Vorremmo ringraziare la Fondazione canadese per l&#39;innovazione, la British Columbia Fondo di conoscenza per lo sviluppo e la Nazionale di Scienze e Ingegneria Research Council (NSERC) del Canada per sostenere gli studi in corso sulle regioni di scarsità di ossigeno delle acque costiere oceaniche e aperto. JJW è stata sostenuta da borse di studio da NSERC e DAW è stata sostenuta da borse di studio da NSERC, Killam e la fondazione TULA Centro finanziato per la diversità microbica e Evolution. SL è stato sostenuto dal Centro TULA fondazione finanziata per la diversità microbica e Evolution.

Nota: Tutti i reagenti usati in questo protocollo sono aliquotati dalle scorte di laboratorio in piccoli stock di lavoro-questo è molto importante per evitare la contaminazione crociata dei campioni di DNA e la contaminazione delle scorte di laboratorio. Inoltre, quando pipettaggio, assicurarsi di modificare puntali per ogni aggiunta per evitare contaminazioni incrociate. Parte prima: la lisi cellulare e digestione <ol><li> Iniziare questo protocollo da scongelamento i filtri Sterivex che contengono biomassa planctonica precedentemente concentrato sul ghiaccio. Per semplicità, qui descritta la procedura per l&#39;elaborazione di un singolo filtro. In pratica, si consiglia di elaborazione 16 o meno dei filtri alla volta. </li><li> Una volta che il filtro ha scongelato, iniziare il primo dei due incubazioni: uno per lisare le cellule e rimuovere l&#39;RNA, e quello di rompere le proteine. Per la prima incubazione, aggiungere 100 microlitri lisozima (125 mg in 1000 ml TE) e 20 ml di RNasi A (10 mcg / ml) per il filtro. Richiudere il filtro con Parafilm e lasciare a ruotare nel forno di ibridazione a 37 ° C per 1 ora. </li><li> Per l&#39;incubazione prossimo, aggiungere 100 microlitri proteinasi K e 100 ul SDS 20% al filtro. Richiudere con Parafilm e lasciare a ruotare 1-2 ore in più nel forno di ibridazione, questa volta a 55 ° C. </li><li> Utilizzando una siringa 5cc, trasferire il lisato dal filtro Sterivex in una provetta da 15 ml Falcon. Sciacquare il filtro con 1 ml di tampone di lisi e aggiungere il liquido di risciacquo al lisato nel tubo Falcon con la siringa 5cc. Ora che avete lisati e digerito le vostre cellule, si è pronti per estrarre il proprio DNA. </li></ol> Parte seconda: Estrazione del DNA <ol><li> Il passo successivo è quello di utilizzare il metodo fenolo-cloroformio per estrarre il DNA dal lisato. Aggiungere un volume equivalente (circa 3 ml) di fenolo: cloroformio: alcool isoamilico (IAA) per il tubo di lisato, avendo cura di cambiare puntali per pipette per ogni aggiunta per evitare contaminazioni incrociate. Vortex per 10 secondi per mescolare bene. </li><li> Rotazione del tubo a 2500 g per 5 minuti, assicurandosi che la centrifuga è equilibrata. Durante la centrifugazione, il fenolo-cloroformio-lisato miscela deve separare in due strati: uno strato organico contenente il fenolo, cloroformio, e le proteine ​​dal campione, sul fondo, e uno strato acquoso, che consiste del vostro DNA, acqua e altri molecole più idrofile, in cima. </li><li> Trasferire la fase acquosa (contenente il DNA) in un nuovo tubo 15 ml Falcon. Fare attenzione a non toccare l&#39;interfaccia con la punta della pipetta (sempre lasciare una piccola quantità dello strato acquoso dietro). </li><li> Per questo nuovo tubo, aggiungere un volume equivalente (circa 3 ml) di Cloroformio: IAA, avendo cura di cambiare puntali per pipette per ogni aggiunta per evitare contaminazioni incrociate. Vortex per 10 secondi. Questo passaggio consente di rimuovere qualsiasi residuo fenolo dal campione di DNA. </li><li> Rotazione a 2500 g per 5 minuti o fino a strato acquoso è chiara. Trasferimento strato acquoso in una nuova provetta Falcon e aggiungere 1 ml di TE a pH 8.0, facendo attenzione a non toccare l&#39;interfaccia con la punta della pipetta (sempre lasciare una piccola quantità dello strato acquoso dietro). Questo strato acquoso contenente il DNA estratto. </li></ol> Parte terza: La concentrazione del DNA e di lavaggio <ol><li> Il passo successivo è quello di lavare e concentrare il campione di DNA in un tubo da 15 ml per centrifuga Amicon Ultra. I tubi Amicon costituiti da un filtro che trattiene le molecole pari o superiore a un determinato peso molecolare (il retentato) e un tubo per prendere il flow-through (il filtrato). In questo caso, il filtro trattiene il vostro DNA (il retentato). Trasferite i vostri estrarre il DNA da 2,5 a passo il vano del filtro di un tubo Amicon Ultra. </li><li> Rotazione a 3500 g per 10 minuti. Controllare per assicurarsi che non vi è meno di 1 ml di liquido trattenuta dal filtro Amicon. Se rimane più retentato, riempire il filtro con TE e girare di nuovo. Assicurarsi di utilizzare un nuovo puntale per pipetta per ogni aggiunta TE per evitare contaminazioni incrociate. </li><li> Rimuovere il flusso continuo, o filtrato, ad un altro tubo Falcon e salvarlo in frigo prima di aver confermato il vostro prodotto finale di DNA su un gel (parte quarta). </li><li> Aggiungere 2 ml di tampone TE al filtro Amicon e far girare a 3500 g per 6 minuti, avendo cura di usare un nuovo puntale per pipetta per ogni aggiunta TE per evitare contaminazioni incrociate. Filtrato con piscina che dal punto 3.3 e salvare in frigorifero. </li><li> Lavare il DNA altre due volte con TE, per un totale di tre lavaggi (avendo cura di usare sempre un nuovo puntale per pipetta), e salvando il filtrato di volta in volta (come passi al 3.3 e 3.4). Per l&#39;ultimo lavaggio, rotazione fino a 200 a 500 ml di resti retentato nel filtro Amicon. Registrare il volume finale e trasferire i retentato (contenente il DNA) in una provetta etichettata 1,5 ml Eppendorf. </li></ol> Parte quarta: Determinazione della qualità del DNA <ol><li> Controllare la qualità del DNA e valutare la concentrazione del DNA da parte esaurendo i campioni su un gel di agarosio 0,8% gel staINED con 1 ml di etidio bromuro (EtBr) durante la notte. (Siate molto prudenti quando si usa EtBr-it è un noto agente mutageno e cancerogeno. Assicurati di cambiare spesso i guanti ed evitare di EtBr trasferimento al resto del laboratorio e per la pelle.) Caricare i campioni accanto alla scale del DNA, che servono come standard di dimensioni e intensità (vedi punto successivo). </li><li> Nelle corsie prima diversi, scale carico con bande di vari pesi molecolari e concentrazioni. Si consiglia il seguente schema di carico: nelle corsie primo e l&#39;ultimo (corsia esterna), carico 10 ml di 50ng/μl di 1kb + o scaletta 2log. Nelle corsie 2,3 e 4, carico 2 microlitri, 5 microlitri, e 10 microlitri, rispettivamente, della scala 50ng/μl λHindIII. Infine, carico 5 microlitri per corsia di estrarre il DNA con la tintura per ogni campione. </li><li> Attivare il gel a 15 volt per circa 16 ore (si raccomanda di eseguire durante la notte). </li><li> Il giorno dopo, fotografare il gel UV utilizzando un sistema di documentazione del gel. Per determinare il campo peso molecolare del DNA e la sua concentrazione, confrontare le bande campione per fasce di scale. DNA di buona qualità hanno un alto peso molecolare (&gt; 36kb), e mostrano pochi segni di taglio / degrado. Vedere la Figura 1. </li></ol> Parte quinta: centrifugazione su gradiente di cloruro di Cesio <ol><li> Se la qualità del DNA è buona e in quantità sufficiente, si può procedere per purificare il DNA eseguendo un cloruro di cesio (CsCl) centrifugazione in gradiente. Si noti che questa fase di purificazione è opzionale e non è necessario per tutte le applicazioni a valle (per esempio, se si desidera generare librerie fosmid DOVRESTE purificare, mentre se si vuole semplicemente effettuare reazioni di PCR, purificazione di solito non è necessario). In primo luogo, etichetta un tubo per centrifuga per ogni campione. </li><li> Per ogni provetta, aggiungere 160 mg di CsCl, 178 ml di DNA genomico. Dopo aver aggiunto CsCl e del DNA per il tubo, mettere un piccolo pezzo di parafilm sulla parte superiore del tubo e capovolgere delicatamente il tubo di 10-20 volte per miscelare i componenti. Non mescolare pipettando, che può causare taglio del DNA. Successivamente, aggiungere 10 ml di 10 mcg / EtBr microlitri di questo tubo e mescolare nello stesso modo. (Siate molto prudenti quando si usa EtBr-it è un noto agente mutageno e cancerogeno. Assicurati di cambiare spesso i guanti ed evitare di EtBr trasferimento al resto del laboratorio e alla vostra pelle.) </li><li> Assicurarsi che il peso di tutti i tubi sono bilanciate prima della centrifugazione in modo che le differenze di peso tra i tubi sono inferiori a 1 mg. </li><li> Collocare le provette nel rotore hemostat utilizzando, chiudere il coperchio e posizionare il rotore all&#39;interno del ultracentrifuga. </li><li> Chiudere la porta ultracentrifuga. Vuoto sarà applicato non appena si chiude la porta. Eseguire durante la notte a 100.000 giri al minuto per 18 ore e 20 ° C. </li><li> Quando la centrifugazione è completo, estrarre i tubi dal rotore utilizzando hemostat e posto su un rack tubo. </li><li> Visualizza il DNA con luce blu transilluminatore, o se non disponibile, un uso prolungato della luce UV di lunghezza d&#39;onda, in una stanza buia. Indossare un paio di occhiali ambra filtro per vedere la band DNA. Vedere la Figura 2. </li><li> Utilizzando una siringa sterile e 1cc ago (26G 5 / 8), rimuovere banda del DNA e collocarlo in un tubo Eppendorf 1,5 ml. </li><li> Per aiutare a recuperare la maggior parte del DNA intrappolato nello spazio morto nella siringa, lavare la siringa con 100 ul TE e aggiungere la soluzione di risciacquo al tubo. Preparare un tubo con 100 microlitri di buffer TE per campione al fine di prevenire la contaminazione crociata. </li><li> Per rimuovere EtBr dal DNA, aggiungere un volume equivalente di butanolo saturo d&#39;acqua al tubo, invertire i tubi delicatamente 1-20 volte, centrifugare a 10000 rpm per 1 minuto e scartare lo strato superiore. </li><li> Ripetere il lavaggio finché il colore di butanolo è trasparente, 3 - 4 volte di più. </li><li> Posto 4 ml TE in una provetta da centrifuga Ultra Amicon e aggiungere la soluzione di DNA da sopra. </li><li> Centrifugare a 3500 g a temperatura ambiente, fino a quando il volume del DNA è ridotto a circa 100-500 microlitri (circa 6-7 minuti) ed eliminare la flow-through. </li><li> Aggiungi 2ml TE Amicon filtro e centrifugare a 3500 g per 6 minuti, avendo cura di usare un nuovo puntale per pipetta per ogni aggiunta per evitare contaminazioni incrociate. Ripetere due volte. </li><li> Concentrato ad un volume finale di 50-100 microlitri per centrifugazione aggiuntive necessarie e trasferire la soluzione di DNA sul filtro a un nuovo tubo di 1,5 ml Eppendorf. </li><li> Aggiungere 40 microlitri TE al filtro Amicon e pipettare su e giù lungo entrambe le membrane filtranti per lavare ogni residuo di DNA. Aggiungere a questa soluzione per il tubo in 5.15. </li><li> Posizionare un microcontrollore YM-30 unità di filtro in un tubo microcontrollore e prelavaggio il microcontrollore con l&#39;aggiunta di 200 microlitri di acqua in autoclave e la centrifugazione a 10000 rpm per 7 minuti. </li><li> Aggiungere la soluzione di DNA da 5,16 a microcontrollore lavata al fine di concentrare ulteriormente il DNA. Centrifugare a 5000-10000 g per 1 - 3 minuti. Controllare la quantità di liquidosulla centrifugazione filtro e ripetere fino a quando la quantità di liquido nel filtro si riduce a circa 50 microlitri. </li><li> Posizionare l&#39;unità filtro a testa in giù in un tubo nuovo microcontrollore e centrifugare a 1000 g per 3 minuti. La quantità ideale di soluzione concentrata è di 50-60 microlitri. </li><li> Misurare e registrare la concentrazione del DNA su un NanoDrop e controllo di qualità del picco (dovrebbero essere 260 nm). </li><li> Trasferire una piccola aliquota del DNA in una provetta eppendorf pulita per lavorare fotografici e congelare a meno 20. Trasferire il resto del DNA per un secondo pulita eppendorf e conservare a meno 80. </li></ol> Rappresentante dei risultati: Quando questo protocollo è eseguita correttamente, si dovrebbe vedere un immagine gel dopo il passaggio a 4,4 Determinazione della qualità del DNA simile alla Figura 1. Concentrazione di DNA estratti effettiva varia a seconda della fonte del campione. Dopo passo 5,7 nel gradiente di CsCl centrifugazione, DNA genomico illuminata da luce blu dovrebbe essere simile alla Figura 2. <img src="/files/ftp_upload/1352/1352Fig1newer.png" alt="Figura 1" /> Figura 1. 0,8% di agarosio immagine elettroforesi su gel ad alto peso molecolare del DNA raccolti da quattro profondità nel subartiche Oceano Pacifico (in duplice copia), colorati con il intercalando agente di bromuro di etidio (10 mg / ml). Gel è stato eseguito a 15V per ~ 16 ore in tampone 1X TBE gel in esecuzione. Bande del campione sono di buona qualità che mostrano scarse prove di taglio meccanico (mostra singole bande o macchie invece di bande multiple) anche se gli estratti 10m conservano alcuni RNA riporto (vedi striscio nel range 0,5-2,0 Kb). <img src="/files/ftp_upload/1352/1352Fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Banda DNA genomico illuminati dalla luce blu dopo la centrifugazione gradiente di CsCl.

<ol>
	<li>Beja, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=To+BAC+or+not+to+BAC:+marine+ecogenomics.">To BAC or not to BAC: marine ecogenomics.</a> Curr Opin Biotechnol. 15 (3), 187-190 (2004).</li><li>Beja, O., Suzuki, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+and+analysis+of+bacterial+artificial+chromosome+libraries+from+a+marine+microbial+assemblage.">Construction and analysis of bacterial artificial chromosome libraries from a marine microbial assemblage.</a> Environ Microbiol. 2 (5), 516-529 (2000).</li><li>DeLong, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Community+genomics+among+stratified+microbial+assemblages+in+the+oceans+interior.">Community genomics among stratified microbial assemblages in the oceans interior.</a> Science. 311, 496-503 (2006).</li><li>Stein, J. L., Marsh, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+uncultivated+prokaryotes:+isolation+and+analysis+of+a+40-kilobase-pair+genome+fragment+from+a+planktonic+marine+archaeon.">Characterization of uncultivated prokaryotes: isolation and analysis of a 40-kilobase-pair genome fragment from a planktonic marine archaeon.</a> J Bacteriol. 178 (3), 591-599 (1996).</li><li>Somerville, C. C., Knight, I. T., Straube, W. L., Colwell, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple,+rapid+method+for+the+direct+isolation+of+nucleic+acids+from+aquatic+environments.">A simple, rapid method for the direct isolation of nucleic acids from aquatic environments.</a> Appl. Environ. Microbiol. 55 (3), 548-554 (1989).</li></ol>

A seconda di quanti campioni devono essere trattati, questo può essere un tempo ad alta intensità procedura a causa delle due fasi di incubazione di un&#39;ora, e il ripetuti lavaggi e le fasi di centrifugazione. E &#39;meglio pianificare due giorni interi per questa procedura di lasciare un sacco di tempo. Se ci sono problemi a far il volume finale dell&#39;estratto nel tubo Amicon di ridurre fino a 200-500μl al momento della concentrazione del DNA e il lavaggio, prova a fare ulteriori lavaggi e centrifugazioni TE (ripeto parte terza) fino a quando il volume appropriato è rimasto. Inoltre, se l&#39;estratto odore acuto di cloroformio, è meglio fare ulteriori lavaggi fino a quando l&#39;odore diminuisce per assicurarsi che tutto il cloroformio è stato rimosso. Ancora una volta, tutti i reagenti usati in questo protocollo sono aliquotati dalle scorte di laboratorio in piccoli stock di lavoro-questo è molto importante per evitare la contaminazione crociata dei campioni di DNA e la contaminazione delle scorte di laboratorio. Inoltre, quando pipettaggio, assicurarsi di modificare puntali per ogni aggiunta per evitare contaminazioni incrociate.

A correction was made to "<a href="/video/1352">DNA Extraction from 0.22 &#181;M Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation</a>". A typo in a volume's measurement was corrected in step 1.2.
The step was corrected from:
Once the filter has thawed, begin the first of two incubations: one to lyse the cells and remove RNA, and one to break down proteins. For the first incubation, add 100 &#956;l lysozyme (125 mg in 1000 &#956;l TE) and 20 ml RNase A (10 &#956;g/ml) to the filter. Reseal the filter with Parafilm and leave it to rotate in the hybridization oven at 37&#176;C for 1 hour.
to:
Once the filter has thawed, begin the first of two incubations: one to lyse the cells and remove RNA, and one to break down proteins. For the first incubation, add 100 &#956;l lysozyme (125 mg in 1000 &#956;l TE) and 20 &#956;l RNase A (10 &#956;g/ml) to the filter. Reseal the filter with Parafilm and leave it to rotate in the hybridization oven at 37&#176;C for 1 hour.

A correction was made to <a href="/video/1352">DNA Extraction from 0.22 &#181;M Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation</a>. A typo in a volume's measurement was corrected in step 1.2.

Erratum: DNA Extraction from 0.22 &#181;M Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>1 cc syringe (26G5/8 needle)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD</td>
<td>309597</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1 ml syringe (26G5/8 needle)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD</td>
<td>309597</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1.5ml eppendorf tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>0030 125.150</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>15ml tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>CLS430791</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>5cc syringe</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD</td>
<td>309603</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Amicon&reg; Ultra-4 Centrifugal Filter Devices</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>UFC801096</td>
<td>10,000 Nominal molecular weight limit</td>
</tr>
<tr>
<td>Butanol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>A383-1</td>
<td>Make it water saturated (butanol:water = 1:1)</td>
</tr>
<tr>
<td>Centrifuge rotor, JA5.3 </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>368690</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Centrifuge, Avanti&reg; J-E</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>369003</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cesium chloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>C4036</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Chloroform:IAA (24:1)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>25666-500ML</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ethidium Bromide (EtBr)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>E1510-10ml</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>E5134</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hybridization oven</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>13-247-10</td>
<td>37&deg;C & 55&deg;C</td>
</tr>
<tr>
<td>Lysis Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>0.75 M sucrose, 40 mM EDTA, 50 mM Tris (pH 8.3)</td>
</tr>
<tr>
<td>Lysozyme</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>L6876-5G</td>
<td>125 mg in 1000 &mu;l TE</td>
</tr>
<tr>
<td>Microcon&reg; Ultracel YM-30 Centrifugal Filter Unit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>42410</td>
<td>50 bp cut off</td>
</tr>
<tr>
<td>Parafilm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>13-374-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phenol:Chloroform:IAA (25:24:1)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>77617-500ML</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Proteinase K</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>19133</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RNase A</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>BP2539-100</td>
<td>10 &mu;g/ml</td>
</tr>
<tr>
<td>Safe Imager&trade; Blue light transilluminator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>S37102</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>L4509</td>
<td>20% SDS</td>
</tr>
<tr>
<td>Sterivex filters</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>SVG010RS</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sucrose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>S0389</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Table top centrifuge</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>5415D</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TE buffer, pH 8.0</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trizma&reg; base</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>T1503</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ultracentrifuge rotor, TLA 100</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>343847</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ultracentrifuge tube (7X20mm, PC)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman</td>
<td>343775</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ultracentrifuge tube rack</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman</td>
<td>348302</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ultracentrifuge, Optima&reg; Max</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

dna extraction from 0.22 &mu;m sterivex filters and cesium chloride density gradient centrifugation

Questo metodo è utilizzato per estrarre DNA genomico ad alto peso molecolare peso da biomassa planctonica concentrati su filtri 0,22 mM Sterivex che sono stati trattati con memorizzazione / buffer di lisi e archiviati a -80 ° C, e per purificare il DNA utilizzando un gradiente di densità di cloruro di cesio. Il protocollo inizia con due di un&#39;ora le fasi di incubazione per liberare il DNA dalle cellule e rimuovere l&#39;RNA. Poi, una serie di fenolo: cloroformio e estrazioni Cloroformio vengono eseguite seguita da centrifugazione per rimuovere le proteine ​​e componenti della membrana cellulare, la raccolta del DNA estratto acquoso, e diverse fasi di scambio tampone per lavare e concentrare l&#39;estratto. Parte quinta descrive la purificazione opzionale tramite gradiente di densità di cloruro di cesio. Si consiglia di lavorare con meno di 15 campioni in una sola volta per evitare confusione e ridurre i tempi del protocollo. Il tempo totale richiesto per questo protocollo dipende dal numero di campioni da estrarre. Per 10-15 i campioni e assumendo l&#39;attrezzatura corretta centrifugazione è disponibile, questo protocollo intera dovrebbe prendere 3 giorni. Assicurarsi di avere i forni ibridazione impostata la temperatura all&#39;inizio del processo.

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DNA Extraction from 0.22 &mu;M Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation

Descriviamo un metodo per l&#39;estrazione di alto peso molecolare del DNA genomico da biomassa planctonica concentrati su filtri 0,22 micron Sterivex, seguita da centrifugazione in gradiente di cesio cloruro di densità per la purificazione.

Estrazione del DNA da 0,22 Filtri mM Sterivex e cloruro di Cesio densità centrifugazione gradiente

This method is used to extract high molecular weight genomic DNA from planktonic biomass concentrated on 0.22 &mu;M Sterivex filters that have been ...

dna-extraction-from-022-m-sterivex-filters-cesium-chloride-density

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

29.0K Views.  University of British Columbia - UBC. Descriviamo un metodo per l'estrazione di alto peso molecolare del DNA genomico da biomassa planctonica concentrati su filtri 0,22 micron Sterivex, seguita da centrifugazione in gradiente di cesio cloruro di densità per la purificazione.

Video: DNA Extraction from 0.22 μM Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation

Extraction of High Molecular Weight Genomic DNA from Soils and Sediments

The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with nutrient and energy flow within terrestrial ecosystems. Cultivation-independent environmental genomic, also known as metagenomic, approaches promise unprecedented access to this genetic information with respect to pathway reconstruction and functional screening for high value therapeutic and biomass conversion processes. However, the soil microbiome still remains a challenge largely due to the difficulty in obtaining high molecular weight DNA of sufficient quality for large insert library production. Here we introduce a protocol for extracting high molecular weight, microbial community genomic DNA from soils and sediments. The quality of isolated genomic DNA is ideal for constructing large insert environmental genomic libraries for downstream sequencing and screening applications. 
The procedure starts with cell lysis. Cell walls and membranes of microbes are lysed by both mechanical (grinding) and chemical forces (&beta;-mercaptoethanol). Genomic DNA is then isolated using extraction buffer, chloroform-isoamyl alcohol and isopropyl alcohol. The buffers employed for the lysis and extraction steps include guanidine isothiocyanate and hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB) to preserve the integrity of the high molecular weight genomic DNA. Depending on your downstream application, the isolated genomic DNA can be further purified using cesium chloride (CsCl) gradient ultracentrifugation, which reduces impurities including humic acids. The first procedure, extraction, takes approximately 8 hours, excluding DNA quantification step. The CsCl gradient ultracentrifugation, is a two days process. During the entire procedure, genomic DNA should be treated gently to prevent shearing, avoid severe vortexing, and repetitive harsh pipetting.

A methodology to isolate high molecular weight and high quality genomic DNA from soil microbial community is described.

Estrazione di DNA ad alta peso molecolare genomico da terreni e sedimenti

The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with ...

Ricerca

Biologia

DNA Extraction from Paraffin Embedded Material for Genetic and Epigenetic Analyses

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number gains and losses and DNA methylation. Advances in high-throughput, genome-wide profiling technologies, such as microarrays, have significantly improved our ability to identify and detect these specific alterations. However as technology continues to improve, a limiting factor remains sample quality and availability. Furthermore, follow-up clinical information and disease outcome are often collected years after the initial specimen collection. Specimens, typically formalin-fixed and paraffin embedded (FFPE), are stored in hospital archives for years to decades. DNA can be efficiently and effectively recovered from paraffin-embedded specimens if the appropriate method of extraction is applied. High quality DNA extracted from properly preserved and stored specimens can support quantitative assays for comparisons of normal and diseased tissues and generation of genetic and epigenetic signatures 1. To extract DNA from paraffin-embedded samples, tissue cores or microdissected tissue are subjected to xylene treatment, which dissolves the paraffin from the tissue, and then rehydrated using a series of ethanol washes. Proteins and harmful enzymes such as nucleases are subsequently digested by proteinase K. The addition of lysis buffer, which contains denaturing agents such as sodium dodecyl sulfate (SDS), facilitates digestion 2. Nucleic acids are purified from the tissue lysate using buffer-saturated phenol and high speed centrifugation which generates a biphasic solution. DNA and RNA remain in the upper aqueous phase, while proteins, lipids and polysaccharides are sequestered in the inter- and organic-phases respectively. Retention of the aqueous phase and repeated phenol extractions generates a clean sample. Following phenol extractions, RNase A is added to eliminate contaminating RNA. Additional phenol extractions following incubation with RNase A are used to remove any remaining enzyme. The addition of sodium acetate and isopropanol precipitates DNA, and high speed centrifugation is used to pellet the DNA and facilitate isopropanol removal. Excess salts carried over from precipitation can interfere with subsequent enzymatic assays, but can be removed from the DNA by washing with 70% ethanol, followed by centrifugation to re-pellet the DNA 3. DNA is re-suspended in distilled water or the buffer of choice, quantified and stored at -20&deg;C. Purified DNA can subsequently be used in downstream applications which include, but are not limited to, PCR, array comparative genomic hybridization 4 (array CGH), methylated DNA Immunoprecipitation (MeDIP) and sequencing, allowing for an integrative analysis of tissue/tumor samples.

This video demonstrates the protocol for DNA extraction from formalin-fixed paraffin-embedded material. This is a multi-day procedure in which tissue sections are deparaffinized with xylene, rehydrated with ethanol and treated with proteinase K to purify and isolate DNA for subsequent gene-specific or genome-wide analysis.

Estrazione DNA da materiale in paraffina per le analisi genetiche ed epigenetiche

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number ...

Extraction of High Molecular Weight DNA from Microbial Mats

Successful and accurate analysis and interpretation of metagenomic data is dependent upon the efficient extraction of high-quality, high molecular weight (HMW) community DNA. However, environmental mat samples often pose difficulties to obtaining large concentrations of high-quality, HMW DNA. Hypersaline microbial mats contain high amounts of extracellular polymeric substances (EPS)1 and salts that may inhibit downstream applications of extracted DNA. Direct and harsh methods are often used in DNA extraction from refractory samples. These methods are typically used because the EPS in mats, an adhesive matrix, binds DNA2,3 during direct lysis. As a result of harsher extraction methods, DNA becomes fragmented into small sizes4,5,6.
The DNA thus becomes inappropriate for large-insert vector cloning. In order to circumvent these limitations, we report an improved methodology to extract HMW DNA of good quality and quantity from hypersaline microbial mats. We employed an indirect method involving the separation of microbial cells from the background mat matrix through blending and differential centrifugation. A combination of mechanical and chemical procedures was used to extract and purify DNA from the extracted microbial cells. Our protocol yields approximately 2 &mu;g of HMW DNA (35-50 kb) per gram of mat sample, with an A260/280 ratio of 1.6. Furthermore, amplification of 16S rRNA genes7 suggests that the protocol is able to minimize or eliminate any inhibitory effects of contaminants. Our results provide an appropriate methodology for the extraction of HMW DNA from microbial mats for functional metagenomic studies and may be applicable to other environmental samples from which DNA extraction is challenging.

We provide an improved protocol for extracting high molecular weight DNA from hypersaline microbial mats. Microbial cells are separated from the mat matrix prior to DNA extraction and purification. This enhances the concentrations, quality, and size of the DNA. The protocol may be used for other refractory samples.

Estrazione di DNA ad alta peso molecolare da Mats microbica

Successful and accurate analysis and interpretation of metagenomic data is dependent upon the efficient extraction  of high-quality, high molecular weight ...

Extraction and Analysis of Cortisol from Human and Monkey Hair

The stress hormone cortisol (CORT) is slowly incorporated into the growing hair shaft of humans, nonhuman primates, and other mammals. We developed and validated a method for CORT extraction and analysis from rhesus monkey hair and subsequently adapted this method for use with human scalp hair. In contrast to CORT &#34;point samples&#34; obtained from plasma or saliva, hair CORT provides an integrated measure of hypothalamic-pituitary-adrenocortical (HPA) system activity, and thus physiological stress, during the period of hormone incorporation. Because human scalp hair grows at an average rate of 1 cm/month, CORT levels obtained from hair segments several cm in length can potentially serve as a biomarker of stress experienced over a number of months.
In our method, each hair sample is first washed twice in isopropanol to remove any CORT from the outside of the hair shaft that has been deposited from sweat or sebum. After drying, the sample is ground to a fine powder to break up the hair&#39;s protein matrix and increase the surface area for extraction. CORT from the interior of the hair shaft is extracted into methanol, the methanol is evaporated, and the extract is reconstituted in assay buffer. Extracted CORT, along with standards and quality controls, is then analyzed by means of a sensitive and specific commercially available enzyme immunoassay (EIA) kit. Readout from the EIA is converted to pg CORT per mg powdered hair weight. This method has been used in our laboratory to analyze hair CORT in humans, several species of macaque monkeys, marmosets, dogs, and polar bears. Many studies both from our lab and from other research groups have demonstrated the broad applicability of hair CORT for assessing chronic stress exposure in natural as well as laboratory settings.

Cortisol (CORT) accumulates in the growing hair shaft of humans and nonhuman primates. We describe methods for extracting and analyzing hair CORT with high precision and sensitivity. Measurement of hair CORT is particularly well-suited for assessing chronic stress over periods of weeks to months.

Estrazione e analisi di cortisolo da umani e Monkey Capelli

The stress hormone cortisol (CORT) is slowly incorporated into the growing hair shaft of humans, nonhuman primates, and other mammals. We developed and ...

The Infiltration-centrifugation Technique for Extraction of Apoplastic Fluid from Plant Leaves Using Phaseolus vulgaris as an Example

The apoplast is a distinct extracellular compartment in plant tissues that lies outside the plasma membrane and includes the cell wall. The apoplastic compartment of plant leaves is the site of several important biological processes, including cell wall formation, cellular nutrient and water uptake and export, plant-endophyte interactions and defence responses to pathogens. The infiltration-centrifugation method is well established as a robust technique for the analysis of the soluble apoplast composition of various plant species. The fluid obtained by this method is commonly known as apoplast washing fluid (AWF). The following protocol describes an optimized vacuum infiltration and centrifugation method for AWF extraction from Phaseolus vulgaris (French bean) cv. Tendergreen leaves. The limitations of this method and the optimization of the protocol for other plant species are discussed. Recovered AWF can be used in a wide range of downstream experiments that seek to characterize the composition of the apoplast and how it varies in response to plant species and genotype, plant development and environmental conditions, or to determine how microorganisms grow in apoplast fluid and respond to changes in its composition.

The Infiltration-centrifugation Technique for Extraction of Apoplastic Fluid from Plant Leaves Using Phaseolus vulgaris as an Example

This protocol details the optimized extraction of apoplast washing fluid from plant leaves, using French bean plants (Phaseolus vulgaris) as a model example.

La tecnica infiltrazione-centrifugazione per l&#39;estrazione di apoplastico fluido da foglie delle piante Utilizzo<em&gt; Phaseolus vulgaris</em&gt; Come un esempio

The apoplast is a distinct extracellular compartment in plant tissues that lies outside the plasma membrane and includes the cell wall. The apoplastic ...

A Hybrid DNA Extraction Method for the Qualitative and Quantitative Assessment of Bacterial Communities from Poultry Production Samples

The efficacy of DNA extraction protocols can be highly dependent upon both the type of sample being investigated and the types of downstream analyses performed. Considering that the use of new bacterial community analysis techniques (e.g., microbiomics, metagenomics) is becoming more prevalent in the agricultural and environmental sciences and many environmental samples within these disciplines can be physiochemically and microbiologically unique (e.g., fecal and litter/bedding samples from the poultry production spectrum), appropriate and effective DNA extraction methods need to be carefully chosen. Therefore, a novel semi-automated hybrid DNA extraction method was developed specifically for use with environmental poultry production samples. This method is a combination of the two major types of DNA extraction: mechanical and enzymatic. A two-step intense mechanical homogenization step (using bead-beating specifically formulated for environmental samples) was added to the beginning of the &#8220;gold standard&#8221; enzymatic DNA extraction method for fecal samples to enhance the removal of bacteria and DNA from the sample matrix and improve the recovery of Gram-positive bacterial community members. Once the enzymatic extraction portion of the hybrid method was initiated, the remaining purification process was automated using a robotic workstation to increase sample throughput and decrease sample processing error. In comparison to the strict mechanical and enzymatic DNA extraction methods, this novel hybrid method provided the best overall combined performance when considering quantitative (using 16S rRNA qPCR) and qualitative (using microbiomics) estimates of the total bacterial communities when processing poultry feces and litter samples.

A novel semi-automated hybrid DNA extraction method for use with environmental poultry production samples was developed and demonstrated improvements over a common mechanical and enzymatic extraction method in terms of the quantitative and qualitative estimates of the total bacterial communities.

Un ibrido metodo di estrazione del DNA per la valutazione delle comunità batteriche qualitativa e quantitativa di pollame campioni di produzione

The efficacy of DNA extraction protocols can be highly dependent upon both the type of sample being investigated and the types of downstream analyses ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of diverse libraries of retroviral integration sites using ligation-mediated PCR (LM-PCR) amplification and next-generation sequencing (NGS), (2) mapping the genomic location of each virus-host junction using BEDTools, and (3) analyzing the data for statistical relevance. Genomic DNA extracted from infected cells is fragmented by digestion with restriction enzymes or by sonication. After suitable DNA end-repair, double-stranded linkers are ligated onto the DNA ends, and semi-nested PCR is conducted using primers complementary to both the long terminal repeat (LTR) end of the virus and the ligated linker DNA. The PCR primers carry sequences required for DNA clustering during NGS, negating the requirement for separate adapter ligation. Quality control (QC) is conducted to assess DNA fragment size distribution and adapter DNA incorporation prior to NGS. Sequence output files are filtered for LTR-containing reads, and the sequences defining the LTR and the linker are cropped away. Trimmed host cell sequences are mapped to a reference genome using BLAT and are filtered for minimally 97% identity to a unique point in the reference genome. Unique integration sites are scrutinized for adjacent nucleotide (nt) sequence and distribution relative to various genomic features. Using this protocol, integration site libraries of high complexity can be constructed from genomic DNA in three days. The entire protocol that encompasses exogenous viral infection of susceptible tissue culture cells to integration site analysis can therefore be conducted in approximately one to two weeks. Recent applications of this technology pertain to longitudinal analysis of integration sites from HIV-infected patients.

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

Amplificazione, sequenziamento di prossima generazione, e DNA genomico mappatura dei siti di integrazione retrovirali

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad to extract cellular DNA from whole blood in less than 2 min. The blood specimen is treated with detergent, mixed briefly and applied by pipet to the separation membrane. The lysate wicks into the blotting pad due to capillary action, capturing the genomic DNA on the surface of the separation membrane. The extracted DNA is retained on the membrane during a simple wash step wherein PCR inhibitors are wicked into the absorbent blotting pad. The membrane containing the entrapped DNA is then added to the PCR reaction without further purification. This simple method does not require laboratory equipment and can be easily implemented with inexpensive laboratory supplies. Here we describe a protocol for highly sensitive detection and quantitation of HIV-1 proviral DNA from 100 &#181;l whole blood as a model for early infant diagnosis of HIV that could readily be adapted to other genetic targets.

We describe here a simple and rapid paper-based DNA extraction method of HIV proviral DNA from whole blood detected by quantitative PCR. This protocol can be extended for use in detecting other genetic markers or using alternative amplification methods.

L&#39;isolamento di filtrazione di acidi nucleici: DNA metodo di estrazione semplice e veloce

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

Preparation of Formalin-fixed Paraffin-embedded Tissue Cores for both RNA and DNA Extraction

Formalin-fixed paraffin embedded tissue (FFPET) represents a valuable, well-annotated substrate for molecular investigations. The utility of FFPET in molecular analysis is complicated both by heterogeneous tissue composition and low yields when extracting nucleic acids. A literature search revealed a paucity of protocols addressing these issues, and none that showed a validated method for simultaneous extraction of RNA and DNA from regions of interest in FFPET. This method addresses both issues. Tissue specificity was achieved by mapping cancer areas of interest on microscope slides and transferring annotations onto FFPET blocks. Tissue cores were harvested from areas of interest using 0.6 mm microarray punches. Nucleic acid extraction was performed using a commercial FFPET extraction system, with modifications to homogenization, deparaffinization, and Proteinase K digestion steps to improve tissue digestion and increase nucleic acid yields. The modified protocol yields sufficient quantity and quality of nucleic acids for use in a number of downstream analyses, including a multi-analyte gene expression platform, as well as reverse transcriptase coupled real time PCR analysis of mRNA expression, and methylation-specific PCR (MSP) analysis of DNA methylation.

This modified extraction protocol improves RNA and DNA yields from more precisely targeted regions of interest in histopathologic tissue blocks.

Preparazione core tessuto inclusi in paraffina fissati in formalina per entrambi RNA e DNA Extraction

Formalin-fixed paraffin embedded tissue (FFPET) represents a valuable, well-annotated substrate for molecular investigations. The utility of FFPET in ...

Sperm Collection of Differential Quality Using Density Gradient Centrifugation

In sexual reproduction, a male gamete or sperm cell fuses with a female gamete to bring about fertilization. However, a large number of sperm cells with fertilizing ability are required to interact with a female gamete to ensure fertilization. As such, the fertilizing ability of individual sperm cells is critical for successful reproduction. Density gradient centrifugation has been utilized for several decades as a reproducible, fast, efficient, effective and extremely adaptable method to collect only high-quality sperm to be used in assisted reproductive technology. The protocols we described herein focus on the utilization of the discontinuous Percoll density gradient centrifugation (PDGC) technique to isolate three distinct populations of rooster sperm by their quality. We were able to collect low-, medium- and high-quality sperm. We also describe reproducible protocols that entail determining fertility potential of sperm by assessing their viability, mobility and penetrability. Collection of sperm by their quality using PDGC technique would be useful to accurately and thoroughly characterize sperm with differential fertility potential.

In this paper, we aim to describe the performance of the density gradient centrifugation technique and its application in sperm physiology research.

Raccolta di sperma di qualità differenziale mediante centrifugazione in gradiente di densità

In sexual reproduction, a male gamete or sperm cell fuses with a female gamete to bring about fertilization. However, a large number of sperm cells with ...