我々は、沿岸と外洋水の低酸素領域で進行中の研究を支援するためのイノベーション、ブリティッシュコロンビア州の知識開発基金と国立科学およびカナダの工学研究審議会（NSERC）のためのカナダの財団に感謝の意を表します。 JJWはNSERCとDAWからの奨学金によって支えられてNSERC、キラムと微生物多様性と進化のための資金を供給センタートゥーラ基礎から奨学金によって支えられている。 SLは、微生物の多様性と進化のためのトゥーラ基礎資金センターによってサポートされていました。

注：このプロトコルで使用されるすべての試薬 ​​は小さな作業にラボのストックから小分けされている株式-これはあなたのDNAサンプルとラボの株式の汚染のクロスコンタミネーションを避けるために非常に重要です。また、ピペッティング時に、クロスコンタミネーションを避けるために、すべての付加のためのピペットチップを変更してください。 パートOne：細胞の溶解および消化<ol><li>氷の上に以前に濃縮されたプランクトンのバイオマスが含まれているSterivexフィルタを融解することによって、このプロトコルを開始します。単純化のために、ここでは個々のフィルタ処理の手順を説明します。実際には、我々は一度に16以下のフィルタ処理をお勧めします。 </li><li>細胞を溶解し、RNAを削除する1つ、そしてタンパク質を分解するためにいずれかのフィルタが融解した後、二つのインキュベーションの最初を開始。第一インキュベーションのため、100μlのリゾチーム（1000μlのTEでの125 mg）を追加し、20mlのリボヌクレアーゼA（10μg/ ml）をフィルターへ。パラフィルムとフィルタを再シールし、37℃でハイブリダイゼーションオーブンで回転させる℃で1時間を残しておく。 </li><li>次のインキュベーションのために、フィルターに100μlのProteinase Kをし、100μlの20％SDSを加える。パラフィルムを使用して、55で、この時間をハイブリダイゼーションオーブンで1時間から2時間以上を回転させるためにそれを残す℃を再シール</li><li> 5cc注射器を使用して、15 mlのFalconチューブにSterivexフィルターからライセートを転送する。 1mlの溶解緩衝液でフィルターをすすぎ、5cc注射器を使用して、ファルコンチューブにライセートに液体リンス追加。今あなたが溶解し、あなたの細胞を消化していることを、あなたはそれらのDNAを抽出する準備が整いました。 </li></ol>パート2：DNA抽出<ol><li>次のステップは、ライセートからDNAを抽出し、フェノール - クロロホルム法を使用することです。クロスコンタミネーションを避けるために、各付加のためのピペットチップを変更することを確認し、溶解液チューブにイソアミルアルコール（IAA）：クロロホルム：等量のフェノール（3ミリリットル程度）を追加します。よく混ぜて10秒間ボルテックス。 </li><li>遠心機のバランスが取れたことを確認し、5分間の2500 gでチューブを回転させる。底部に、フェノール、クロロホルムを含む有機層、および、サンプルからのタンパク質、および水あなたのDNAで構成されて層、、水、およびその他：遠心操作中に、フェノール - クロロホルム - ライセート混合物は、二層に分離する必要があります上には親水性分子、。 </li><li>新しい15 mlのFalconチューブに水層を（あなたのDNAを含む）転送する。ピペットチップ（常に水層を少量残し）とのインタフェースを触れないように注意してください。 </li><li>クロスコンタミネーションを避けるために、各付加のためのピペットチップを変更することを確認し、IAA：この新しいチューブに、等量のクロロホルム（約3ML）を追加します。 10秒間ボルテックス。このステップでは、あなたのDNAサンプルから、残りのフェノールを除去するのに役立ちます。 </li><li>水層が透明になるまで5分間、または2,500 gでスピン。新しい、というラベルのファルコンチューブに水層を移し、ピペットチップ（常に背後にある水層の少量を残す）とのインタフェースを触れないように注意して、pH8.0でTEを1 mlを加える。この水層では、あなたのDNA抽出液が含まれています。 </li></ol>パート3：DNAの濃度と洗浄<ol><li>次のステップは、15ミリリットルアミコンウルトラ遠心管にDNAサンプルを洗浄し、集中することです。アミコンチューブは、フロースルーを（ろ液）をキャッチするために、指定された分子量（残留物）とチューブ以上に分子を保持するフィルタで構成されています。この場合、フィルタは、あなたのDNA（濃縮水）を保持します。ステップ2.5からアミコンウルトラチューブのフィルタコンパートメントにあなたのDNA抽出液を移す。 </li><li> 10分3500 gでスピン。アミコンフィルターに保持された液体の量の1 mlのあることを確認してください。より多くのリテンテート遺跡、TEと補充フィルターであれば、再度スピン。クロスコンタミネーションを避けるために、すべてのTEを加え、新鮮なピペットチップを使用するようにしてください。 </li><li>別のファルコンチューブに、フロースルー、または濾液を削除し、ゲル上で最終的なDNA産物を確認するまで（第四部）冷蔵庫に保存してください。 </li><li>アミコンフィルターに2ミリリットルのTEバッファを追加し、クロスコンタミネーションを避けるために、各TEの添加のために新鮮なピペットチップを使用することを確認しながら、6分間3500 × gでスピン。ステップ3.3からそれと冷蔵庫で保存すると、プールろ過。 </li><li> 3回の洗浄（新鮮なピペットの先端を常に使用することを確認すること）の合計2回TEとDNA、及びろ液をそれぞれの時間を節約する（ステップ3.3および3.4​​に従って）洗ってください。最後の洗浄のために、スピンアミコンフィルターの保持物遺跡の200〜500ミリリットルになるまで。最終容量を記録し、標識1.5mlのエッペンドルフチュー​​ブに（あなたのDNAを含む）保持液を移す。 </li></ol>第四部：DNAの品質の決定<ol><li> DNAの品質をチェックし、ゲル0.8％アガロースゲルSTA上でサンプルを実行することにより、DNAの濃度を推定一晩1ミリリットルエチジウムブロマイド（反応ステップ）でined。反応ステップ（EtBr -それが既知の変異原物質と疑われる発がん性物質であるを使用する場合は十分に注意してください。頻繁に手袋を変更し、ラボの他の部分へとお肌に流します転送を避けるために確認してください。）として機能するDNAラダー、隣にサンプルをロードサイズと強度の基準（次のステップを参照）。 </li><li>最初のいくつかのレーンでは、様々な分子量と濃度のバンドではしごを読み込みます。最初と最後のレーンの（最も外側の車線）、1キロバイトの50ng/μlの負荷を10μl+または2logラダー：我々は以下の装荷パターンをお勧めします。 50ng/μlλHindIIIのはしごのそれぞれレーン2,3と4、負荷を2​​μl、5μlの、そして10μlの、、に。最後に、各サンプルの色素とDNAの抽出量が1レーンあたり5μlを読み込みます。 </li><li>約16時間15ボルト（私たちは一晩実行することをお勧めします）でゲルを実行します。 </li><li>翌日、UVゲルドキュメンテーションシステムを使ってゲルを撮影する。あなたのDNAと、その濃度の分子量範囲を決定するために、はしごのバンドにサンプルのバンドを比較する。良質のDNAは高分子量の（&gt; 36KB）持っている、とせん断/劣化の証拠はほとんどが表示されます。図1を参照してください。 </li></ol>第5部：塩化セシウム密度勾配遠心<ol><li> DNAの品質が良好な場合と量が十分であれば、塩化セシウム（CsCl密度）勾配遠心分離を行うことによりDNAを精製に進むことができます。この精製ステップはオプションであり、すべてのダウンストリームアプリケーション（たとえば、フォスミドライブラリーを生成する場合には浄化するべきである 、あなたが単にPCR反応を実行する場合、一方、精製は、通常は必要ではない）のために必要ではないことに注意してください。最初に、ラベル、サンプルごとに1つの遠心管。 </li><li>各遠心管に、塩化セシウム、ゲノムDNAの178μlを160 mgを追加。チューブにCsCl及びDNAを添加した後、チューブの上にパラフィルムの小片を配置し、静かに成分を混合するためにチューブを10倍から20倍を反転。 DNAの切断を引き起こす可能性のあるピペッティングで混ぜて使用しないでください。次に、このチューブを10μg/μLの反応ステップの10μlを追加し、同じ方法でそれを混ぜる。 （使用する場合は十分に注意してください流します - それは既知の変異原性物質と疑われる発がん性物質である。しばしば手袋を変更し、ラボの他の部分へとお肌に流します転送を避けるために確認してください。） </li><li>すべてのチューブの重量はチューブ間の体重差が1ミリグラム未満であることなどの遠心分離の前にバランスされていることを確認します。 </li><li>ローターを使用して止血剤のチューブを入れ、蓋を閉じて、超遠心機の内部にローターを配置。 </li><li>超遠心機のドアを閉じます。真空は、すぐにドアを閉めるように適用されます。 18時間、100,000 rpmで、20℃で一晩実行</li><li>遠心分離が完了すると、チューブのラックに止血剤と場所を使用してローターからチューブを取り出してください。 </li><li>青色光トランスでDNAを可視化する、または利用できない場合、暗い部屋で、長波長のUV光を使用してください。 DNAバンドを確認するためにアンバーフィルターのメガネを着用してください。図2を参照してください。 </li><li>滅菌1cc注射器と針を（26G 5 / 8）を使用して、DNAのバンドを削除し、1.5ミリリットルエッペンドルフチュー​​ブに入れてください。 </li><li>シリンジ内のデッドスペースに閉じ込められたDNAのほとんどを回復するために、100μlのTEでシリンジを洗浄し、チューブにすすぎ​​液を加える。交差汚染を防ぐために、サンプルあたり100μlのTEバッファーでつのチューブを準備します。 </li><li> 、DNAからEtBrを除去チューブに水飽和ブタノールの等量を追加するには、チューブを反転軽く10倍から20倍、1分間10000 rpmで遠心分離し、上部層を捨てる。 </li><li>ブタノールの色が透明になるまで3は、洗濯を繰り返す - 4回以上。 </li><li>場所4ミリリットルアミコンウルトラ遠心管のTEとは、上記のDNA溶液を加える。 </li><li> DNA量は約100〜500μL（約6〜7分）に減少するまで、室温で3500グラムで遠心し、フロースルーを捨てる。 </li><li>アミコンフィルターに2ミリリットルTEを追加し、クロスコンタミネーションを避けるために、それぞれの添加のために新鮮なピペットチップを使用することを確認しながら、6分間3500 gで遠心。二回繰り返します。 </li><li>必要に応じて追加の遠心分離により50〜100μlの最終容量に濃縮し、新しい1.5 mlエッペンドルフチュー​​ブにフィルター上のDNA溶液を移す。 </li><li>アミコンフィルターに40μlのTEを追加し、残りのDNAを洗浄するために、両方のフィルター膜に沿って上下にピペッティング。 5.15チューブにこの溶液を加える。 </li><li> 200μlのオートクレーブに水を加えると7分には、10000 rpmで遠心分離することによってマイクロコンチューブと予備洗浄マイクロコンにマイクロコンYM - 30フィルターユニットを置きます。 </li><li>さらにDNAを濃縮するためには5.16からプレウォッシュ加工を施したマイクロコンにDNA溶液を追加。 3分 - 1 5000〜10000グラムで遠心。液体の量を確認してくださいフィルタと繰り返し遠心分離でフィルター上に液体の量は、約50μlに減少されるまで。 </li><li>新しいマイクロコンチューブに逆さまにフィルターユニットを置き、3分間1000gで遠心。濃縮液の理想的な量は50〜60μlです。 </li><li>尺度と光度計でDNAの濃度を記録し（260nmのはず）のピーク品質を確認してください。 </li><li>マイナス20℃株式や凍結を操作するためのクリーンなエッペンチューブにDNAの小アリコートを移す。マイナス80の第二クリーンエッペンドルフとフリーズするDNAの残りを転送します。 </li></ol>代表的な結果： このプロトコルが正しく行われているときは、図1のようなDNAの品質の決定のステップ4.4の後にゲルの画像が表示されるはずです。抽出物の実際のDNA濃度は、サンプルのソースによって異なります。 CsCl密度勾配遠心分離のステップ5.7の後に、青色光で照らされたゲノムDNAは図2のような外観になります。 <img src="/files/ftp_upload/1352/1352Fig1newer.png" alt="図1" /> 図1。挿入剤エチジウムブロマイド（10 mg / mlの）で染色した亜寒帯太平洋（重複の）、の4つの深さから採取した高分子量のDNAの0.8％アガロースゲル電気泳動像。ゲルは1 × TBEゲル泳動緩衝で〜16時間のために15Vで実行しました。 10メートルの抽出物は、いくつかのRNAは、（0.5〜2.0 KBの範囲内のスミアを参照）持ち越す保持がサンプルのバンドは（複数のバンドとは対照的に、単一のバンドやしみを示しています）機械的剪断の少し証拠を示す良質のものである。 <img src="/files/ftp_upload/1352/1352Fig2.jpg" alt="図2" /> 図2のCsCl勾配遠心分離の後に青色の光に照らされたゲノムDNAのバンド。

<ol>
	<li>Beja, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=To+BAC+or+not+to+BAC:+marine+ecogenomics.">To BAC or not to BAC: marine ecogenomics.</a> Curr Opin Biotechnol. 15 (3), 187-190 (2004).</li><li>Beja, O., Suzuki, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+and+analysis+of+bacterial+artificial+chromosome+libraries+from+a+marine+microbial+assemblage.">Construction and analysis of bacterial artificial chromosome libraries from a marine microbial assemblage.</a> Environ Microbiol. 2 (5), 516-529 (2000).</li><li>DeLong, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Community+genomics+among+stratified+microbial+assemblages+in+the+oceans+interior.">Community genomics among stratified microbial assemblages in the oceans interior.</a> Science. 311, 496-503 (2006).</li><li>Stein, J. L., Marsh, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+uncultivated+prokaryotes:+isolation+and+analysis+of+a+40-kilobase-pair+genome+fragment+from+a+planktonic+marine+archaeon.">Characterization of uncultivated prokaryotes: isolation and analysis of a 40-kilobase-pair genome fragment from a planktonic marine archaeon.</a> J Bacteriol. 178 (3), 591-599 (1996).</li><li>Somerville, C. C., Knight, I. T., Straube, W. L., Colwell, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple,+rapid+method+for+the+direct+isolation+of+nucleic+acids+from+aquatic+environments.">A simple, rapid method for the direct isolation of nucleic acids from aquatic environments.</a> Appl. Environ. Microbiol. 55 (3), 548-554 (1989).</li></ol>

処理される方法を多くのサンプルであることに応じて、これは2つの1時間のインキュベーションのステップ、と繰り返し洗浄し、遠心分離のステップのために時間を集中的にプロシージャを指定できます。に多くの時間を残すためにこのプロシージャの2つの全体の日を計画するのが最善です。 DNA濃度と洗浄の間に200 -500μLまで減らすためにアミコンチューブの最後の抽出量を得るに問題がある場合は適切な量が残っているようになるまで、（第三部を繰り返す）追加のTEの洗浄と遠心分離を行ってみてください。抽出物は急性クロロホルムの匂いがすればそれは臭いがクロロホルムのすべてが削除されていることを確認するために軽減されるまで、追加の洗浄を行うのが最も良いです。再び、このプロトコルで使用されるすべての試薬は小さな作業にラボのストックから分注している株式 - これはあなたのDNAサンプルとラボの株式の汚染のクロスコンタミネーションを避けるために非常に重要です。また、ピペッティング時に、クロスコンタミネーションを避けるために、すべての付加のためのピペットチップを変更してください。

A correction was made to "<a href="/video/1352">DNA Extraction from 0.22 &#181;M Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation</a>". A typo in a volume's measurement was corrected in step 1.2.
The step was corrected from:
Once the filter has thawed, begin the first of two incubations: one to lyse the cells and remove RNA, and one to break down proteins. For the first incubation, add 100 &#956;l lysozyme (125 mg in 1000 &#956;l TE) and 20 ml RNase A (10 &#956;g/ml) to the filter. Reseal the filter with Parafilm and leave it to rotate in the hybridization oven at 37&#176;C for 1 hour.
to:
Once the filter has thawed, begin the first of two incubations: one to lyse the cells and remove RNA, and one to break down proteins. For the first incubation, add 100 &#956;l lysozyme (125 mg in 1000 &#956;l TE) and 20 &#956;l RNase A (10 &#956;g/ml) to the filter. Reseal the filter with Parafilm and leave it to rotate in the hybridization oven at 37&#176;C for 1 hour.

A correction was made to <a href="/video/1352">DNA Extraction from 0.22 &#181;M Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation</a>. A typo in a volume's measurement was corrected in step 1.2.

Erratum: DNA Extraction from 0.22 &#181;M Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>1 cc syringe (26G5/8 needle)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD</td>
<td>309597</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1 ml syringe (26G5/8 needle)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD</td>
<td>309597</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1.5ml eppendorf tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>0030 125.150</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>15ml tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>CLS430791</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>5cc syringe</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD</td>
<td>309603</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Amicon&reg; Ultra-4 Centrifugal Filter Devices</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>UFC801096</td>
<td>10,000 Nominal molecular weight limit</td>
</tr>
<tr>
<td>Butanol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>A383-1</td>
<td>Make it water saturated (butanol:water = 1:1)</td>
</tr>
<tr>
<td>Centrifuge rotor, JA5.3 </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>368690</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Centrifuge, Avanti&reg; J-E</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>369003</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cesium chloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>C4036</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Chloroform:IAA (24:1)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>25666-500ML</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ethidium Bromide (EtBr)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>E1510-10ml</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>E5134</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hybridization oven</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>13-247-10</td>
<td>37&deg;C & 55&deg;C</td>
</tr>
<tr>
<td>Lysis Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>0.75 M sucrose, 40 mM EDTA, 50 mM Tris (pH 8.3)</td>
</tr>
<tr>
<td>Lysozyme</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>L6876-5G</td>
<td>125 mg in 1000 &mu;l TE</td>
</tr>
<tr>
<td>Microcon&reg; Ultracel YM-30 Centrifugal Filter Unit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>42410</td>
<td>50 bp cut off</td>
</tr>
<tr>
<td>Parafilm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>13-374-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phenol:Chloroform:IAA (25:24:1)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>77617-500ML</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Proteinase K</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>19133</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RNase A</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>BP2539-100</td>
<td>10 &mu;g/ml</td>
</tr>
<tr>
<td>Safe Imager&trade; Blue light transilluminator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>S37102</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>L4509</td>
<td>20% SDS</td>
</tr>
<tr>
<td>Sterivex filters</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>SVG010RS</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sucrose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>S0389</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Table top centrifuge</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>5415D</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TE buffer, pH 8.0</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trizma&reg; base</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>T1503</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ultracentrifuge rotor, TLA 100</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>343847</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ultracentrifuge tube (7X20mm, PC)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman</td>
<td>343775</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ultracentrifuge tube rack</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman</td>
<td>348302</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ultracentrifuge, Optima&reg; Max</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

dna extraction from 0.22 &mu;m sterivex filters and cesium chloride density gradient centrifugation

このメソッドは、ストレージ/溶解緩衝液で処理し、-80℃でアーカイブされている0.22μmのSterivexフィルターに集中してプランクトンのバイオマスからの高分子量のゲノムDNAを抽出し、塩化セシウムの密度勾配を用いてこのDNAを精製するために使用されます。プロトコルは、細胞からDNAを解放し、RNAを除去する2つの1時間のインキュベーションステップから始まります。次に、フェノールのシリーズ：クロロホルム及びクロロホルム抽出は、抽出液を洗浄し、集中するタンパク質や細胞膜の成分、水溶性のDNA抽出物の収集、およびいくつかのバッファの交換の手順を除去するために遠心分離に続いて実行されます。パート5は、塩化セシウムの密度勾配を経由して任意の精製について説明します。それは混乱を避けるために、プロトコルのダウンタイムを削減するために一度に15未満のサンプルで動作することをお勧めします。このプロトコルに必要な総時間は、抽出するサンプル数に依存します。 10月15日のサンプルと、適切な遠心分離装置が使用可能であると仮定するため、このプロトコル全体では3日かかります。あなたがプロセスの開始時に温度に設定されてハイブリダイゼーションオーブンを持っていることを確認します。

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DNA Extraction from 0.22 &mu;M Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation

我々は、精製のための塩化セシウム密度勾配遠心分離に続いて0.22μmのSterivexフィルタ、集中プランクトンのバイオマスからの高分子量のゲノムDNAの抽出のための方法を説明します。

0.22μmのSterivexフィルタおよび塩化セシウム密度勾配遠心分離からのDNA抽出

This method is used to extract high molecular weight genomic DNA from planktonic biomass concentrated on 0.22 &mu;M Sterivex filters that have been ...

dna-extraction-from-022-m-sterivex-filters-cesium-chloride-density

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

29.0K ビュー.  University of British Columbia - UBC. 我々は、精製のための塩化セシウム密度勾配遠心分離に続いて0.22μmのSterivexフィルタ、集中プランクトンのバイオマスからの高分子量のゲノムDNAの抽出のための方法を説明します。

ビデオ: DNA Extraction from 0.22 μM Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation

Extraction of High Molecular Weight Genomic DNA from Soils and Sediments

The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with nutrient and energy flow within terrestrial ecosystems. Cultivation-independent environmental genomic, also known as metagenomic, approaches promise unprecedented access to this genetic information with respect to pathway reconstruction and functional screening for high value therapeutic and biomass conversion processes. However, the soil microbiome still remains a challenge largely due to the difficulty in obtaining high molecular weight DNA of sufficient quality for large insert library production. Here we introduce a protocol for extracting high molecular weight, microbial community genomic DNA from soils and sediments. The quality of isolated genomic DNA is ideal for constructing large insert environmental genomic libraries for downstream sequencing and screening applications. 
The procedure starts with cell lysis. Cell walls and membranes of microbes are lysed by both mechanical (grinding) and chemical forces (&beta;-mercaptoethanol). Genomic DNA is then isolated using extraction buffer, chloroform-isoamyl alcohol and isopropyl alcohol. The buffers employed for the lysis and extraction steps include guanidine isothiocyanate and hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB) to preserve the integrity of the high molecular weight genomic DNA. Depending on your downstream application, the isolated genomic DNA can be further purified using cesium chloride (CsCl) gradient ultracentrifugation, which reduces impurities including humic acids. The first procedure, extraction, takes approximately 8 hours, excluding DNA quantification step. The CsCl gradient ultracentrifugation, is a two days process. During the entire procedure, genomic DNA should be treated gently to prevent shearing, avoid severe vortexing, and repetitive harsh pipetting.

A methodology to isolate high molecular weight and high quality genomic DNA from soil microbial community is described.

土壌と堆積物から高分子量のゲノムDNAの抽出

The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with ...

生物学

DNA Extraction from Paraffin Embedded Material for Genetic and Epigenetic Analyses

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number gains and losses and DNA methylation. Advances in high-throughput, genome-wide profiling technologies, such as microarrays, have significantly improved our ability to identify and detect these specific alterations. However as technology continues to improve, a limiting factor remains sample quality and availability. Furthermore, follow-up clinical information and disease outcome are often collected years after the initial specimen collection. Specimens, typically formalin-fixed and paraffin embedded (FFPE), are stored in hospital archives for years to decades. DNA can be efficiently and effectively recovered from paraffin-embedded specimens if the appropriate method of extraction is applied. High quality DNA extracted from properly preserved and stored specimens can support quantitative assays for comparisons of normal and diseased tissues and generation of genetic and epigenetic signatures 1. To extract DNA from paraffin-embedded samples, tissue cores or microdissected tissue are subjected to xylene treatment, which dissolves the paraffin from the tissue, and then rehydrated using a series of ethanol washes. Proteins and harmful enzymes such as nucleases are subsequently digested by proteinase K. The addition of lysis buffer, which contains denaturing agents such as sodium dodecyl sulfate (SDS), facilitates digestion 2. Nucleic acids are purified from the tissue lysate using buffer-saturated phenol and high speed centrifugation which generates a biphasic solution. DNA and RNA remain in the upper aqueous phase, while proteins, lipids and polysaccharides are sequestered in the inter- and organic-phases respectively. Retention of the aqueous phase and repeated phenol extractions generates a clean sample. Following phenol extractions, RNase A is added to eliminate contaminating RNA. Additional phenol extractions following incubation with RNase A are used to remove any remaining enzyme. The addition of sodium acetate and isopropanol precipitates DNA, and high speed centrifugation is used to pellet the DNA and facilitate isopropanol removal. Excess salts carried over from precipitation can interfere with subsequent enzymatic assays, but can be removed from the DNA by washing with 70% ethanol, followed by centrifugation to re-pellet the DNA 3. DNA is re-suspended in distilled water or the buffer of choice, quantified and stored at -20&deg;C. Purified DNA can subsequently be used in downstream applications which include, but are not limited to, PCR, array comparative genomic hybridization 4 (array CGH), methylated DNA Immunoprecipitation (MeDIP) and sequencing, allowing for an integrative analysis of tissue/tumor samples.

This video demonstrates the protocol for DNA extraction from formalin-fixed paraffin-embedded material. This is a multi-day procedure in which tissue sections are deparaffinized with xylene, rehydrated with ethanol and treated with proteinase K to purify and isolate DNA for subsequent gene-specific or genome-wide analysis.

遺伝学的およびエピジェネティクス解析のためのパラフィン包埋材料からのDNA抽出

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number ...

Extraction of High Molecular Weight DNA from Microbial Mats

Successful and accurate analysis and interpretation of metagenomic data is dependent upon the efficient extraction of high-quality, high molecular weight (HMW) community DNA. However, environmental mat samples often pose difficulties to obtaining large concentrations of high-quality, HMW DNA. Hypersaline microbial mats contain high amounts of extracellular polymeric substances (EPS)1 and salts that may inhibit downstream applications of extracted DNA. Direct and harsh methods are often used in DNA extraction from refractory samples. These methods are typically used because the EPS in mats, an adhesive matrix, binds DNA2,3 during direct lysis. As a result of harsher extraction methods, DNA becomes fragmented into small sizes4,5,6.
The DNA thus becomes inappropriate for large-insert vector cloning. In order to circumvent these limitations, we report an improved methodology to extract HMW DNA of good quality and quantity from hypersaline microbial mats. We employed an indirect method involving the separation of microbial cells from the background mat matrix through blending and differential centrifugation. A combination of mechanical and chemical procedures was used to extract and purify DNA from the extracted microbial cells. Our protocol yields approximately 2 &mu;g of HMW DNA (35-50 kb) per gram of mat sample, with an A260/280 ratio of 1.6. Furthermore, amplification of 16S rRNA genes7 suggests that the protocol is able to minimize or eliminate any inhibitory effects of contaminants. Our results provide an appropriate methodology for the extraction of HMW DNA from microbial mats for functional metagenomic studies and may be applicable to other environmental samples from which DNA extraction is challenging.

We provide an improved protocol for extracting high molecular weight DNA from hypersaline microbial mats. Microbial cells are separated from the mat matrix prior to DNA extraction and purification. This enhances the concentrations, quality, and size of the DNA. The protocol may be used for other refractory samples.

バイオマットから高分子量DNAの抽出

Successful and accurate analysis and interpretation of metagenomic data is dependent upon the efficient extraction  of high-quality, high molecular weight ...

Extraction and Analysis of Cortisol from Human and Monkey Hair

The stress hormone cortisol (CORT) is slowly incorporated into the growing hair shaft of humans, nonhuman primates, and other mammals. We developed and validated a method for CORT extraction and analysis from rhesus monkey hair and subsequently adapted this method for use with human scalp hair. In contrast to CORT &#34;point samples&#34; obtained from plasma or saliva, hair CORT provides an integrated measure of hypothalamic-pituitary-adrenocortical (HPA) system activity, and thus physiological stress, during the period of hormone incorporation. Because human scalp hair grows at an average rate of 1 cm/month, CORT levels obtained from hair segments several cm in length can potentially serve as a biomarker of stress experienced over a number of months.
In our method, each hair sample is first washed twice in isopropanol to remove any CORT from the outside of the hair shaft that has been deposited from sweat or sebum. After drying, the sample is ground to a fine powder to break up the hair&#39;s protein matrix and increase the surface area for extraction. CORT from the interior of the hair shaft is extracted into methanol, the methanol is evaporated, and the extract is reconstituted in assay buffer. Extracted CORT, along with standards and quality controls, is then analyzed by means of a sensitive and specific commercially available enzyme immunoassay (EIA) kit. Readout from the EIA is converted to pg CORT per mg powdered hair weight. This method has been used in our laboratory to analyze hair CORT in humans, several species of macaque monkeys, marmosets, dogs, and polar bears. Many studies both from our lab and from other research groups have demonstrated the broad applicability of hair CORT for assessing chronic stress exposure in natural as well as laboratory settings.

Cortisol (CORT) accumulates in the growing hair shaft of humans and nonhuman primates. We describe methods for extracting and analyzing hair CORT with high precision and sensitivity. Measurement of hair CORT is particularly well-suited for assessing chronic stress over periods of weeks to months.

ヒトおよびサル毛髪から抽出およびコルチゾールの分析

The stress hormone cortisol (CORT) is slowly incorporated into the growing hair shaft of humans, nonhuman primates, and other mammals. We developed and ...

The Infiltration-centrifugation Technique for Extraction of Apoplastic Fluid from Plant Leaves Using Phaseolus vulgaris as an Example

The apoplast is a distinct extracellular compartment in plant tissues that lies outside the plasma membrane and includes the cell wall. The apoplastic compartment of plant leaves is the site of several important biological processes, including cell wall formation, cellular nutrient and water uptake and export, plant-endophyte interactions and defence responses to pathogens. The infiltration-centrifugation method is well established as a robust technique for the analysis of the soluble apoplast composition of various plant species. The fluid obtained by this method is commonly known as apoplast washing fluid (AWF). The following protocol describes an optimized vacuum infiltration and centrifugation method for AWF extraction from Phaseolus vulgaris (French bean) cv. Tendergreen leaves. The limitations of this method and the optimization of the protocol for other plant species are discussed. Recovered AWF can be used in a wide range of downstream experiments that seek to characterize the composition of the apoplast and how it varies in response to plant species and genotype, plant development and environmental conditions, or to determine how microorganisms grow in apoplast fluid and respond to changes in its composition.

The Infiltration-centrifugation Technique for Extraction of Apoplastic Fluid from Plant Leaves Using Phaseolus vulgaris as an Example

This protocol details the optimized extraction of apoplast washing fluid from plant leaves, using French bean plants (Phaseolus vulgaris) as a model example.

植物の葉からのアポプラスト液の抽出のための浸透·遠心分離技術の使用<em&gt;インゲンマメ</em&gt;例として

The apoplast is a distinct extracellular compartment in plant tissues that lies outside the plasma membrane and includes the cell wall. The apoplastic ...

A Hybrid DNA Extraction Method for the Qualitative and Quantitative Assessment of Bacterial Communities from Poultry Production Samples

The efficacy of DNA extraction protocols can be highly dependent upon both the type of sample being investigated and the types of downstream analyses performed. Considering that the use of new bacterial community analysis techniques (e.g., microbiomics, metagenomics) is becoming more prevalent in the agricultural and environmental sciences and many environmental samples within these disciplines can be physiochemically and microbiologically unique (e.g., fecal and litter/bedding samples from the poultry production spectrum), appropriate and effective DNA extraction methods need to be carefully chosen. Therefore, a novel semi-automated hybrid DNA extraction method was developed specifically for use with environmental poultry production samples. This method is a combination of the two major types of DNA extraction: mechanical and enzymatic. A two-step intense mechanical homogenization step (using bead-beating specifically formulated for environmental samples) was added to the beginning of the &#8220;gold standard&#8221; enzymatic DNA extraction method for fecal samples to enhance the removal of bacteria and DNA from the sample matrix and improve the recovery of Gram-positive bacterial community members. Once the enzymatic extraction portion of the hybrid method was initiated, the remaining purification process was automated using a robotic workstation to increase sample throughput and decrease sample processing error. In comparison to the strict mechanical and enzymatic DNA extraction methods, this novel hybrid method provided the best overall combined performance when considering quantitative (using 16S rRNA qPCR) and qualitative (using microbiomics) estimates of the total bacterial communities when processing poultry feces and litter samples.

A novel semi-automated hybrid DNA extraction method for use with environmental poultry production samples was developed and demonstrated improvements over a common mechanical and enzymatic extraction method in terms of the quantitative and qualitative estimates of the total bacterial communities.

家禽生産のサンプルからの細菌群集の定性的および定量的評価のためのハイブリッドDNA抽出法

The efficacy of DNA extraction protocols can be highly dependent upon both the type of sample being investigated and the types of downstream analyses ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of diverse libraries of retroviral integration sites using ligation-mediated PCR (LM-PCR) amplification and next-generation sequencing (NGS), (2) mapping the genomic location of each virus-host junction using BEDTools, and (3) analyzing the data for statistical relevance. Genomic DNA extracted from infected cells is fragmented by digestion with restriction enzymes or by sonication. After suitable DNA end-repair, double-stranded linkers are ligated onto the DNA ends, and semi-nested PCR is conducted using primers complementary to both the long terminal repeat (LTR) end of the virus and the ligated linker DNA. The PCR primers carry sequences required for DNA clustering during NGS, negating the requirement for separate adapter ligation. Quality control (QC) is conducted to assess DNA fragment size distribution and adapter DNA incorporation prior to NGS. Sequence output files are filtered for LTR-containing reads, and the sequences defining the LTR and the linker are cropped away. Trimmed host cell sequences are mapped to a reference genome using BLAT and are filtered for minimally 97% identity to a unique point in the reference genome. Unique integration sites are scrutinized for adjacent nucleotide (nt) sequence and distribution relative to various genomic features. Using this protocol, integration site libraries of high complexity can be constructed from genomic DNA in three days. The entire protocol that encompasses exogenous viral infection of susceptible tissue culture cells to integration site analysis can therefore be conducted in approximately one to two weeks. Recent applications of this technology pertain to longitudinal analysis of integration sites from HIV-infected patients.

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

レトロウイルス統合サイトの増幅、次世代シーケンシング、およびゲノムDNAのマッピング

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad to extract cellular DNA from whole blood in less than 2 min. The blood specimen is treated with detergent, mixed briefly and applied by pipet to the separation membrane. The lysate wicks into the blotting pad due to capillary action, capturing the genomic DNA on the surface of the separation membrane. The extracted DNA is retained on the membrane during a simple wash step wherein PCR inhibitors are wicked into the absorbent blotting pad. The membrane containing the entrapped DNA is then added to the PCR reaction without further purification. This simple method does not require laboratory equipment and can be easily implemented with inexpensive laboratory supplies. Here we describe a protocol for highly sensitive detection and quantitation of HIV-1 proviral DNA from 100 &#181;l whole blood as a model for early infant diagnosis of HIV that could readily be adapted to other genetic targets.

We describe here a simple and rapid paper-based DNA extraction method of HIV proviral DNA from whole blood detected by quantitative PCR. This protocol can be extended for use in detecting other genetic markers or using alternative amplification methods.

核酸の濾過単離：簡易迅速DNA抽出方法

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

Preparation of Formalin-fixed Paraffin-embedded Tissue Cores for both RNA and DNA Extraction

Formalin-fixed paraffin embedded tissue (FFPET) represents a valuable, well-annotated substrate for molecular investigations. The utility of FFPET in molecular analysis is complicated both by heterogeneous tissue composition and low yields when extracting nucleic acids. A literature search revealed a paucity of protocols addressing these issues, and none that showed a validated method for simultaneous extraction of RNA and DNA from regions of interest in FFPET. This method addresses both issues. Tissue specificity was achieved by mapping cancer areas of interest on microscope slides and transferring annotations onto FFPET blocks. Tissue cores were harvested from areas of interest using 0.6 mm microarray punches. Nucleic acid extraction was performed using a commercial FFPET extraction system, with modifications to homogenization, deparaffinization, and Proteinase K digestion steps to improve tissue digestion and increase nucleic acid yields. The modified protocol yields sufficient quantity and quality of nucleic acids for use in a number of downstream analyses, including a multi-analyte gene expression platform, as well as reverse transcriptase coupled real time PCR analysis of mRNA expression, and methylation-specific PCR (MSP) analysis of DNA methylation.

This modified extraction protocol improves RNA and DNA yields from more precisely targeted regions of interest in histopathologic tissue blocks.

RNA及びDNA抽出の両方のためのホルマリン固定パラフィン包埋組織コアの調製

Formalin-fixed paraffin embedded tissue (FFPET) represents a valuable, well-annotated substrate for molecular investigations. The utility of FFPET in ...

Sperm Collection of Differential Quality Using Density Gradient Centrifugation

In sexual reproduction, a male gamete or sperm cell fuses with a female gamete to bring about fertilization. However, a large number of sperm cells with fertilizing ability are required to interact with a female gamete to ensure fertilization. As such, the fertilizing ability of individual sperm cells is critical for successful reproduction. Density gradient centrifugation has been utilized for several decades as a reproducible, fast, efficient, effective and extremely adaptable method to collect only high-quality sperm to be used in assisted reproductive technology. The protocols we described herein focus on the utilization of the discontinuous Percoll density gradient centrifugation (PDGC) technique to isolate three distinct populations of rooster sperm by their quality. We were able to collect low-, medium- and high-quality sperm. We also describe reproducible protocols that entail determining fertility potential of sperm by assessing their viability, mobility and penetrability. Collection of sperm by their quality using PDGC technique would be useful to accurately and thoroughly characterize sperm with differential fertility potential.

In this paper, we aim to describe the performance of the density gradient centrifugation technique and its application in sperm physiology research.

密度勾配遠心法を用いた差動品質の精液採取

In sexual reproduction, a male gamete or sperm cell fuses with a female gamete to bring about fertilization. However, a large number of sperm cells with ...