リチャードW.ベリンジャーとDavid L.アッシュ、技術支援及び撮影のためのアプリケーションの科学者、サーモサイエンティフィックの光度計の製品、。

1。光度計2000C分光光度計を用いて微量核酸の定量<ol><li>開始するには、下側の光学面にきれいな純水の2〜3μLをピペッティングすることにより微量分光光度計のサンプル保持システムの上限と下限の光学面をきれいに。 </li><li>レバーアームを閉じて、上側の台座は、脱イオン水と接触することを保証する。レバーアームを持ち上げ、きれいな、乾いた、糸くずの出ないラボペーパーで光学面の両方を拭き取ってください。 </li><li> NanoDropソフトウェアを開いて、核酸のアプリケーションを選択します。下側の光学面に緩衝液1μLを分注してブランク測定を行うために、少量の、校正済みのピペットを使用してください。レバーアームを下げ、核酸のアプリケーションで&quot;ブランク&quot;を選択します。 </li><li>一度ブランク測定が完了すると、きれいな、乾いた、糸くずの出ないラボペーパーで光学面の両方をきれいに。 </li><li>測定されるサンプルの適切な定数を選択してください。 <table border="1"><tbody><tr><td> サンプルの種類 </td><td> オプションを選択します。 </td><td> 濃度を計算するために使用される定数 </td></tr><tr><td> dsDNAを</td><td> DNA - 50 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> ssDNAを</td><td> DNA - 33 </td><td> 33 </td></tr><tr><td> RNA </td><td> RNA - 40 </td><td> 40 </td></tr><tr><td>オリゴ</td><td>カスタム</td><td> 15から150 </td></tr></tbody></table> 表1。光度計微量分光光度計、TrayCellマイクロキュベットを使用する従来のキュベットベースの分光光度計、およびPicoGreenアッセイと組み合わせて微量光度計のfluorospectrometerを使用して直接A280吸光度測定用の代表的な核酸の濃度範囲。 </li><li>下の光学台に核酸サンプルの1μLを分注し、レバーアームを閉じます。測定が独立したボリュームなので、サンプルはのみ行われる測定の2つの光学面の間のギャップを埋める必要があります。 </li><li>アプリケーションソフトの&quot;測定&quot;を選択します。ソフトウェアは自動的に核酸の濃度および純度の比率を計算します。サンプルの測定に続いて、スペクトル出力を確認してください。 </li><li>ソフトウェアは自動的に核酸の濃度および純度の比率を計算します。サンプルの測定に続いて、サンプルの品質を評価するためのスペクトル画像を確認してください。 </li><li>典型的な核酸のサンプルは、非常に特徴的なプロファイルを持つことになります。 <img src="/files/ftp_upload/2565/2565fig1.jpg" alt="図1" /> 図1代表的な核酸のサンプルは、非常に特徴的なプロファイルを持つことになります。 </li><li>特定の核酸の分離技術に関連する汚染物質の一般的な情報源は、フェノール/トリゾールと列の抽出などがあります。フェノール/トリゾール抽出の場合には、残留試薬の汚染は、220から240 nmの間の異常なスペクトルによってだけでなく、260〜280 nm領域の変化によって示されるかもしれません。逆に、列の抽出からの残留グアニジンは、230 nm付近のピークと230 nmから約240 nmの谷のシフトに貢献するかもしれない。 <img src="/files/ftp_upload/2565/2565fig2.jpg" alt="図2" /> （2）試料BとCのピークと谷の変化、汚染物質が核酸サンプルのスペクトルに影響を与えることができる方法を示す試料と比較して図 。 </li><li>正確にサンプルの品質を評価するために、280分の260または230分の260の比率は全体のスペクトルの質と組み合わせて分析する必要があります。純粋な核酸は、典型的にはそれぞれ、〜1.8の280分の260の比率とDNAとRNAのための〜2.0の280分の260比が得られる。この比率は、pHとブランクと試料の測定を行うために使用される緩衝液のイオン強度に依存しています。基本的な解決策は、0.2から0.3での比率をオーバー表す一方、酸性溶液は、0.2から0.3での比率を過小表します。大幅に異なる純度の比率は、280 nm付近で強く吸収されるタンパク質、フェノールやその他の汚染物質の存在を示すことがあります。 230分の260の純度比は1.8〜2.2の範囲で一般的に&quot;純粋な&quot;核酸の値を持つDNAの純度の第2の測定です。期待値よりも著しく低い純度の比率は、使用される分離技術はさらなる最適化を必要とする可能性を示している可能性があります。 </li><li>光度計分光光度計は、直接の吸光度を用いてタンパク質やタンパク質比色定量法によってを定量化するために使用することができます。適切な列の形成と再現性を確保するために、2μlの試料をタンパク質サンプルのためにお勧めします。微量タンパク質の濃度測定光度計分光光度計を使用して、次のJoveのビデオを参照してください<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/index/Details.stp?ID=1610">https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/index/Details.stp?ID=1610を</a> </li></ol><ol><li>光度計3300を用いた高感度微量核酸の定量を実証するために、PicoGreen蛍光キットが使用されます。開始するには、室温にキットの標準と、すべての核酸サンプルを平衡化してください。蛍光試料は光に敏感であり、黄色またはアルミラップチューブに保管する必要があります。 </li><li>必要とされるPicoGreen実用的なソリューションのためだけでなく、測定するすべての標準およびサンプルに十分な1 × TEバッファーを準備します。製造業者のプロトコルごとにヌクレアーゼフリー水で提供される20倍のTEバッファーを希釈することにより1xTEバッファを準備します。反応容量は、200μLからわずか10 ulの範囲で指定できます。この例では、10μLの反応ボリュームが用意されます。 </li><li>ヌクレアーゼフリーバイアルまたはチューブの2倍の最終的な所望の濃度で希釈した二本鎖DNAの基準を準備する。ヌクレアーゼフリーアンバーまたは箔で覆われたチューブラベルの付いた個々に希釈した二本鎖DNAの基準の各5μLを転送する。 </li><li>適切に標識されたヌクレアーゼフリーのアンバーや箔で覆われた管への関心の各二本鎖DNAの試料のアリコート5μL。 </li><li>製造業者のプロトコルに従ってPicoGreenワーキング溶液を調製。興味の標準またはサンプル（この例では5μL）のいずれかを含む各チューブにPicoGreenワーキング溶液に等量を転送する。 </li><li>リファレンスソリューションとして機能する負の制御を、準備するために1 × TEバッファーとPicoGreenワーキング溶液の等容量を兼ね備えています。 </li><li>穏やかなピペッティングでよく、各反応管の内容物を混合し、室温で5分間反応をインキュベートする。蛍光シグナルは温度によって影響されるすべてのスタンダードとサンプルは測定前に同じ温度に平衡化する必要があります。 </li><li>楽器を準備し、測定を実行するには、最初のサンプル保持システムの下限と上限の表面を清掃してください。下側の光学面上に脱イオン水の2〜3μLピペットは、近くにしてレバーアームを開いて、きれいな、糸くずの出ない、ラボ用ワイプで上下測定を汚点。表面はlintは励起源の存在下で蛍光を示すことと、測定に干渉することができるように進む前に糸くずのないことを確認します。 </li><li>測定器ソフトウェアを開いて、&quot;核酸&quot;アプリケーションを選択し、&quot;PicoGreen - dsDNAを&quot;オプションを選択します。 </li><li>楽器をブランクに、下の台座に1 × TEの2μLを追加し、アームを閉じて、測定器ソフトウェアの分野では&quot;ブランク&quot;を選択します。ブランクが完了すると、サンプル保持システムの両面から空のソリューションをオフ汚点。 </li><li>穏やかなピペッティングによる参照の解決を混ぜる。下の台座の上に低保持のヒント、ピペット2μLを使用し、アームを閉じてください。 </li><li>測定タイプの&quot;リファレンス&quot;を選択し、目的の単位を選択します。測定サイクルを開始する&quot;測定&quot;をクリック。 </li><li>測定サイクルが完了すると、腕を開いて、徹底的にサンプル保持システムの表面をオフに汚点。 5つまでの測定は、各レプリケートのための新鮮なアリコートを使用して、参照の複製。 </li><li>標準曲線を構築するために追加の標準のプロセスを繰り返します。最大7つの基準に使用することができます。ソフトウェアは、5にそれぞれの標準のための複製を格納するために設計されています。標準の複製サンプルの濃度を自動的に決定されるから標準曲線を生成するために平均化されています。 </li><li>標準曲線が完了すると、、&quot;サンプル&quot;タブを選択し、それぞれのサンプルのID情報を入力して、それぞれの未知試料を測定する。 </li></ol>

<ol><li>Wilfinger, W. W., Mackey, K., Chomczynski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+pH+and+Ionic+Strength+on+the+Spectrophotometric+Assessment+of+Nucleic+Acid+Purity%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Effect of pH and Ionic Strength on the Spectrophotometric Assessment of Nucleic Acid Purity.</a> BioTechniques. 22, 474-481 (1997).</li>
<li>Voolstra, C., Jungnickel, A., Borrmann, L., Kirchner, R., Huber, A. Spectrophotometric Quantification of Nucleic Acids: LabelGuard enables photometric quantification of submicroliter samples using a standard photometer. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVoolstra%2C+C+%22Implen+Applications+Note%22">Implen Applications Note</a>. , Munich, Germany. (2006).</li>
<li>Jr, I. ngle, D, J., Crouch, S. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJr%2C+Ingle+%22Spectrochemical+analysis%22">Spectrochemical analysis</a>. , Prentice Hall. Englewood Cliffs, NJ. XV-590 (1988).</li>
<li>Van Lancker, M., Gheyssens, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+four+frequently+used+assays+for+quantitative+determination+of+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Lett%22%5BJournal%5D)">A comparison of four frequently used assays for quantitative determination of DNA.</a> Anal. Lett. 19, 615-623 (1986).</li>
</ol>

フィリップデジャルダンとデブラコンクリンは、この資料に使用される楽器を作り出すサーモサイエンティフィック㈱エルプロダクツ株式会社によって雇用されている。

ここで紹介する定量プロトコルは、最も広く受け入れられている微量のシステムに基づいています。このようなシステムは、より大きなサンプルの量と封じ込め装置の使用に依存している伝統的な核酸の定量方法論、実用的な代替案を提供しています。 光度計微量技術は、液柱を形成するために、測定される試料の表面張力の特性に依存しているサンプル保持システムを採用しています。それは、サンプルが適切な列形成のための上限と下限の光学測定面に接触することが不可欠です。任意の時点での測定結果が再現が不正確かどうかと思われる場合は、それが最も可能性が高いサンプルの不均一性や液柱の破損の結果です。 洗剤やイソプロピルアルコールは、彼らが台座の測定面を無条件可能性があるため、洗浄剤を推奨されていません。無条件の台座には、サンプルの液滴の平坦化、その結果、台座の疎水性表面の特性が危険にさらされている場合に発生します。無条件の台座は、測定中に液柱の破損につながることができます。 <img src="/files/ftp_upload/2565/2565fig3.jpg" alt="図3" /> 図3。無条件の表面は、水滴の平坦化によって特徴付けられる。 Uncondtioned台座の表面は、光度計台座コンディショニング化合物（PR - 1、サーモサイエンティフィック㈱エルプロダクツ）を使用して再調整することができます。化合物を再調整の薄層が〜30秒間乾燥させ、上部と下部台座の表面に適用され、その後きれいな、乾いた、糸くずの出ないラボペーパーを使用してオフこすった。が正常に再調整状態は底部の台座の表面に適用した場合、最大ビーズ水滴によって特徴付けられる。 <img src="/files/ftp_upload/2565/2565fig4.jpg" alt="図4" /> 図は、4。再生された表面は、水滴のビーズアップによって特徴付けられる。 微量定量システムが大幅にサンプルの消費を削減し、より伝統的な定量化のシステムに比べて劇的に濃度範囲を増加させる。微量定量は、しばしばそのような針生検とレーザーキャプチャーマイクロダイセクションなどの限られた細胞集団が関与する状況を可能にする技術となっていますが、この手法の効率性と使いやすさは、それにも伝統的な核酸の定量方法に広く受け入れられている代替きましたと、サンプルが豊富です。

<table><tbody><tr><td>NanoDrop 2000c</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>ND-2000C</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 3300</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>ND-3300</td><td></td></tr></tbody></table>

nanodrop microvolume quantitation of nucleic acids

生体分子のアッセイは、継続的に多くの場合、微量の定量を行うことができるものについては核酸の定量のための従来のキュベットベースの計測器の使用を排除し、材料の徐々に少量を使用することを開発されています。 光度計微量サンプル保持システム（サーモサイエンティフィックの光度計の製品）などのキュベットやキャピラリーのような伝統的な封じ込め装置の独立したサンプルの微量をキャプチャして保持する光ファイバ技術と自然の表面張力の特性を組み合わせることで機能します。さらに、システムは本質的に希釈を行うために必要がなくなり、核酸濃度測定値の広い範囲につながる短いパスの長さを、採用しています。分光分析に必要なサンプルの量を減らすことはまた、多くの分子のワークフロー全体を通じて追加の品質管理の手順を含めることを容易に、効率を高め、最終的に下流の結果が大きな自信につながる。 限られた大量の高感度蛍光分析の必要性はまた、最近の実験の進歩で浮上している。同じ微量サンプル保持技術を用いて、蛍光の測定は、蛍光アッセイのボリュームの要件が大幅に削減できるように、材料の2μLを実行することができる。 10μL以下のようなmicroreactionsは、専用の微量fluorospectrometerを使用可能になりました。 二つの微量核酸の定量のプロトコルは、従来のキュベットベースのプロトコルへの実用的な代替案として、統合されたサンプル保持システムを使用することが実証されます。最初に、微量分光光度計を使用して直接A260吸光度法が説明されています。これは、微量fluorospectrometerで低次元ボリューム蛍光反応を可能にする蛍光ベースの方法のデモが続いている。これらの新しい技術は、1〜pg /μLのサンプルの最小限の消費量15,000 ng /μLのに至るまでの核酸濃度の評価を可能にします。

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NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids

従来の核酸の定量方法論への実践的かつ効率的な代替案として光度計微量システムの使用は、2つの微量核酸の定量プロトコルのデモンストレーションを通して説明されています。

核酸の光度計微量定量

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional ...

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nanodrop-microvolume-quantitation-of-nucleic-acids

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

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Methylated DNA Immunoprecipitation

The identification of DNA methylation patterns is a common procedure in the study of epigenetics, as methylation is known to have significant effects on gene expression, and is involved with normal development as well as disease 1-4. Thus, the ability to discriminate between methylated DNA and non-methylated DNA is essential for generating methylation profiles for such studies. Methylated DNA immunoprecipitation (MeDIP) is an efficient technique for the extraction of methylated DNA from a sample of interest 5-7. A sample of as little as 200 ng of DNA is sufficient for the antibody, or immunoprecipitation (IP), reaction. DNA is sonicated into fragments ranging in size from 300-1000 bp, and is divided into immunoprecipitated (IP) and input (IN) portions. IP DNA is subsequently heat denatured and then incubated with anti-5'mC, allowing the monoclonal antibody to bind methylated DNA. After this, magnetic beads containing a secondary antibody with affinity for the primary antibody are added, and incubated. These bead-linked antibodies will bind the monoclonal antibody used in the first step. DNA bound to the antibody complex (methylated DNA) is separated from the rest of the DNA by using a magnet to pull the complexes out of solution. Several washes using IP buffer are then performed to remove the unbound, non-methylated DNA. The methylated DNA/antibody complexes are then digested with Proteinase K to digest the antibodies leaving only the methylated DNA intact. The enriched DNA is purified by phenol:chloroform extraction to remove the protein matter and then precipitated and resuspended in water for later use. PCR techniques can be used to validate the efficiency of the MeDIP procedure by analyzing the amplification products of IP and IN DNA for regions known to lack and known to contain methylated sequences. The purified methylated DNA can then be used for locus-specific (PCR) or genome-wide (microarray and sequencing) methylation studies, and is particularly useful when applied in conjunction with other research tools such as gene expression profiling and array comparative genome hybridization (CGH) 8. Further investigation into DNA methylation will lead to the discovery of new epigenetic targets, which in turn, may be useful in developing new therapeutic or prognostic research tools for diseases such as cancer that are characterized by aberrantly methylated DNA 2, 4, 9-11.

This video demonstrates the protocol for methylated DNA immunoprecipitation (MeDIP). MeDIP is a two day procedure that selectively extracts methylated DNA fragments from a genomic DNA sample using antibodies with specificity for 5 -methylcytosine (anti-5 mC).

メチル化DNA免疫沈降

The identification of DNA methylation patterns is a common procedure in the study of epigenetics, as methylation is known to have significant effects on ...

生物学

Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often used for protein analysis. The Thermo Scientific NanoDrop 2000c Spectrophotometer solves this issue with an innovative sample retention system that holds microvolume samples between two measurement surfaces using the surface tension properties of liquids, enabling the quantification of samples in volumes as low as 0.5-2 &mu;L. The elimination of cuvettes or capillaries allows real time changes in path length, which reduces the measurement time while greatly increasing the dynamic range of protein concentrations that can be measured. The need for dilutions is also eliminated, and preparations for sample quantification are relatively easy as the measurement surfaces can be simply wiped with laboratory wipe. This video article presents modifications to traditional protein concentration determination methods for quantification of microvolume amounts of protein using A280 absorbance readings or the BCA colorimetric assay.

Microvolume samples are quantified by a spectrophotometer system that uses natural surface tension to retain samples without the use of cuvettes or capillaries. The dynamic range of protein concentrations and speed by which they can be measured are greatly increased with this method.

光度計2000C分光光度計を使った微量タンパク質の濃度測定

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often ...

Circulating MicroRNA Quantification Using DNA-binding Dye Chemistry and Droplet Digital PCR

Circulating (of cell-free) microRNAs (miRNAs) are released from cells into the blood stream. The amount of specific microRNAs in the circulation has been linked to a disease state and has the potential to be used as disease biomarker. A sensitive and accurate method for circulating microRNA quantification using a dye-based chemistry and droplet digital PCR technology has been recently developed. Specifically, using Locked Nucleic Acid (LNA)-based miRNA-specific primers with a green fluorescent DNA-binding dye in a compatible droplet digital PCR system it is possible to obtain the absolute quantification of specific miRNAs. Here, we describe how performing this technique to assess miRNA amount in biological fluids, such as plasma and serum, is both feasible and effective.

A sensitive and accurate method for cell-free microRNAs quantification using a dye-based chemistry and droplet digital PCR technology is described.

DNA結合色素化学と液滴デジタルPCRを使用したマイクロRNA定量循環

Circulating (of cell-free) microRNAs (miRNAs) are released from cells into the blood stream. The amount of specific microRNAs in the circulation has been ...

生物工学

<meta charset="utf8"></head><body>Precision DNAzyme ナノマシンによる識別型RNAおよびDNA分析

DNAzyme 10-23 - Based Nanomachines for Nucleic Acid Recognition

DNAzyme-based nanomachines (DNM) for the detection of DNA and RNA sequences (analytes) are multifunctional structures made of oligonucleotides. Their functions include tight analyte binding, highly selective analyte recognition, fluorescent signal amplification by multiple catalytic cleavages of a fluorogenic reporter substrate, and fluorogenic substrate attraction for an increase in sensor response. Functional units are attached to a common DNA scaffold for their cooperative action. The RNA-cleaving 10-23 DNMs feature&#160;improved sensitivity in comparison with non-catalytic hybridization probes. The stability of the DNM and the increased chances of substrate recognition are provided&#160;by a double-stranded DNA fragment,&#160;a tile. DNM can differentiate two analytes with a single nucleotide difference in a folded RNA and a double-stranded DNA and detect analytes at concentrations ~1000 times lower than other protein-free hybridization probes. This article presents the concept behind the diagnostic potential of DNA-nanomachine activity and overviews DNM design, assembly, and application&#160;in nucleic acid detection assays.

<meta charset="utf8"></head><body>著者スポットライト:DNAナノセンサーの進歩 – 分子検出における感度と選択性の課題への対処

The DNAzyme-based nanomachines can be used for highly selective and sensitive detection of nucleic acids. This article describes a detailed protocol for the design of DNAzyme-based nanomachines with a 10-23 core using free software and their application in the detection of an Epstein-Barr virus fragment as an example.

DNAzyme 10-23 - 核酸認識用ナノマシン

DNAzyme-based nanomachines (DNM) for the detection of DNA and RNA sequences (analytes) are multifunctional structures made of oligonucleotides. Their ...

生化学

Concentration Determination of Nucleic Acids and Proteins Using the Micro-volume Bio-spec Nano Spectrophotometer

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades. More and more, molecular biologists require consistent small-volume analysis of nucleic acid samples for their experiments. The BioSpec-nano provides a potential solution to the problems of inaccurate, non-reproducible results, inherent in current DNA quantitation methods, via specialized optics and a sensitive PDA detector. The BioSpec-nano also has automated functionality such that mounting, measurement, and cleaning are done by the instrument, thereby eliminating tedious, repetitive, and inconsistent placement of the fiber optic element and manual cleaning.
In this study, data is presented on the quantification of DNA and protein, as well as on measurement reproducibility and accuracy. Automated sample contact and rapid scanning allows measurement in three seconds, resulting in excellent throughput. Data analysis is carried out using the built-in features of the software. The formula used for calculating DNA concentration is:
Sample Concentration = DF &middot; (OD260-OD320)&middot; NACF (1)
Where DF = sample dilution factor and NACF = nucleic acid concentration factor.
The Nucleic Acid concentration factor is set in accordance with the analyte selected1.
Protein concentration results can be expressed as &mu;g/ mL or as moles/L by entering e280 and molecular weight values respectively. When residue values for Tyr, Trp and Cysteine (S-S bond) are entered in the e280Calc tab, the extinction coefficient values are calculated as e280 = 5500 x (Trp residues) + 1490 x (Tyr residues) + 125 x (cysteine S-S bond). The e280 value is used by the software for concentration calculation.
In addition to concentration determination of nucleic acids and protein, the BioSpec-nano can be used as an ultra micro-volume spectrophotometer for many other analytes or as a standard spectrophotometer using 5 mm pathlength cells.

This communication presents data on the accuracy and reproducibility of the BioSpec-nano UV-VIS spectrophotometer for dsDNA and protein quantitation. Even with ultra-small volumes (1 to 2 L), reproducibility is excellent, while the automated wiping function improves throughput and results in minimal carryover for more precise results.

マイクロボリュームバイオスペックナノ分光光度計を用いて核酸およびタンパク質の濃度測定

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades.  More and more, molecular biologists require consistent ...

Highly Efficient Ligation of Small RNA Molecules for MicroRNA Quantitation by High-Throughput Sequencing

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide resolution. This technique captures miRNAs by attaching 3&#8217; and 5&#8217; oligonucleotide adapters to miRNA molecules and allows de novo miRNA discovery. Coupling with powerful next-generation sequencing platforms, miR-Seq has been instrumental in the study of miRNA biology. However, significant biases introduced by oligonucleotide ligation steps have prevented miR-Seq from being employed as an accurate quantitation tool. Previous studies demonstrate that biases in current miR-Seq methods often lead to inaccurate miRNA quantification with errors up to 1,000-fold for some miRNAs1,2. To resolve these biases imparted by RNA ligation, we have developed a small RNA ligation method that results in ligation efficiencies of over 95% for both 3&#8217; and 5&#8242; ligation steps. Benchmarking this improved library construction method using equimolar or differentially mixed synthetic miRNAs, consistently yields reads numbers with less than two-fold deviation from the expected value. Furthermore, this high-efficiency miR-Seq method permits accurate genome-wide miRNA profiling from in vivo total RNA samples2.

MicroRNAs (miRNAs) are a widely conserved class of regulatory molecules. Here we describe a miRNA cloning method that relies upon two potent ligation steps followed by high-throughput sequencing. Our method permits accurate genome-wide quantitation of miRNAs.

ハイスループットシークエンシングによりマイクロRNA定量のための低分子RNA分子の高効率ライゲーション

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide ...

Simple Bulk Readout of Digital Nucleic Acid Quantification Assays

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are still not routinely applied, due to the cost and specific equipment associated with commercially available methods. Here we present a simplified method for readout of digital droplet assays using a conventional real-time PCR instrument to measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays.
We characterize the performance of the bulk readout assay using synthetic droplet mixtures and a droplet digital multiple displacement amplification (MDA) assay. Quantitative MDA particularly benefits from a digital reaction format, but our new method&#160;applies to any digital assay. For established digital assay protocols such as digital PCR, this method serves to speed up and simplify assay readout.
Our bulk readout methodology brings the advantages of partitioned assays without the need for specialized readout instrumentation. The principal limitations of the bulk readout methodology are reduced dynamic range compared with droplet-counting platforms and the need for a standard sample, although the requirements for this standard are less demanding than for a conventional real-time experiment. Quantitative whole genome amplification (WGA) is used to test for contaminants in WGA reactions and is the most sensitive way to detect the presence of DNA fragments with unknown sequences, giving the method great promise in diverse application areas including pharmaceutical quality control and astrobiology.

We describe an endpoint digital assay for quantifying nucleic acids with a simplified (analog) readout. We measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays using a standard qPCR machine rather than specialized instrumentation and confirm our results by microscopy.

デジタル核酸定量アッセイの簡単な一括読み出し

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are ...

Measuring Single-Cell Mitochondrial DNA Copy Number and Heteroplasmy Using Digital Droplet Polymerase Chain Reaction

The mammalian mitochondrial (mt)DNA is a small, circular, double-stranded, intra-mitochondrial DNA molecule, encoding 13 subunits of the electron transport chain. Unlike the diploid nuclear genome, most cells contain many more copies of mtDNA, ranging from less than 100 to over 200,000 copies depending on cell type. MtDNA copy number is increasingly used as a biomarker for a number of age-related degenerative conditions and diseases, and thus, accurate measurement of the mtDNA copy number is becoming a key tool in both research and diagnostic settings. Mutations in the mtDNA, often occurring as single nucleotide polymorphisms (SNPs) or deletions, can either exist in all copies of the mtDNA within the cell (termed homoplasmy) or as a mixture of mutated and WT mtDNA copies (termed heteroplasmy). Heteroplasmic mtDNA mutations are a major cause of clinical mitochondrial pathology, either in rare diseases or in a growing number of common late-onset diseases such as Parkinson's disease. Determining the level of heteroplasmy present in cells is a critical step in the diagnosis of rare mitochondrial diseases and in research aimed at understanding common late-onset disorders where mitochondria may play a role. MtDNA copy number and heteroplasmy have traditionally been measured by quantitative (q)PCR-based assays or deep sequencing. However, the recent introduction of ddPCR technology has provided an alternative method for measuring both parameters. It offers several advantages over existing methods, including the ability to measure absolute mtDNA copy number and sufficient sensitivity to make accurate measurements from single cells even at low copy numbers. Presented here is a detailed protocol describing the measurement of mtDNA copy number in single cells using ddPCR, referred to as droplet generation PCR henceforth, with the option for simultaneous measurement of heteroplasmy in cells with mtDNA deletions. The possibility of expanding this method to measure heteroplasmy in cells with mtDNA SNPs is also discussed.

Here we present a protocol for measuring absolute mitochondrial (mt)DNA copy number and mtDNA deletion heteroplasmy levels in single cells.

核酸の光度計微量定量

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要約

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メチル化DNA免疫沈降

光度計2000C分光光度計を使った微量タンパク質の濃度測定

DNA結合色素化学と液滴デジタルPCRを使用したマイクロRNA定量循環

DNAzyme 10-23 - 核酸認識用ナノマシン

DNAzyme 10-23 - 核酸認識用ナノマシン

DNAzyme 10-23 - 核酸認識用ナノマシン

マイクロボリュームバイオスペックナノ分光光度計を用いて核酸およびタンパク質の濃度測定

ハイスループットシークエンシングによりマイクロRNA定量のための低分子RNA分子の高効率ライゲーション

デジタル核酸定量アッセイの簡単な一括読み出し

デジタル液滴ポリメラーゼ連鎖反応を用いた単一細胞ミトコンドリアDNAコピー数とヘテロプラスミーの測定(英語)