I.光度計2000C分光光度計の技術は、キュベットやキャピラリーを使用せずに2つの光学面の間微量のサンプルを保持して測定する表面張力を使用している革新的なサンプル保持システムに基づいています。光度計2000C分光光度計は、迅速かつ容易にタンパク質、DNA、RNA、および他の生体分子0.5〜2μLの液滴を測定するためにこの技術を使用しています。分子生物学的手法が継続的に分析するための材料の少量を使用するために進化しているため、この機能はますます重要になっています。サンプルが限られている条件のための微量分光光度計の理想。サンプルの十分な量が利用可能な場合、しかし、使い易さ、高速の測定サイクルとし、広範な濃度範囲はまた、分光光度計が適しています。測定サイクルも大幅に科学者がワークフロー全体の効率を高める支援、低減されます。 マイクロサンプルは、検出面の上に直接配置され、液柱は、表面張力により光ファイバの両端の間に作成されます。この液柱は垂直方向の光路を形成している。キセノン​​フラッシュランプは、光源を提供し、リニアCCDアレイを利用した分光計は、試料を通過する光を分析するために使用されます。 このようなシステムからキュベットなどの伝統的な封じ込めのデバイスを削除すると、いくつかの利点があります：サンプルの非常に少量の測定に必要とされる、クリーンアップは、単にラボペーパーで光学面を拭くことが必要であり、パスの長さは、測定中にリアルタイムで変更することができます。 光度計2000Cは、希釈することなく可能なタンパク質濃度の測定値の最も広範な範囲を提供し、（0.05 mmまで1mm）を自動的に最適なパスの長さを決定します。パスの長さを短くすることで、タンパク質のより高い濃度を測定することができます。これは事実上ほとんどのタンパク質サンプルの希釈を実行する必要がなくなります。例えば、光度計2000Cは400 mg / mLのと同じくらい高いBSAの濃度を測定することができます。 光度計2000C分光光度計ではDNA、RNA、タンパク質、および他の生体分子の吸光度を測定するための完全なスペクトルを分光光度計です。このビデオプロトコルは、タンパク質の測定に焦点を当てます。 II。 A280吸光度測定を用いた微量タンパク質の濃度測定 A. A280測定の原理タンパク質A280法は、280 nmにおけるトリプトファン、チロシン、フェニルアラニン残基またはシステイン - システインジスルフィド結合と展示吸光度を含む精製タンパク質に適用可能である。このメソッドは、精製タンパク質の濃度を計算するための吸光係数またはモル吸光係数のどちらかと組み合わせてA280の吸光度値を使用しています。直接A280測定の利点は、標準曲線の生成はタンパク質濃度を決定するために必要とされていないことです。サンプルは、そのようなBCA、ピアース660nmの、ブラッドフォード、およびローリーアッセイとして光度計2000/2000cで利用可能な事前構成さ比色法、のいずれかを使用して、未知のタンパク質溶液、細胞溶解液、または粗タンパク質抽出物である場合は、お勧め。 B.微量タンパク質A280測定 - スタートアップ<ol><li>メインメニューからタンパク質A280アプリケーションを選択します。 </li><li>ドロップダウンリストから、測定する試料の種類を選択します。デフォルト設定は1 ABS = 1 mg / mLと最も未知のタンパク質の混合物をお勧めします。以前に特徴付け精製したタンパク質を測定する場合は、吸光係数またはモル吸光係数と分子量のどちらがより正確にタンパク質濃度を決定するために入力することができます。 </li><li>ドロップダウンリストから濃度の単位を選択してください。 </li></ol> C.微量タンパク質A280測定 - ブランキング<ol><li>適切なバッファを使用して空白を確立する。タンパク質を停止しているバッファを使用することが重要です。使用されるバッファは、同じpHと試料溶液と同様のイオン強度のはずです。注：RIPAバッファーは、280 nmであまりにも多くの吸光度を貢献するため、直接A280のタンパク質の測定値と互換性がありません。 RIPA緩衝液に懸濁してタンパク質においては、タンパク質濃度がRIPAバッファー互換性のある比色アッセイを用いて決定することをお勧めします。 </li><li>ピペット下部の台座の上に適切なブランク溶液2μL、アームを下げ、空白]をクリック。 </li><li>乾いたラボ用ワイプを使用して下限と上限の測定面からブランク溶液を拭き取ります。 </li></ol> D.測定微量タンパク質A280測定重要な考慮事項：サンプルの均質性は極めてですこのような小さな音量から重要が測定されている。静かに、試料が均質であることを確認し、徹底的に測定するための一定分量を服用する前に、直ちに試料を混合する。ミキシングとピペッティング時に気泡を導入することは避けてください。 異なるタンパク質間の表面張力の変動に起因する、我々は、適切な列の形成を確保するためにサンプルを2μLをロードすることをお勧めします。低リテンションピペットチップを必ず使用してください。ピペットチップの外側に付着するソリューションを防ぐために、ソリューションを追放しながらサンプルをロードするには、低い光学台座の表面にピペットの先端に触れる。パンクと試料中の気泡の侵入を防ぐため、サンプルの完全な量よりも少ない者を追放。 <ol><li>適切なフィールドでのサンプルIDを入力し、ブランクとクリックして測定のために説明したように、最初のサンプルの負荷2μL。サンプルの新鮮な2μlのアリコートを各測定に使用する必要があります。 </li><li>乾いたラボ用ワイプを使用して下限と上限の台座からサンプルを削除します。 </li></ol> E.クリーニング微量タンパク質A280測定通常、リントフリー、ラボペーパーでは、多くの場合、測定値間の光台座を掃除するのに十分です。 F.再調整タンパク質A280測定の操作界面活性剤を含む溶液や試薬は、フォームにサンプル液のカラムを防止する、時間をかけて測定部の表面を無条件性があります。下の台座の上に液滴の平坦化は、光学面は、無条件になることを示している。表面特性が危険にさらされている場合、台座を再調整すると、サンプルの列の形成を確保することが重要です。この問題が発生した場合、バフ精力的に実験室を使用して光学面は、指示通り光度計台座コンディショニング化合物（PR - 1）を拭いたり、使用してください。 III。比色定量法を用いた微量タンパク質の濃度測定 A.比色検出の原理光度計2000Cの分光光度計は、比色アッセイを用いて未知タンパク質溶液、細胞ライセート、および粗タンパク質抽出物を測定するために使用することができます。 比色法は、可視波長範囲の光を吸収する新しい複合体をサンプルのタンパク質成分と色素の相互作用を伴う間接的な方法です。 光度計2000C分光光度計は、BCA、ピアース660、ブラッドフォード、およびローリーの方法を含むいくつかの事前設定済みの比色定量法を持っています。 BCAアッセイは、微量分光光度計を使用して例比色アッセイとして実証される。 （スクリーンショット） BCA（ビシンコニン酸）アッセイは、しばしば重要なUV（280 nm）の吸光度を有する成分の存在下で希釈タンパク質溶液と蛋白質のために使用される一般的な比色法です。タンパク質A280法とは異なり、タンパク質BCA法は、サンプルのタンパク質濃度を測定する前に、検量線の作成が必要となります。 方法は、検出試薬としてビシンコニン酸（BCA）を使用します。タンパク質の存在下で形成された銅- BCAキレートは、562 nmで測定し、750 nmでノーマライズされます。 B.微量BCAアッセイ測定BCAアッセイの準備<ol><li> BCA試薬、BCA試薬B、互換性の試薬、再構成バッファ、およびアルブミン（BSA）の規格：必要な試薬は還元剤と互換性キット（。。サーモサイエンティフィックピアスカタログ番号23250）に含まれています。 </li><li>室温にすべての未知の蛋白質と蛋白質の基準を平衡化し、よく混ぜる。 </li><li>試薬の50:1比率を使用して測定する基準とサンプルのために十分な新鮮な作業試薬を準備します。B </li><li>マイクロアッセイのために、サンプルに試薬を作業の1:1の比率を使用してください。すべてのサンプルおよび標準をカバーするのに十分な管で各試験管に試薬を、作業の10μLを追加。高域のアッセイのために、サンプルに試薬を作業の20:1の比率を使用してください。すべてのサンプルおよび標準をカバーするのに十分な管で各試験管に試薬を働くの190μLを加える。あなたのサンプルに適している比率を決定するピアースBCAキット文献を参照してください。 </li><li>試薬を含む各チューブに標準またはサンプル10μLを加える。穏やかにボルテックスでよく混ぜる。 </li><li> 37チューブをインキュベート℃で30分間。 </li><li>反応は室温（〜10分）に平衡させる。 </li></ol> C.検量線を作成する微量BCAアッセイの測定<ol><li>メインメニューからのタンパク質BCA法を選択してください。波長の確認ウィンドウが表示された場合は、腕がダウンしていることを確認してください。 </li><li>右ペインのテーブル内の各標準濃度の値を入力します。ソフトウェアは、基準と最大7 additすることができますional規格。リファレンスおよび/または基準を複製するに測定する必要があります。 注：標準曲線を生成するための最小要件は、2つの規格の測定やゼロ基準と少なくとも1つの標準の測定値です。それは、追加の基準が期待されるアッセイの濃度範囲をカバーするために、必要に応じて含まれることをお勧めします。 </li><li>空白を確立する。比色アッセイのための空白は、一般的にH 2 Oを脱イオン</li><li>ピペット下部の台座の上にのdH 2 O 2μL、アームを下げ、空白]をクリック。唯一の空白は、基準や規格のすべての測定をカバーする必要があります。 </li><li>下の台座の上にタンパク質を持つ唯一の作業試薬およびバッファーを含む2μLアリコートをピペッティングすることにより基準を確立する。腕とクリックの測定を下げます。 </li><li>標準のタブの下に、下の台座上に所望の標準の必要な標準とピペット2μLを強調表示します。腕とクリックの測定を下げます。すべての規格のためのプロセスを繰り返します。測定サンプルの前にすべての基準を測定してください。標準曲線を表示するには、標準曲線の表示]をクリックします。 </li></ol> D.微量BCAアッセイ測定の実行2μLタンパク質測定<ol><li>規格のすべてが測定された後、サンプルのボタンをクリックしてください。サンプルIDを入力してください。下の台座の上に試料2μLをロードし、メジャー]をクリックします。サンプルの新鮮な2μLアリコートを各測定に使用する必要があります。 </li><li>乾いたラボ用ワイプを使用して下限と上限の台座からサンプルを拭き取ります。 </li></ol> E.微量BCAアッセイ測定クリーニングと再調整クリーニングと直接A280吸光度測定で説明されているように再調整を行います。 代表的な結果： 微量タンパク質の濃度測定は、直接A280測定または間接的な比色アッセイのいずれかで実行されます。 A280測定例では、目的のタンパク質の吸光係数に基づいてタンパク質濃度を決定する。 BCA比色アッセイの例は、既知のタンパク質濃度の標準曲線ベースのタンパク質濃度を決定する。

<ol>
	<li>Aitken, A., Learmonth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+determination+by+UV+absorption.">Protein determination by UV absorption.</a> , (1996).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).</li><li>Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A., Randall, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+measurement+with+the+Folin+phenol+reagent.">Protein measurement with the Folin phenol reagent.</a> J. Biol. Chem. 193, 265-275 (1951).</li><li>Reisner, A. H., Nemes, P., Bucholtz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Coomassie+Brilliant+Blue+G250+perchloric+acid+solution+for+staining+in+electrophoresis+and+isoelectric+focusing+on+polyacrilamide+gels.">Use of Coomassie Brilliant Blue G250 perchloric acid solution for staining in electrophoresis and isoelectric focusing on polyacrilamide gels.</a> Anal. Biochem. 64, 509-516 (1975).</li><li>Simonian, M. H., Smith, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrophotometric+and+colorimetric+determination+of+protein+concentration.">Spectrophotometric and colorimetric determination of protein concentration.</a> Curr. Protoc. Mol. Biol. 10:1A.17. , (2006).</li><li>Smith, P. K., Krohn, R. I., Hermanson, G. T., Mallia, A. K., Gartner, F. H., Provenzano, F. u. j. i. m. o. t. o., Goeke, E. K., Olson, N. M., J, B., Klenk, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid.">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Anal. Biochem. 150, 76-85 (1985).</li><li>Stoscheck, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+protein.">Quantitation of protein.</a> Meth. Enzymol. 182, 50-68 (1990).</li></ol>

著者は、この記事で使用される試薬やツールを生成するサーモフィッシャーサイエンティフィックの従業員です。

微量定量には2つの測定面の間に液柱を形成するために、試料の固有の表面張力のプロパティを使用しています。封じ込め装置がない場合は、パスの長さが本質的に希釈を行うために必要がなくなり、リアルタイムで変更することができます。この機能により、タンパク質濃度のダイナミックレンジだけでなく、測定の速度が向上します。サンプルの最小限の量を使用することにより、多数のサンプルは、科学者はより多くの測定を行い、より良い品質管理を達成できるよう、迅速かつ正確に分析することができます。さらに、必要に応じて、貴重なサンプルが測定を受けた後、回復することができます。このような小さなボリュームが測定されているときに、サンプルの均一性は、サンプリングエラーを回避することが非常に重要です。ローリテンションピペットチップは、常にロードするサンプルを使用する必要がありますとヒントはサンプル複製の間で変更する必要があります。台座の表面は適切に洗浄し、最も正確な結果を確保するために条件付けされている必要があります。最後に、サンプルが限られているときに微量分光光度計が理想です、しかし、使い易さ、速度、および分光器の広ダイナミックレンジは、サンプルが十分にあるときに適しています。

<table><tbody><tr><td>NanoDrop 2000c Spectrophotometer</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laboratory wipes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>23250</td><td>Reducing agent compatible</td></tr><tr><td>PR-1 Reconditioning Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

microvolume protein concentration determination using the nanodrop 2000c spectrophotometer

従来の分光光度計は、キュベットやキャピラリーにサンプルを配置する必要があります。これが原因で、しばしばタンパク質の解析に使用される限られたサンプル量にしばしば非現実的です。サーモ科学光度計2000C分光光度計では0.5〜2μLの低ボリュームで試料の定量を可能にする、液体の表面張力のプロパティを使用して2つの測定面の間に微量の試料を保持している革新的なサンプル保持システムでこの問題を解決します。キュベットやキャピラリーの除去は、大幅に測定可能なタンパク質濃度のダイナミックレンジを増加させながら測定時間を短縮経路長のリアルタイムの変化を、可能です。希釈の必要性も排除し、測定面が単にラボ用ワイプで拭くことができるようにサンプルの定量化のための準備が比較的容易であるされています。このビデオの記事では、A280吸光度またはBCA比色アッセイを用いてタンパク質の微量な量の定量化のための伝統的なタンパク質濃度の決定方法に変更を提示。

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Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer

微量のサンプルをキュベットまたは毛細血管を使用せずに試料を保持する天然の表面張力を使用する分光光度計システムにより定量化されています。それらを測定できるようにするためのタンパク質濃度と速度のダイナミックレンジが大幅にこの方法で増加している。

光度計2000C分光光度計を使った微量タンパク質の濃度測定

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often ...

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microvolume-protein-concentration-determination-using-nanodrop-2000c

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

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ビデオ: Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer

Counting Proteins in Single Cells with Addressable Droplet Microarrays

Often cellular behavior and cellular responses are analyzed at the population level where the responses of many cells are pooled together as an average result masking the rich single cell behavior within a complex population. Single cell protein detection and quantification technologies have made a remarkable impact in recent years. Here we describe a practical and flexible single cell analysis platform based on addressable droplet microarrays. This study describes how the absolute copy numbers of target proteins may be measured with single cell resolution. The tumor suppressor p53 is the most commonly mutated gene in human cancer, with more than 50% of total cancer cases exhibiting a non-healthy p53 expression pattern. The protocol describes steps to create 10 nL droplets within which single human cancer cells are isolated and the copy number of p53 protein is measured with single molecule resolution to precisely determine the variability in expression. The method may be applied to any cell type including primary material to determine the absolute copy number of any target proteins of interest.

Here we present addressable droplet microarrays (ADMs), a droplet array based method able to determine absolute protein abundance in single cells. We demonstrate the capability of ADMs to characterize the heterogeneity in expression of the tumor suppressor protein p53 in a human cancer cell line.

アドレス指定可能な液滴マイクロ アレイによる単一細胞におけるタンパク質をカウント

Often cellular behavior and cellular responses are analyzed at the population level where the responses of many cells are pooled together as an average ...

がん研究

Standards for Quantitative Metalloproteomic Analysis Using Size Exclusion ICP-MS

Metals are essential for protein function as cofactors to catalyze chemical reactions. Disruption of metal homeostasis is implicated in a number of diseases including Alzheimer's and Parkinson's disease, but the exact role these metals play is yet to be fully elucidated. Identification of metalloproteins encounters many challenges and difficulties. Here we report an approach that allows metalloproteins in complex samples to be quantified. This is achieved using size exclusion chromatography coupled with inductively coupled plasma - mass spectrometry (SEC-ICP-MS). Using six known metalloproteins, the size exclusion column can be calibrated and the respective trace elements (iron, copper, zinc, cobalt, iodine) can be used for quantification. SEC-ICP-MS traces of human brain and plasma are presented. The use of these metalloprotein standards provides the means to quantitatively compare metalloprotein abundances between biological samples. This technique is poised to help shed light on the role of metalloproteins in neurodegenerative disease as well as other diseases where imbalances in trace elements are implicated.

Size exclusion chromatography hyphenated with inductively coupled plasma - mass spectrometry (ICP-MS) is a powerful tool to measure changes in the abundance of metalloproteins directly from biological samples. Here we describe a set of metalloprotein standards used to estimate molecular mass and the amount of metal associated with unknown proteins.

サイズ排除ICP-MSを用いた定量Metalloproteomic分析のための基準

Metals are essential for protein function as cofactors to catalyze chemical reactions. Disruption of metal homeostasis is implicated in a number of ...

化学

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a technology for regenerative medicine2. Unlike viruses, which have significant safety issues, polymeric nanoparticles can be designed to be non-toxic, non-immunogenic, non-mutagenic, easier to synthesize, chemically versatile, capable of carrying larger nucleic acid cargo and biodegradable and/or environmentally responsive. Cationic polymers self-assemble with negatively charged DNA via electrostatic interaction to form complexes on the order of 100 nm that are commonly termed polymeric nanoparticles. Examples of biomaterials used to form nanoscale polycationic gene delivery nanoparticles include polylysine, polyphosphoesters, poly(amidoamines)s and polyethylenimine (PEI), which is a non-degradable off-the-shelf cationic polymer commonly used for nucleic acid delivery1,3 . Poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are a newer class of cationic polymers4 that are hydrolytically degradable5,6 and have been shown to be effective at gene delivery to hard-to-transfect cell types such as human retinal endothelial cells (HRECs)7, mouse mammary epithelial cells8, human brain cancer cells9 and macrovascular (human umbilical vein, HUVECs) endothelial cells10.
A new protocol to characterize polymeric nanoparticles utilizing nanoparticle tracking analysis (NTA) is described. In this approach, both the particle size distribution and the distribution of the number of plasmids per particle are obtained11. In addition, a high-throughput 96-well plate transfection assay for rapid screening of the transfection efficacy of polymeric nanoparticles is presented. In this protocol, poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are used as model polymers and human retinal endothelial cells (HRECs) are used as model human cells. This protocol can be easily adapted to evaluate any polymeric nanoparticle and any cell type of interest in a multi-well plate format.

A protocol for nanoparticle tracking analysis (NTA) and high-throughput flow cytometry to evaluate polymeric gene delivery nanoparticles is described. NTA is utilized to characterize the nanoparticle particle size distribution and the plasmid per particle distribution. High-throughput flow cytometry enables quantitative transfection efficacy evaluation for a library of gene delivery biomaterials.

ナノ粒子トラッキング分析とハイスループットフローサイトメトリーによる高分子遺伝子デリバリーナノ粒子の評価

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

生物工学

UV-Vis Spectroscopic Characterization of Nanomaterials in Aqueous Media

The physicochemical characterization of nanomaterials (NMs) is often an analytical challenge, due to their small size (at least one dimension in the nanoscale, i.e. 1&#8211;100 nm), dynamic nature, and diverse properties. At the same time, reliable and repeatable characterization is paramount to ensure safety and quality in the manufacturing of NM-bearing products. There are several methods available to monitor and achieve reliable measurement of nanoscale-related properties, one example of which is Ultraviolet-Visible Spectroscopy (UV-Vis). This is a well-established, simple, and inexpensive technique that provides non-invasive and fast real-time screening evaluation of NM size, concentration, and aggregation state. Such features make UV-Vis an ideal methodology to assess the proficiency testing schemes (PTS) of a validated standard operating procedure (SOP) intended to evaluate the performance and reproducibility of a characterization method. In this paper, the PTS of six partner laboratories from the H2020 project ACEnano were assessed through an interlaboratory comparison (ILC). Standard gold (Au) colloid suspensions of different sizes (ranging 5&#8211;100 nm) were characterized by UV-Vis at the different institutions to develop an implementable and robust protocol for NM size characterization.

This study presents the benchmarking results for an interlaboratory comparison (ILC) designed to test the standard operating procedure (SOP) developed for gold (Au) colloid dispersions characterized by ultraviolet-visible Spectroscopy (UV-Vis), amongst six partners from the H2020 ACEnano project for sample preparation, measurement, and analysis of the results.

水性メディアにおけるナノ材料のUV-Vis分光学的特性解析

The physicochemical characterization of nanomaterials (NMs) is often an analytical challenge, due to their small size (at least one dimension in the ...

工学

マイクロ流体による質量測光分析の濃度範囲の拡大

Analysis of Protein Complex Formation at Micromolar Concentrations by Coupling Microfluidics with Mass Photometry

Mass photometry is a versatile mass measurement technology that enables the study of biomolecular interactions and complex formation in solution without labels. Mass photometry is generally suited to analyzing samples in the 100 pM-100 nM concentration range. However, in many biological systems, it is necessary to measure more concentrated samples to study low-affinity or transient interactions. Here, we demonstrate a method that effectively expands the range of sample concentrations that can be analyzed by mass photometry from nanomolar to tens of micromolar. 
In this protocol, mass photometry is combined with a novel microfluidics system to investigate the formation of protein complexes in solution in the micromolar concentration range. With the microfluidics system, users can maintain a sample at a desired higher concentration followed by dilution to the nanomolar range - several milliseconds prior to the mass photometry measurement. Due to the speed of the dilution, data is obtained before the equilibrium of the sample has shifted (i.e., dissociation of the complex). 
The technique is applied to measure interactions between an immunoglobulin G (IgG) antibody and the neonatal Fc receptor, showing the formation of high-order complexes that were not quantifiable with static mass photometry measurements. 
In conclusion, the combination of mass photometry and microfluidics makes it possible to characterize samples in the micromolar concentration range and is proficient in measuring biomolecular interactions with weaker affinities. These capabilities can be applied in a range of contexts - including the development and design of biotherapeutics - enabling thorough characterization of diverse protein-protein interactions.

著者スポットライト:MassFluidixテクノロジーを使用した溶液中の低親和性タンパク質相互作用の特性評価

This protocol combines mass photometry with a novel microfluidics system to investigate low-affinity protein-protein interactions. This approach is based on the rapid dilution of highly concentrated complexes in solution, which enables low-affinity measurements and broadens the applicability of mass photometry.

マイクロ流体と質量測光の結合によるマイクロモル濃度でのタンパク質複合体形成の解析

Mass photometry is a versatile mass measurement technology that enables the study of biomolecular interactions and complex formation in solution without ...

生化学

NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional cuvette-based instruments for nucleic acid quantitation for those that can perform microvolume quantitation.
The NanoDrop microvolume sample retention system (Thermo Scientific NanoDrop Products) functions by combining fiber optic technology and natural surface tension properties to capture and retain minute amounts of sample independent of traditional containment apparatus such as cuvettes or capillaries. Furthermore, the system employs shorter path lengths, which result in a broad range of nucleic acid concentration measurements, essentially eliminating the need to perform dilutions. Reducing the volume of sample required for spectroscopic analysis also facilitates the inclusion of additional quality control steps throughout many molecular workflows, increasing efficiency and ultimately leading to greater confidence in downstream results.
The need for high-sensitivity fluorescent analysis of limited mass has also emerged with recent experimental advances. Using the same microvolume sample retention technology, fluorescent measurements may be performed with 2 &mu;L of material, allowing fluorescent assays volume requirements to be significantly reduced. Such microreactions of 10 &mu;L or less are now possible using a dedicated microvolume fluorospectrometer.
Two microvolume nucleic acid quantitation protocols will be demonstrated that use integrated sample retention systems as practical alternatives to traditional cuvette-based protocols. First, a direct A260 absorbance method using a microvolume spectrophotometer is described. This is followed by a demonstration of a fluorescence-based method that enables reduced-volume fluorescence reactions with a microvolume fluorospectrometer. These novel techniques enable the assessment of nucleic acid concentrations ranging from 1 pg/ &mu;L to 15,000 ng/ &mu;L with minimal consumption of sample.

The use of NanoDrop microvolume systems as practical and efficient alternatives to traditional nucleic acid quantitation methodology is described through the demonstration of two microvolume nucleic acid quantitation protocols.

核酸の光度計微量定量

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional ...

生物学

Concentration Determination of Nucleic Acids and Proteins Using the Micro-volume Bio-spec Nano Spectrophotometer

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades. More and more, molecular biologists require consistent small-volume analysis of nucleic acid samples for their experiments. The BioSpec-nano provides a potential solution to the problems of inaccurate, non-reproducible results, inherent in current DNA quantitation methods, via specialized optics and a sensitive PDA detector. The BioSpec-nano also has automated functionality such that mounting, measurement, and cleaning are done by the instrument, thereby eliminating tedious, repetitive, and inconsistent placement of the fiber optic element and manual cleaning.
In this study, data is presented on the quantification of DNA and protein, as well as on measurement reproducibility and accuracy. Automated sample contact and rapid scanning allows measurement in three seconds, resulting in excellent throughput. Data analysis is carried out using the built-in features of the software. The formula used for calculating DNA concentration is:
Sample Concentration = DF &middot; (OD260-OD320)&middot; NACF (1)
Where DF = sample dilution factor and NACF = nucleic acid concentration factor.
The Nucleic Acid concentration factor is set in accordance with the analyte selected1.
Protein concentration results can be expressed as &mu;g/ mL or as moles/L by entering e280 and molecular weight values respectively. When residue values for Tyr, Trp and Cysteine (S-S bond) are entered in the e280Calc tab, the extinction coefficient values are calculated as e280 = 5500 x (Trp residues) + 1490 x (Tyr residues) + 125 x (cysteine S-S bond). The e280 value is used by the software for concentration calculation.
In addition to concentration determination of nucleic acids and protein, the BioSpec-nano can be used as an ultra micro-volume spectrophotometer for many other analytes or as a standard spectrophotometer using 5 mm pathlength cells.

This communication presents data on the accuracy and reproducibility of the BioSpec-nano UV-VIS spectrophotometer for dsDNA and protein quantitation. Even with ultra-small volumes (1 to 2 L), reproducibility is excellent, while the automated wiping function improves throughput and results in minimal carryover for more precise results.

マイクロボリュームバイオスペックナノ分光光度計を用いて核酸およびタンパク質の濃度測定

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades.  More and more, molecular biologists require consistent ...

Methods to Discover Alternative Promoter Usage and Transcriptional Regulation of Murine Bcrp1

Gene expression in different tissues is often controlled by alternative promoters that result in the synthesis of mRNA with unique &#8212; usually untranslated &#8212; first exons. Bcrp1 (Abcg2), the murine orthologue of the ABC transporter Breast Cancer Resistance Protein (BCRP, ABCG2), has at least four alternative promoters that are designated by the corresponding four alternative first exons produced: E1U, E1A, E1B, and E1C. Herein, in-silico protocols are presented to predict alternative promoter usage for Bcrp1. Furthermore, reporter assay methods are described to produce reporter constructs for alternative promoters and to determine the functionality of putative promoters upstream of the alternative first exons that are identified.

With the murine ABC transporter Bcrp1 (Abcg2) as an example, in-silico protocols are presented to detect alternative promoter usage in genes expressed in mouse tissues, and to evaluate the functionality of the alternative promoters identified using reporter assays.

光度計2000C分光光度計を使った微量タンパク質の濃度測定

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アドレス指定可能な液滴マイクロアレイによる単一細胞におけるタンパク質をカウント

サイズ排除ICP-MSを用いた定量Metalloproteomic分析のための基準

ナノ粒子トラッキング分析とハイスループットフローサイトメトリーによる高分子遺伝子デリバリーナノ粒子の評価

水性メディアにおけるナノ材料のUV-Vis分光学的特性解析

マイクロ流体と質量測光の結合によるマイクロモル濃度でのタンパク質複合体形成の解析

マイクロ流体と質量測光の結合によるマイクロモル濃度でのタンパク質複合体形成の解析

マイクロ流体と質量測光の結合によるマイクロモル濃度でのタンパク質複合体形成の解析

核酸の光度計微量定量

マイクロボリュームバイオスペックナノ分光光度計を用いて核酸およびタンパク質の濃度測定

代替プロモーターの使用およびマウスBcrp1の転写調節を発見する方法

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