I. NanoDrop 2000c 분광 NanoDrop 기술 cuvettes 또는 모세 혈관의 사용없이 2 광학 받침대 사이 microvolume 샘플을 보유하고 측정하는 표면 장력을 사용하는 혁신적인 샘플 유지 시스템을 기반으로합니다. NanoDrop 2000c 분광 광도계는 빠르고 쉽게 0.5-2 단백질 μL 방울, DNA, RNA 및 기타 biomolecules을 측정하기 위해이 기술을 사용합니다. 분자 기법을 지속적으로 분석 물질의 작은 금액을 사용하는 발전으로이 기능은 점점 더 중요 해지고있다. 샘플이 제한되는 조건에 대한 microvolume 분광 광도계의 이상적. 시료의 충분한 양을 사용할 때 그러나 쉬운의 사용, 빠른 측정주기와, 그리고 다양한 농도 범위는 또한 분광 광도계가 적합합니다. 측정주기는 크게 과학자들이 자신의 워크플로우 전반에 걸쳐 효율성을 높이는 데 도움이 줄어 듭니다. microsample는 감지 표면 위에 직접 위치하고 있으며 액체 열은 표면 장력에 의해 광섬유의 끝부분 사이에 생성됩니다. 이 액체 열은 수직 광 경로를 형성한다. 크세논 플래시 램프는 광원과 선형 CCD 배열이 시료를 통과 빛을 분석하는 데 사용됩니다 활용 분광계를 제공합니다. 시스템에서 같은 cuvettes 전통 억제 장치를 제거하면 몇 가지 장점이 있습니다 : 샘플의 매우 작은 양의 측정을 위해 필요한, ​​청소는 단순히 무기를 닦아와 광학 표면을 닦아 내고 필요로하고, 경로 길이가 측정하는 동안 실시간으로 변경할 수 있습니다. NanoDrop 2000c는 dilutions없이 가능한 단백질 농도 측정의 가장 광범위한 범위를 제공 (1 mm까지 0.05 ㎜) 자동으로 최적의 경로 길이를 결정합니다. 경로 길이를 단축함으로써, 단백질의 높은 농도는 측정할 수 있습니다. 이것은 효과적으로 대부분의 단백질 샘플 dilutions을 수행하기 위해 필요를 제거합니다. 예를 들어, NanoDrop 2000c 400 MG / ML만큼 높은 BSA의 농도를 측정할 수 있습니다. NanoDrop 2000c 분광은 DNA, RNA, 단백질 및 기타 biomolecules의 흡광도를 측정하는 전체 스펙트럼 분광 광도계이다. 이 비디오 프로토콜은 단백질의 측정에 초점을 맞출 것이다. II. A280 흡광도 측정을 사용하여 Microvolume 단백질 농도 결정 A. A280 측정 원리 단백질 A280 방법은 280 nm의에서 트립토판, 티로신, 페닐알라닌 잔류물 또는 시스테인 - 시스테인 disulphide 채권 및 전시 흡광도를 포함하는 단백질을 정화하기 위해 적용됩니다. 이 방법은 정화 단백질의 농도를 계산하기 위해 대량 멸종 계수 또는 어금니 흡광 계수 중 하나와 함께 A280 흡광도 값을 사용합니다. 직접 A280 측정의 장점은 표준 곡선의 생성이 단백질 농도를 결정하기 위해 필요하지 않습니다 것입니다. 샘플 uncharacterized 단백질 솔루션, 휴대 lysate, 또는 조잡한 단백질 추출물 경우, 다음과 같은 BCA, 피어스 660 NM, 브래드 포드, 그리고 로리 assays로 NanoDrop 2000/2000c에서 사용할 수있는 미리 구성된 colorimetric 방법 중 하나입니다 사용 좋습니다. B. Microvolume 단백질 A280 측정 - 시작 <ol><li> 주 메뉴에서 단백질 A280 응용 프로그램을 선택합니다. </li><li> 드롭 다운 목록에서 측정 샘플의 유형을 선택합니다. 기본 설정은 대부분의 알려지지 않은 단백질 혼합물있는 1 애비 = 1 MG / ML. 권장합니다 이전 특징 정화 단백질을 측정하는 경우에는 대량 멸종 계수 또는 어금니 흡광 계수와 분자량도 더 정확하게 단백질 농도를 결정하기 위해 입력할 수 있습니다. </li><li> 드롭 다운 목록에서 농도 단위를 선택합니다. </li></ol> C. Microvolume 단백질 A280 측정 - 블랭킹 <ol><li> 적절한 버퍼를 사용하여 빈을 설정합니다. 단백질이 정지되는 버퍼를 사용하는 것이 중요합니다. 사용되는 버퍼 같은 산도 및 샘플 솔루션으로 비슷한 이온 강도의해야합니다. 참고 : 리파 버퍼는 280 nm의 흡광도에서 너무 많이 기여하고 따라서 직접 A280 단백질 측정과 호환되지 않습니다. 리파 버퍼에 일시 중지 단백질의 경우, 그것은 단백질 농도가 리파 버퍼 호환 colorimetric 분석을 사용하여 결정하는 것이 좋습니다. </li><li> 하단 받침대에 해당 블랭킹 솔루션의 피펫 2 μL은 팔을 절감하고 빈을 클릭합니다. </li><li> 마른 실험실이 닦아 사용하여 낮은과 상부 받침대에서 빈 솔루션을 닦아주십시오. </li></ol> D. 측정 Microvolume 단백질 A280 측정 중요 고려 사항 : 샘플의 균질성은 매우있다이러한 작은 볼륨부터 중요한이 측정되고있다. 부드럽게, 샘플 동질적인 것을 보장하지만 철저하게 측정 나누어지는을 복용하기 전에 즉시 샘플을 혼합합니다. 혼합 및 pipetting 할 때 거품을 도입하지 마십시오. 다른 단백질 사이의 표면 장력의 변화로 인해, 우리는 적절한 열 형성을 위해 샘플을 2 μL를 로드할 것을 권장합니다. 낮은 유지 피펫 팁을 항상 사용합니다. 피펫 팁의 외부로 준수의 솔루션을 방지하기 위해 솔루션을 추방하면서 샘플을로드하려면, 아래 광학 받침대 표면에 피펫 팁을 터치. 폭발 및 샘플의 거품의 도입을 방지하기 위해 샘플의 전체 금액보다 적은 금액을 추방. <ol><li> 해당 필드에 샘플 ID를 입력 빈을 클릭 법안에 대한 설명으로 첫 번째 예제 2 μL를로드합니다. 시료의 신선한 2μL 나누어지는 각 측정에 사용해야합니다. </li><li> 마른 실험실이 닦아 사용하여 낮은과 상부 받침대에서 샘플을 제거합니다. </li></ol> E. 청소 Microvolume 단백질 A280 측정 일반 보푸라기가없는, 실험실 닦아 자주 측정 사이의 광학 받침대 청소 충분합니다. F. Reconditioning 단백질 A280 측정 만들기 계면 활성제를 포함하는 솔루션 및 시약은 양식 샘플 액체 열 방지, 시간이 지남에 따라 측정 페데 스탈 표면을 uncondition 수 있습니다. 하단 받침대에있는 비말의 평평화은 광학 표면이 무조건 될 나타내는 것입니다. 표면 특성에 문제가있다면, 받침대를 reconditioning하면 샘플 열 형성을 보장하는 것이 중요합니다. 이 문제가 발생하면 털많은 적극적으로 실험실 닦아 또는 지시대로 (PR - 1) NanoDrop 받침대 Reconditioning 컴파 운드를 사용을 사용하여 광학 표면. III. Colorimetric Assays를 사용 Microvolume 단백질 농도 결정 A. colorimetric 검출의 원리 NanoDrop 2000c 분광 광도계는 colorimetric assays를 사용하여 uncharacterized 단백질 솔루션, 세포 lysates, 그리고 원유 단백질 추출물을 측정하는 데 사용할 수 있습니다. Colorimetric 방법은 보이는 파장 범위의 빛을 흡수하는 새로운 복합을 생산하기 위해 샘플의 단백질 구성 요소와 염료의 상호 작용을 포함 간접 방법입니다. NanoDrop 2000c 분광 광도계는 BCA, 피어스 660, 브래드 포드, 그리고 로리 방법 등 여러 가지 사전 구성된 colorimetric assays 있습니다. BCA의 분석은 microvolume 분광 광도계를 사용하여 예제 colorimetric 분석으로 입증됩니다. (스크린샷) BCA (Bicinchoninic의 산성) 분석은 종종 중요한 UV (280 nm의) 흡광도를 구성 요소의 존재에 희석 단백질 솔루션 및 단백질에 사용되는 일반적인 colorimetric 방법입니다. 단백질 A280 방법과는 달리 단백질 BCA 방법은 샘플의 단백질 농도를 측정하기 전에 표준 곡선이 생성되어야합니다. 방법은 검출 시약으로 bicinchoninic 산성 (BCA)를 사용합니다. 단백질의 존재에 형성 잘라내기 - BCA 킬레이트는 562 nm의에서 측정하여 750 nm의에 정상화됩니다. B. Microvolume BCA 분석 측정 BCA 분석 준비 <ol><li> BCA 시약, BCA 시약의 B, 호환성 시약, Reconstitution 버퍼, 그리고 알부민 (BSA) 기준 : 필요한 시약은 감소 에이전트 호환 키트 (.. 써모 과학 피어스 고양이도 23250)에 포함되어 있습니다. </li><li> 상온의 모든 미지의 단백질과 단백질 수준을 평형 철저히 섞는다. </li><li> 시약의 5​​0:1 비율을 사용하여 표준과 측정에 샘플을 충분히 신선한 작업 시약 준비 : B </li><li> 마이크로 분석을 위해, 샘플 위해 노력 시약의 1:1 비율을 사용합니다. 모든 샘플과 표준을 감추기에 충분 할만큼 튜브를 각 튜브에 시약을 조사하고 10 μL를 추가합니다. 높은 범위 분석의 경우, 샘플 위해 노력 시약의 20시 1분 비율을 사용합니다. 모든 샘플과 표준을 감추기에 충분 할만큼 튜브를 각 튜브에 시약을 조사하고 190 μL를 추가합니다. 귀하의 샘플에 적합하는 비율 결정하는 피어스 BCA 키트 문학을 참조하십시오. </li><li> 시약을 포함하는 각각의 튜브에 표준 또는 샘플 10 μL를 추가합니다. 부드럽게 vortexing하여 잘 섞는다. </li><li> 37 튜브를 품어 ° C를 30 분. </li><li> 반응이 실온 (~ 10 분) 평형 수 있습니다. </li></ol> C. 표준 곡선을 생성 Microvolume BCA 분석 측정 <ol><li> 주 메뉴에서 단백질 BCA 방법을 선택합니다. 파장 확인 창이 나타나면, 팔을 아래로 있는지 확인하십시오. </li><li> 오른쪽 창에서 테이블에있는 각 표준 농도에 대한 값을 입력합니다. 이 소프트웨어는 참조 최대 7 addit을 허용ional 기준. 참조 및 / 또는 표준 복제로 측정해야합니다. 참고 : 표준 곡선 생성을위한 최소 요구 사항이 두 표준의 측정 또는 제로 참조와 하나 이상의 표준의 측정이다. 그것은 추가적인 기준은 예상 분석 농도 범위를 커버하기 위해 필요한 포함하는 것이 좋습니다. </li><li> 빈을 설정합니다. colorimetric assays에 대한 공백은 일반적으로 H 2 O.을 deionized입니다 </li><li> 하단 받침대에 DH 2 O의 피펫 2 μL은 팔을 절감하고 빈을 클릭합니다. 단 한 빈은 참조 및 표준의 모든 후속 측정을 충당하기 위해 필요합니다. </li><li> 하단 받침대에 단백질에만 작업 시약 및 버퍼를 포함하는 2 μL 나누어지는을 pipetting하여 참조를 설정합니다. 팔과 클릭 법안을 낮추십시오. </li><li> 표준 탭에서 하단 받침대에 원하는 표준의 원하는 표준 및 피펫 2 μL를 강조 표시합니다. 팔과 클릭 법안을 낮추십시오. 모든 표준에 대한 과정을 반복합니다. 측정 샘플을하기 전에 모든 기준을 측정해야합니다. 표준 곡선을 보려면하면 표준 곡선보기를 누릅니다. </li></ol> D. Microvolume BCA 분석 측정 2 μL 단백질 측정 할 <ol><li> 표준의 모든 측정되었습니다 후 샘플 버튼을 클릭합니다. 샘플 ID를 입력하십시오. 하단 받침대에 시료 2 μL를로드하고 법안을 클릭합니다. 시료의 신선한 2 μL 나누어지는 각 측정에 사용해야합니다. </li><li> 마른 실험실이 닦아 사용하여 낮은과 상부 받침대에서 샘플을 닦아주십시오. </li></ol> E. Microvolume BCA 분석 측정 청소 및 Reconditioning 청소와 직접 A280 흡광도 측정에서 설명한대로 reconditioning을 수행합니다. 대표 결과 : Microvolume 단백질 농도 결정은 직접 A280 측정 또는 간접적 colorimetric 분석에 의해 수행됩니다. A280 측정 예제는 관심의 단백질의 흡광 계수에 따라 단백질 농도를 결정합니다. BCA colorimetric 분석 예제는 알려진 단백질 농도의 표준 곡선을 기반으로 단백질 농도를 결정합니다.

<ol><li>Aitken, A., Learmonth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+determination+by+UV+absorption%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Protein determination by UV absorption.</a> , (1996).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A., Randall, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+measurement+with+the+Folin+phenol+reagent%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Protein measurement with the Folin phenol reagent.</a> J. Biol. Chem. 193, 265-275 (1951).</li>
<li>Reisner, A. H., Nemes, P., Bucholtz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Coomassie+Brilliant+Blue+G250+perchloric+acid+solution+for+staining+in+electrophoresis+and+isoelectric+focusing+on+polyacrilamide+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Use of Coomassie Brilliant Blue G250 perchloric acid solution for staining in electrophoresis and isoelectric focusing on polyacrilamide gels.</a> Anal. Biochem. 64, 509-516 (1975).</li>
<li>Simonian, M. H., Smith, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectrophotometric+and+colorimetric+determination+of+protein+concentration%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Mol.+Biol.+10%3A1A.17%22%5BJournal%5D)">Spectrophotometric and colorimetric determination of protein concentration.</a> Curr. Protoc. Mol. Biol. 10:1A.17. , (2006).</li>
<li>Smith, P. K., Krohn, R. I., Hermanson, G. T., Mallia, A. K., Gartner, F. H., Provenzano, F. ujimoto, Goeke, E. K., Olson, N. M., J, B., Klenk, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Anal. Biochem. 150, 76-85 (1985).</li>
<li>Stoscheck, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Meth.+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Quantitation of protein.</a> Meth. Enzymol. 182, 50-68 (1990).</li>
</ol>

저자는이 문서에서 사용하는 시약 및 도구를 만들어 써모 피셔 사이 언티픽의 직원입니다.

Microvolume의 quantitation 두 측정 표면 사이에 액체 열을 형성하는 샘플의 내장 표면 장력 속성을 사용합니다. 억제 장치의 부재는 경로 길이는 본질적으로 dilutions을 수행하기 위해 않아도, 실시간으로 변경할 수 있습니다. 이 기능은 대폭 단백질 농도의 동적 범위뿐만 아니라 측정의 속도를 증가시킵니다. 시료의 최소 금액을 사용하여 샘​​플의 큰 숫자는 과학자들이 더 많은 측정을하고 더 나은 품질 관리를 달성할 수 있도록 신속하고 정확하게 분석할 수 있습니다. 또한, 필요한 경우, 소중한 샘플은 측정을 복용 후 복구할 수 있습니다. 이러한 작은 볼륨 측정되는 경우, 샘플 균질성은 샘플링 오류를 피하기 위해 매우 중요합니다. 낮은 유지 피펫 팁 항상 로딩 샘플 사용해야하고 예제 복제 사이의 팁을 변경해야합니다. 페데 스탈 표면이 제대로 청소하고 가장 정확한 결과를 보장하기 위해 냉방해야합니다. 샘플이 제한되었을 때 마지막으로, microvolume 분광 광도계가 이상적입니다, 그러나 쉬운의 사용, 속도 및 분광계의 광범위한 다이나믹 범위는 샘플이 풍부한 경우가 적합합니다.

<table><tbody><tr><td>NanoDrop 2000c Spectrophotometer</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laboratory wipes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>23250</td><td>Reducing agent compatible</td></tr><tr><td>PR-1 Reconditioning Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

microvolume protein concentration determination using the nanodrop 2000c spectrophotometer

전통 분광 광도법은 cuvettes이나 모세 혈관에 샘플을 배치해야합니다. 이것은 종종 인해 종종 단백질 분석에 사용되는 제한된 샘플 볼륨을 모르시는 것입니다. 써모 과학 NanoDrop 2000c 분광은 0.5-2 μL으로 낮은 볼륨의 샘플 부량를 활성화, 액체의 표면 장력 특성을 사용하여 두 측정 표면 사이 microvolume 샘플을 보유하고 혁신적인 샘플 유지 시스템과 함께이 문제를 해결합니다. cuvettes이나 모세 혈관의 제거는 크게 측정할 수 단백질 농도의 동적 범위를 증가하는 동안 측정 시간을 단축 경로의 길이는 실시간으로 변경을하실 수 있습니다. dilutions에 대한 필요도 제거하고, 측정 표면은 단순히 무기를 닦아와 함께 닦아 수 있듯이 샘플 부량 준비는 비교적 간단합니다. 이 동영상이 문서에서는 A280 흡광도 수치 또는 BCA colorimetric 분석을 사용하여 단백질의 microvolume 금액의 부량 전통 단백질 농도 결정 방법 수정 사항을 제공합니다.

Watch this Scientific Journal Video about Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer at JoVE.com

Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer

Microvolume 샘플 cuvettes이나 모세 혈관의 사용없이 샘플을 유지하기 위해 천연 표면 장력을 사용하는 분광 광도계 시스템 계량입니다. 그들이 측정 수있는 단백질 농도와 속도의 동적 범위는 크게이 방법으로 증가하고 있습니다.

NanoDrop 2000c 분광을 사용 Microvolume 단백질 농도 결정

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often ...

<a class="grey_button" href="/video/1770">&#x4E2D;&#x6587;</a><a class="grey_button" href="/video/1920">Deutsch</a> <a class="grey_button" href="/video/1921">Fran&#231;ais</a> <a class="grey_button" href="/video/1922"> Espa&ntilde;ol </a> <a class="grey_button" href="/video/2187"> &#x65E5;&#x672C;&#x8A9E; </a>

microvolume-protein-concentration-determination-using-nanodrop-2000c

Research

JoVE Journal

Biology

114.5K 조회수.  Thermo Scientific NanoDrop Products. 中文Deutsch Français Español 日本語 

비디오: Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer

Counting Proteins in Single Cells with Addressable Droplet Microarrays

Often cellular behavior and cellular responses are analyzed at the population level where the responses of many cells are pooled together as an average result masking the rich single cell behavior within a complex population. Single cell protein detection and quantification technologies have made a remarkable impact in recent years. Here we describe a practical and flexible single cell analysis platform based on addressable droplet microarrays. This study describes how the absolute copy numbers of target proteins may be measured with single cell resolution. The tumor suppressor p53 is the most commonly mutated gene in human cancer, with more than 50% of total cancer cases exhibiting a non-healthy p53 expression pattern. The protocol describes steps to create 10 nL droplets within which single human cancer cells are isolated and the copy number of p53 protein is measured with single molecule resolution to precisely determine the variability in expression. The method may be applied to any cell type including primary material to determine the absolute copy number of any target proteins of interest.

Here we present addressable droplet microarrays (ADMs), a droplet array based method able to determine absolute protein abundance in single cells. We demonstrate the capability of ADMs to characterize the heterogeneity in expression of the tumor suppressor protein p53 in a human cancer cell line.

주소 지정이 가능한 물방울 Microarrays 단일 셀에서 단백질을 계산

Often cellular behavior and cellular responses are analyzed at the population level where the responses of many cells are pooled together as an average ...

연구

암 연구학

Standards for Quantitative Metalloproteomic Analysis Using Size Exclusion ICP-MS

Metals are essential for protein function as cofactors to catalyze chemical reactions. Disruption of metal homeostasis is implicated in a number of diseases including Alzheimer's and Parkinson's disease, but the exact role these metals play is yet to be fully elucidated. Identification of metalloproteins encounters many challenges and difficulties. Here we report an approach that allows metalloproteins in complex samples to be quantified. This is achieved using size exclusion chromatography coupled with inductively coupled plasma - mass spectrometry (SEC-ICP-MS). Using six known metalloproteins, the size exclusion column can be calibrated and the respective trace elements (iron, copper, zinc, cobalt, iodine) can be used for quantification. SEC-ICP-MS traces of human brain and plasma are presented. The use of these metalloprotein standards provides the means to quantitatively compare metalloprotein abundances between biological samples. This technique is poised to help shed light on the role of metalloproteins in neurodegenerative disease as well as other diseases where imbalances in trace elements are implicated.

Size exclusion chromatography hyphenated with inductively coupled plasma - mass spectrometry (ICP-MS) is a powerful tool to measure changes in the abundance of metalloproteins directly from biological samples. Here we describe a set of metalloprotein standards used to estimate molecular mass and the amount of metal associated with unknown proteins.

Metals are essential for protein function as cofactors to catalyze chemical reactions. Disruption of metal homeostasis is implicated in a number of ...

화학

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a technology for regenerative medicine2. Unlike viruses, which have significant safety issues, polymeric nanoparticles can be designed to be non-toxic, non-immunogenic, non-mutagenic, easier to synthesize, chemically versatile, capable of carrying larger nucleic acid cargo and biodegradable and/or environmentally responsive. Cationic polymers self-assemble with negatively charged DNA via electrostatic interaction to form complexes on the order of 100 nm that are commonly termed polymeric nanoparticles. Examples of biomaterials used to form nanoscale polycationic gene delivery nanoparticles include polylysine, polyphosphoesters, poly(amidoamines)s and polyethylenimine (PEI), which is a non-degradable off-the-shelf cationic polymer commonly used for nucleic acid delivery1,3 . Poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are a newer class of cationic polymers4 that are hydrolytically degradable5,6 and have been shown to be effective at gene delivery to hard-to-transfect cell types such as human retinal endothelial cells (HRECs)7, mouse mammary epithelial cells8, human brain cancer cells9 and macrovascular (human umbilical vein, HUVECs) endothelial cells10.
A new protocol to characterize polymeric nanoparticles utilizing nanoparticle tracking analysis (NTA) is described. In this approach, both the particle size distribution and the distribution of the number of plasmids per particle are obtained11. In addition, a high-throughput 96-well plate transfection assay for rapid screening of the transfection efficacy of polymeric nanoparticles is presented. In this protocol, poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are used as model polymers and human retinal endothelial cells (HRECs) are used as model human cells. This protocol can be easily adapted to evaluate any polymeric nanoparticle and any cell type of interest in a multi-well plate format.

A protocol for nanoparticle tracking analysis (NTA) and high-throughput flow cytometry to evaluate polymeric gene delivery nanoparticles is described. NTA is utilized to characterize the nanoparticle particle size distribution and the plasmid per particle distribution. High-throughput flow cytometry enables quantitative transfection efficacy evaluation for a library of gene delivery biomaterials.

고분자 유전자 배달에 대한 평가는 Nanoparticle 추적 분석 및 높은 처리량 유동 세포 계측법에 의해 나노 입자

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

생체공학

Quantification and Size-profiling of Extracellular Vesicles Using Tunable Resistive Pulse Sensing

Extracellular vesicles (EVs), including &#8216;microvesicles&#8217; and &#8216;exosomes&#8217;, are highly abundant in bodily fluids. Recent years have witnessed a tremendous increase in interest in EVs. EVs have been shown to play important roles in various physiological and pathological processes, including coagulation, immune responses, and cancer. In addition, EVs have potential as therapeutic agents, for instance as drug delivery vehicles or as regenerative medicine. Because of their small size (50 to 1,000 nm) accurate quantification and size profiling of EVs is technically challenging.
This protocol describes how tunable resistive pulse sensing (tRPS) technology, using the qNano system, can be used to determine the concentration and size of EVs. The method, which relies on the detection of EVs upon their transfer through a nano sized pore, is relatively fast, suffices the use of small sample volumes and does not require the purification and concentration of EVs. Next to the regular operation protocol an alternative approach is described using samples spiked with polystyrene beads of known size and concentration. This real-time calibration technique can be used to overcome technical hurdles encountered when measuring EVs directly in biological fluids.

Extracellular vesicles play important roles in physiological and pathological processes, including coagulation, immune responses, and cancer or as potential therapeutic agents in drug delivery or regenerative medicine. This protocol presents methods for the quantification and size characterization of isolated and non-isolated extracellular vesicles in various fluids using tunable resistive pulse sensing.

정량화 및 조정 가능한 저항 펄스 감지 기능을 사용하여 세포 외 소포의 크기 프로파일 링

Extracellular vesicles (EVs), including &#8216;microvesicles&#8217; and &#8216;exosomes&#8217;, are highly abundant in bodily fluids. Recent years have ...

UV-Vis Spectroscopic Characterization of Nanomaterials in Aqueous Media

The physicochemical characterization of nanomaterials (NMs) is often an analytical challenge, due to their small size (at least one dimension in the nanoscale, i.e. 1&#8211;100 nm), dynamic nature, and diverse properties. At the same time, reliable and repeatable characterization is paramount to ensure safety and quality in the manufacturing of NM-bearing products. There are several methods available to monitor and achieve reliable measurement of nanoscale-related properties, one example of which is Ultraviolet-Visible Spectroscopy (UV-Vis). This is a well-established, simple, and inexpensive technique that provides non-invasive and fast real-time screening evaluation of NM size, concentration, and aggregation state. Such features make UV-Vis an ideal methodology to assess the proficiency testing schemes (PTS) of a validated standard operating procedure (SOP) intended to evaluate the performance and reproducibility of a characterization method. In this paper, the PTS of six partner laboratories from the H2020 project ACEnano were assessed through an interlaboratory comparison (ILC). Standard gold (Au) colloid suspensions of different sizes (ranging 5&#8211;100 nm) were characterized by UV-Vis at the different institutions to develop an implementable and robust protocol for NM size characterization.

This study presents the benchmarking results for an interlaboratory comparison (ILC) designed to test the standard operating procedure (SOP) developed for gold (Au) colloid dispersions characterized by ultraviolet-visible Spectroscopy (UV-Vis), amongst six partners from the H2020 ACEnano project for sample preparation, measurement, and analysis of the results.

The physicochemical characterization of nanomaterials (NMs) is often an analytical challenge, due to their small size (at least one dimension in the ...

공학

Microfluidics를 통한 질량 측광 분석 농도 범위 확장

Analysis of Protein Complex Formation at Micromolar Concentrations by Coupling Microfluidics with Mass Photometry

Mass photometry is a versatile mass measurement technology that enables the study of biomolecular interactions and complex formation in solution without labels. Mass photometry is generally suited to analyzing samples in the 100 pM-100 nM concentration range. However, in many biological systems, it is necessary to measure more concentrated samples to study low-affinity or transient interactions. Here, we demonstrate a method that effectively expands the range of sample concentrations that can be analyzed by mass photometry from nanomolar to tens of micromolar. 
In this protocol, mass photometry is combined with a novel microfluidics system to investigate the formation of protein complexes in solution in the micromolar concentration range. With the microfluidics system, users can maintain a sample at a desired higher concentration followed by dilution to the nanomolar range - several milliseconds prior to the mass photometry measurement. Due to the speed of the dilution, data is obtained before the equilibrium of the sample has shifted (i.e., dissociation of the complex). 
The technique is applied to measure interactions between an immunoglobulin G (IgG) antibody and the neonatal Fc receptor, showing the formation of high-order complexes that were not quantifiable with static mass photometry measurements. 
In conclusion, the combination of mass photometry and microfluidics makes it possible to characterize samples in the micromolar concentration range and is proficient in measuring biomolecular interactions with weaker affinities. These capabilities can be applied in a range of contexts - including the development and design of biotherapeutics - enabling thorough characterization of diverse protein-protein interactions.

저자 스포트라이트: MassFluidix 기술을 사용한 용액에서 저친화성 단백질 상호 작용의 특성 분석

This protocol combines mass photometry with a novel microfluidics system to investigate low-affinity protein-protein interactions. This approach is based on the rapid dilution of highly concentrated complexes in solution, which enables low-affinity measurements and broadens the applicability of mass photometry.

Microfluidics와 질량 광도계를 결합하여 Micromolar 농도에서 단백질 복합체 형성 분석

Mass photometry is a versatile mass measurement technology that enables the study of biomolecular interactions and complex formation in solution without ...

생화학

NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional cuvette-based instruments for nucleic acid quantitation for those that can perform microvolume quantitation.
The NanoDrop microvolume sample retention system (Thermo Scientific NanoDrop Products) functions by combining fiber optic technology and natural surface tension properties to capture and retain minute amounts of sample independent of traditional containment apparatus such as cuvettes or capillaries. Furthermore, the system employs shorter path lengths, which result in a broad range of nucleic acid concentration measurements, essentially eliminating the need to perform dilutions. Reducing the volume of sample required for spectroscopic analysis also facilitates the inclusion of additional quality control steps throughout many molecular workflows, increasing efficiency and ultimately leading to greater confidence in downstream results.
The need for high-sensitivity fluorescent analysis of limited mass has also emerged with recent experimental advances. Using the same microvolume sample retention technology, fluorescent measurements may be performed with 2 &mu;L of material, allowing fluorescent assays volume requirements to be significantly reduced. Such microreactions of 10 &mu;L or less are now possible using a dedicated microvolume fluorospectrometer.
Two microvolume nucleic acid quantitation protocols will be demonstrated that use integrated sample retention systems as practical alternatives to traditional cuvette-based protocols. First, a direct A260 absorbance method using a microvolume spectrophotometer is described. This is followed by a demonstration of a fluorescence-based method that enables reduced-volume fluorescence reactions with a microvolume fluorospectrometer. These novel techniques enable the assessment of nucleic acid concentrations ranging from 1 pg/ &mu;L to 15,000 ng/ &mu;L with minimal consumption of sample.

The use of NanoDrop microvolume systems as practical and efficient alternatives to traditional nucleic acid quantitation methodology is described through the demonstration of two microvolume nucleic acid quantitation protocols.

핵산의 NanoDrop Microvolume의 Quantitation

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional ...

생물학

Concentration Determination of Nucleic Acids and Proteins Using the Micro-volume Bio-spec Nano Spectrophotometer

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades. More and more, molecular biologists require consistent small-volume analysis of nucleic acid samples for their experiments. The BioSpec-nano provides a potential solution to the problems of inaccurate, non-reproducible results, inherent in current DNA quantitation methods, via specialized optics and a sensitive PDA detector. The BioSpec-nano also has automated functionality such that mounting, measurement, and cleaning are done by the instrument, thereby eliminating tedious, repetitive, and inconsistent placement of the fiber optic element and manual cleaning.
In this study, data is presented on the quantification of DNA and protein, as well as on measurement reproducibility and accuracy. Automated sample contact and rapid scanning allows measurement in three seconds, resulting in excellent throughput. Data analysis is carried out using the built-in features of the software. The formula used for calculating DNA concentration is:
Sample Concentration = DF &middot; (OD260-OD320)&middot; NACF (1)
Where DF = sample dilution factor and NACF = nucleic acid concentration factor.
The Nucleic Acid concentration factor is set in accordance with the analyte selected1.
Protein concentration results can be expressed as &mu;g/ mL or as moles/L by entering e280 and molecular weight values respectively. When residue values for Tyr, Trp and Cysteine (S-S bond) are entered in the e280Calc tab, the extinction coefficient values are calculated as e280 = 5500 x (Trp residues) + 1490 x (Tyr residues) + 125 x (cysteine S-S bond). The e280 value is used by the software for concentration calculation.
In addition to concentration determination of nucleic acids and protein, the BioSpec-nano can be used as an ultra micro-volume spectrophotometer for many other analytes or as a standard spectrophotometer using 5 mm pathlength cells.

This communication presents data on the accuracy and reproducibility of the BioSpec-nano UV-VIS spectrophotometer for dsDNA and protein quantitation. Even with ultra-small volumes (1 to 2 L), reproducibility is excellent, while the automated wiping function improves throughput and results in minimal carryover for more precise results.

마이크로 볼륨 바이오 사양 나노 분광 광도계를 사용하여 핵산 및 단백질 농도 결정

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades.  More and more, molecular biologists require consistent ...

NanoDrop 2000c 분광을 사용 Microvolume 단백질 농도 결정

필기록

요약

더 많은 비디오 탐색

주소 지정이 가능한 물방울 Microarrays 단일 셀에서 단백질을 계산

Standards for Quantitative Metalloproteomic Analysis Using Size Exclusion ICP-MS

고분자 유전자 배달에 대한 평가는 Nanoparticle 추적 분석 및 높은 처리량 유동 세포 계측법에 의해 나노 입자

정량화 및 조정 가능한 저항 펄스 감지 기능을 사용하여 세포 외 소포의 크기 프로파일 링

UV-Vis Spectroscopic Characterization of Nanomaterials in Aqueous Media

Microfluidics와 질량 광도계를 결합하여 Micromolar 농도에서 단백질 복합체 형성 분석

Microfluidics와 질량 광도계를 결합하여 Micromolar 농도에서 단백질 복합체 형성 분석

Microfluidics와 질량 광도계를 결합하여 Micromolar 농도에서 단백질 복합체 형성 분석

핵산의 NanoDrop Microvolume의 Quantitation

마이크로 볼륨 바이오 사양 나노 분광 광도계를 사용하여 핵산 및 단백질 농도 결정