image the underlying structures, a smaller face is then milled with a finer ion beam and the surface scrutinised more closely to determine the exact area of the face to be imaged and milled. The parameters of the microscope are then set so that the face is repeatedly milled and imaged so that serial images are collected through a volume of the block. The image stack will typically contain isotropic voxels with dimenions as small a 4 nm in each direction. This image quality in any imaging plane enables the user to analyse cell ultrastructure at any viewing angle within the image stack.

This protocol describes how resin embedded brain tissue can be prepared and imaged in the three dimensions in the focussed ion beam, scanning electron microscope.

Haz de iones enfocado fresado y microscopía electrónica de barrido en el tejido cerebral

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron ...

Investigación

Neurociencias

Multiphoton Microscopy of Cleared Mouse Brain Expressing YFP

Multiphoton microscopy of intrinsic fluorescence and second harmonic generation (SHG) of whole mouse organs is made possible by optically clearing the organ before imaging.1,2 However, for organs that contain fluorescent proteins such as GFP and YFP, optical clearing protocols that use methanol dehydration and clear using benzyl alcohol:benzyl benzoate (BABB) while unprotected from light3 do not preserve the fluorescent signal. The protocol presented here is a novel way in which to perform whole organ optical clearing on mouse brain while preserving the fluorescence signal of YFP expressed in neurons. Altering the optical clearing protocol such that the organ is dehydrated using an ethanol graded series has been found to reduce the damage to the fluorescent proteins and preserve their fluorescent signal for multiphoton imaging.4 Using an optimized method of optical clearing with ethanol-based dehydration and clearing by BABB while shielded from light, we show high-resolution multiphoton images of yellow fluorescent protein (YFP) expression in the neurons of a mouse brain more than 2 mm beneath the tissue surface.

Multiphoton microscopy of whole mouse organs is possible by optically clearing the organ before imaging, but not all protocols preserve the fluorescent signal of fluorescent proteins. Using an optical clearing method with ethanol-based dehydration and benzyl alcohol:benzyl benzoate clearing, we show high-resolution multiphoton images of whole mouse brain expressing YFP.

Microscopía Multiphoton de cerebro de ratón Borrado Expresando YFP

Multiphoton microscopy of intrinsic fluorescence and second harmonic generation (SHG) of whole mouse organs is made possible by optically clearing the ...

Micron-scale Resolution Optical Tomography of Entire Mouse Brains with Confocal Light Sheet Microscopy

Understanding the architecture of mammalian brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience. However, mapping neuronal soma and projections throughout the whole brain is still challenging for imaging and data management technologies. Indeed, macroscopic volumes need to be reconstructed with high resolution and contrast in a reasonable time, producing datasets in the TeraByte range. We recently demonstrated an optical method (confocal light sheet microscopy, CLSM) capable of obtaining micron-scale reconstruction of entire mouse brains labeled with enhanced green fluorescent protein (EGFP). Combining light sheet illumination and confocal detection, CLSM allows deep imaging inside macroscopic cleared specimens with high contrast and speed. Here we describe the complete experimental pipeline to obtain comprehensive and human-readable images of entire mouse brains labeled with fluorescent proteins. The clearing and the mounting procedures are described, together with the steps to perform an optical tomography on its whole volume by acquiring many parallel adjacent stacks. We showed the usage of open-source custom-made software tools enabling stitching of the multiple stacks and multi-resolution data navigation. Finally, we illustrated some example of brain maps: the cerebellum from an L7-GFP transgenic mouse, in which all Purkinje cells are selectively labeled, and the whole brain from a thy1-GFP-M mouse, characterized by a random sparse neuronal labeling.

In this article we describe the full experimental procedure to reconstruct, with high resolution, the fine brain anatomy of fluorescently labeled mouse brains. The described protocol includes sample preparation and clearing, specimen mounting for imaging, data post-processing and multi-scale visualization.

Micron escala Resolución óptica tomografía de cerebro de ratón enteras con Hoja confocal Microscopía de Luz

Understanding the architecture of mammalian  brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience.  However, mapping neuronal soma and ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

La manipulación genética de las neuronas cerebelosa gránulo<em&gt; In Vitro</em&gt; Y<em&gt; En Vivo</em&gt; Estudiar Neuronal Morfología y Migración

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of the olfactory epithelium continuously give rise to new sensory neurons that extend their axons into the olfactory bulb, where they face the challenge to integrate into existing circuitry. Because of this particular feature, the olfactory system represents a unique opportunity to monitor axonal wiring and guidance, and to investigate synapse formation. Here we describe a procedure for in vivo labeling of sensory neurons and subsequent visualization of axons in the olfactory system of larvae of the amphibian Xenopus laevis. To stain sensory neurons in the olfactory organ we adopt the electroporation technique. In vivo electroporation is an established technique for delivering fluorophore-coupled dextrans or other macromolecules into living cells. Stained sensory neurons and their axonal processes can then be monitored in the living animal either using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. By reducing the number of labeled cells to few or single cells per animal, single axons can be tracked into the olfactory bulb and their morphological changes can be monitored over weeks by conducting series of in vivo time lapse imaging experiments. While the described protocol exemplifies the labeling and monitoring of olfactory sensory neurons, it can also be adopted to other cell types within the olfactory and other systems.

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

We describe a protocol for in vivo labeling of olfactory sensory neurons by electroporation and subsequent confocal laser-scanning or multiphoton microscopy to visualize neuronal morphology and its development over time.

El sistema olfativo como un modelo para estudiar los patrones de crecimiento axonal y Morfología<em&gt; En Vivo</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have validated the utility of this method for enhancing neuronal preservation and overall brain slice viability. The implementation of this technique by early adopters has facilitated detailed investigations into brain function using diverse experimental applications and spanning a wide range of animal ages, brain regions, and cell types. Steps are outlined for carrying out the protective recovery brain slice technique using an optimized NMDG artificial cerebrospinal fluid (aCSF) media formulation and enhanced procedure to reliably obtain healthy brain slices for patch clamp electrophysiology. With this updated approach, a substantial improvement is observed in the speed and reliability of gigaohm seal formation during targeted patch clamp recording experiments while maintaining excellent neuronal preservation, thereby facilitating challenging experimental applications. Representative results are provided from multi-neuron patch clamp recording experiments to assay synaptic connectivity in neocortical brain slices prepared from young adult transgenic mice and mature adult human neurosurgical specimens. Furthermore, the optimized NMDG protective recovery method of brain slicing is compatible with both juvenile and adult animals, thus resolving a limitation of the original methodology. In summary, a single media formulation and brain slicing procedure can be implemented across various species and ages to achieve excellent viability and tissue preservation.

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

This protocol demonstrates the implementation of an optimized N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. A single media formulation is used to reliably obtain healthy brain slices from animals of any age and for diverse experimental applications.

Preparación de rebanadas cerebrales agudas mediante un optimizado N-metil-D-glucamine recuperación protección método

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have ...

Preparation of Non-human Primate Brain Tissue for Pre-embedding Immunohistochemistry and Electron Microscopy

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and characterize ultrastructural and morphological details of neurons, such as synaptic contacts. Good preservation of brain tissue for electron microscopy can be obtained by rigorous cryo-fixation methods, but these techniques are rather costly and limit the use of immunolabeling, which is crucial to understand the connectivity of identified neuronal systems. Freeze-substitution methods have been developed to allow the combination of cryo-fixation with immunolabeling. However, the reproducibility of these methodological approaches usually relies on costly freezing devices. Moreover, achieving reliable results with this technique is very time-consuming and skill-challenging. Hence, the traditional chemically fixed brain, particularly with acrolein fixative, remains a time-efficient and low-cost method to combine electron microscopy with immunohistochemistry. Here, we provide a reliable experimental protocol using chemical acrolein fixation that leads to the preservation of primate brain tissue and is compatible with pre-embedding immunohistochemistry and transmission electron microscopic examination.

Here, we provide an easy, low-cost, and time-efficient protocol to chemically fix primate brain tissue with acrolein fixative, allowing for long-term preservation that is compatible with pre-embedding immunohistochemistry for transmission electron microscopy.

Preparación de tejido cerebral de primates no humanos para Pre-incrustación de inmunohistoquímica y la microscopía electrónica de

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and ...

Preparation of Newborn Rat Brain Tissue for Ultrastructural Morphometric Analysis of Synaptic Vesicle Distribution at Nerve Terminals

Our laboratory and many others have exploited the high resolving power of transmission electron microscopy to study the morphology and spatial organization of synaptic vesicles. In order to obtain high-quality electron micrographs that can yield the degree of morphological detail necessary for quantitative analysis of pre-synaptic vesicle distribution, optimal specimen preparation is critical. Chemical fixation is the first step in the process of specimen preparation, and of utmost importance to preserve fine ultrastructure. Vascular fixation with a glutaraldehyde-formaldehyde solution, followed by treatment of vibratome-sectioned specimens with osmium tetroxide, stabilizes the maximum number of molecules, especially proteins and lipids, and results in superior conservation of ultrastructure. Tissue is then processed with counterstaining, sequential dehydration and resin-embedding. En bloc staining with uranyl acetate (i.e., staining of vibratome-sectioned tissue before resin embedding) enhances endogenous contrast and stabilizes cell components against extraction during specimen processing. Contrast can be further increased by applying uranyl acetate as a post-stain on ultrathin sections. Double-staining of ultrathin sections with lead citrate after uranyl acetate treatment also improves image resolution, by intensifying electron-opacity of nucleic acid-containing structures through selective binding of lead to uranyl acetate. Transmission electron microscopy is a powerful tool for characterization of the morphological details of synaptic vesicles and quantification of their size and spatial organization in the terminal bouton. However, because it uses fixed tissue, transmission electron microscopy can only provide indirect information regarding living or evolving processes. Therefore, other techniques should be considered when the main objective is to study dynamic or functional aspects of synaptic vesicle trafficking and exocytosis.

We describe procedures for processing newborn rat brain tissue to obtain high-resolution electron micrographs for morphometric analysis of synaptic vesicle distribution at nerve terminals. The micrographs obtained with these methods can also be used to study the morphology of a number of other cellular components and their dimensional structural relationships.

Preparación del tejido cerebral de rata recién nacida para el análisis Morfolométrico ultraestructural de la distribución de vesículas sinápticas en los terminales nerviosos

Our laboratory and many others have exploited the high resolving power of transmission electron microscopy to study the morphology and spatial ...

A Hydrophobic Tissue Clearing Method for Rat Brain Tissue

Hydrophobic tissue clearing methods are easily adjustable, fast, and low-cost procedures that allows for the study of a molecule of interest in unaltered tissue samples. Traditional immunolabeling procedures require cutting the sample into thin sections, which restricts the ability to label and examine intact structures. However, if brain tissue can remain intact during processing, structures and circuits can remain intact for the analysis. Previously established clearing methods take significant time to completely clear the tissue, and the harsh chemicals can often damage sensitive antibodies. The iDISCO method quickly and completely clears tissue, is compatible with many antibodies, and requires no special lab equipment. This technique was initially validated for the use in mice tissue, but the current protocol adapts this method to image hemispheres of control and transgenic rat brains. In addition to this, the present protocol also makes several adjustments to preexisting protocol to provide clearer images with less background staining. Antibodies for Iba-1 and tyrosine hydroxylase were validated in the HIV-1 transgenic rat and in F344/N control rats using the present hydrophobic tissue clearing method. The brain is an interwoven network, where structures work together more often than separately of one another. Analyzing the brain as a whole system as opposed to a combination of individual pieces is the greatest benefit of this whole brain clearing method.

Here we present a hydrophobic tissue clearing method that allows for the viewing of target molecules as part of intact brain structures. This technique has now been validated for F344/N control and HIV-1 transgenic rats of both sexes.

Un método de limpieza de tejido hidrófobo para el tejido cerebral de rata

Hydrophobic tissue clearing methods are easily adjustable, fast, and low-cost procedures that allows for the study of a molecule of interest in unaltered ...

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBEM) for the Study of Dendritic Spines

Three-dimensional electron microscopy (3D EM) gives a possibility to analyze morphological parameters of dendritic spines with nanoscale resolution. In addition, some features of dendritic spines, such as volume of the spine and post-synaptic density (PSD) (representing post-synaptic part of the synapse), presence of presynaptic terminal, and smooth endoplasmic reticulum or atypical form of PSD (e.g., multi-innervated spines), can be observed only with 3D EM. By employing serial block-face scanning electron microscopy (SBEM) it is possible to obtain 3D EM data easier and in a more reproducible manner than when performing traditional serial sectioning. Here we show how to prepare mouse hippocampal samples for SBEM analysis and how this protocol can be combined with immunofluorescence study of dendritic spines. Mild fixation perfusion allows us to perform immunofluorescence studies with light microscopy on one half of the brain, while the other half was prepared for SBEM. This approach reduces the number of animals to be used for the study.

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy SBEM for the Study of Dendritic Spines

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBEM) is applied to image and analyze dendritic spines in the murine hippocampus.

Microscopía electrónica de barrido serial de cara de bloque (SBEM) para el estudio de espinas dendríticas

Three-dimensional electron microscopy (3D EM) gives a possibility to analyze morphological parameters of dendritic spines with nanoscale resolution. In ...