ELISPOTアッセイ:IFN-γ分泌脾細胞の検出

ソース: トーニャ・J・ウェッブ^1
1メリーランド大学医学部微生物学・免疫学科、マーリーン・スチュワート・グリーンバウム総合癌センター、ボルチモア、メリーランド州 21201

ELISPOTは、細胞の免疫応答を検出するために使用される標準化された、再現可能なアッセイです。このアッセイは、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)ベースの方法を利用して、スポットで可視化できる単細胞免疫応答を検出し、ELISPOTという名前を付けます。ELISPOTは、1983年に、チェルキンスキーによって、抗原特異的免疫グロブリンを産生するB細胞ハイブリドーマの数を列挙する方法として説明された(1)。同じグループはさらに、Tリンパ球を産生するサイトカインの頻度を測定するアッセイを開発した。現在、ELISPOTは臨床試験やワクチン候補における抗原特異的T細胞免疫を測定するためのゴールドスタンダードとなっています。例えば、ワクチン接種後または感染中に、血漿細胞および記憶B細胞は保護を提供する抗体を分泌する。典型的には、これらのB細胞応答は、抗原特異的抗体の血清定量子を測定することによって評価される。しかしながら、このタイプの分析は、典型的にはELISAによって測定され、記憶B細胞を含んでおらず、検出可能な血清抗体レベルがない場合でも存在しうる。さらに、循環記憶B細胞は病原体再曝露後に観察される迅速かつ保護抗体応答にとって重要であることが確立されており、したがって、これらの細胞を検出できることが重要である。したがって、抗原特異的記憶B細胞応答を明確に評価するために、ELISAとELISPOTの両方を使用すべきである(2)。

ELISPOTアッセイは、目的の分泌されたタンパク質を捕捉するために抗体でコーティングされた膜裏地を含むプレートを使用しています。次いで、プレートに細胞と刺激をロードしてタンパク質産生を誘導する。分泌されたタンパク質は、表面にコーティングされた抗体によって捕捉されます。適切なインキュベーション時間の後、細胞が除去され、分泌された分子は、捕捉抗体と比較して、異なるエピトープに特異的であるビオチン化抗体を使用して検出される。次に、ストレプトアビジンペルオキシダーゼを添加し、続いてスポットの検出を可能にする基板を添加する(図1)。このアッセイの強さは、目的のタンパク質を産生する細胞の数を定量化する可能性がある。重要なのは、特定のタンパク質を産生する細胞の総数に変化があるかどうか、または集団内の個々の細胞がより多くのタンパク質を産生しているかどうかを評価できることです。さらに、運動学に関する情報を提供することができ、抗原特異的応答(抗原シミュレーション)に対する全体的な免疫活性化(ミトゲン刺激)を評価するために使用することができます。ELISPOTアッセイは、ミト原性または抗原特異的活性化後の300,000細胞中の1つの活性化細胞の検出を可能にします。

図 1: ELISPOT プロトコルの概要。

このアッセイの主な利点は、その単純さ-プロトコルは比較的簡単で簡単です。技術的な専門知識を必要とせず、b. 感度- それは単一細胞レベルで免疫細胞の検出を可能にし、フローサイトメトリーなどの他の方法と比較して非常に少数の細胞を必要とする、 c. 機能性- それは免疫に関する定量的データを提供します関数。

このラボ演習では、IFN-γ分泌脾細胞の検出のためのELISPOTプロトコルを示していますが、上記のアッセイとして、B細胞による抗体分泌を評価するためにも使用できます(3)。

1. セットアップ

バッファーと試薬

1. カルシウムまたはマグネシウムを使用せずに生菌リン酸緩衝生理食塩分(PBS)
2. コーティングバッファー- 滅菌PBSまたは炭酸塩バッファーのいずれか
3. PBSにおけるアッセイ希釈剤- 10%胎児ウシ血清(FBS)
4. 細胞培養培地- 10%FBS、ペニシリン/ストレプトマイシン、およびL-グルタミンを含むRPMI 1640
5. 洗浄バッファー- 0.05% Tween20 を含む PBS
6. 二重蒸留水(ddH₂O)
7. 検出基板-100mg AEC(3-アミノ-9-エチルカルバゾール)を10mL DMF(N,N,ジメチルホルミド)で検出した。

機器

8. ラミナーフローフード
9. 加湿インキュベーター(37°C、5%CO2に設定)
10. 自動ELISPOTリーダーまたは解剖顕微鏡

材料

11. エリスポットプレート
12. 滅菌および非滅菌貯留所
13. ピペッタとヒント
14. 滅菌血清ピペット
15. 滅菌、円錐状ポリプロピレンチューブ
16. プレート洗浄用スクイーズボトル2本

アッセイ特異的試薬

17. 細胞-一次細胞または細胞株(ここでは、C57BL/6マウス由来の脾細胞を用いた)
18. 覚醒剤-ミトゲンまたは抗原(ここでは、ソルボル12-ミリステート13-アセテート(PMA、50ng/mL)およびイオノマイシン(1μM)を用いた。
19. 一次抗体-ビオチン化抗サイトカイン検出抗体(アッセイ希釈剤で2μg/mLに希釈)
20. 二次抗体- ストレプトアビジン-ワサビ性ペルオキシダーゼ(SAv-HRP)

2. 手続き

コーティング

1. 条件を無菌および層状流フードの中に保ち、精製された抗サイトカイン捕捉抗体を無菌コーティングバッファー内の0.5-4.0 μg/mLの最終濃度に希釈する。(注:IFN-γおよびIL-6の場合は5 μg/mLを使用)。
2. 捕捉抗体溶液100μL/ウェルをELISPOTプレートに移します。
3. プレートカバーでプレートを覆い、蒸発を防ぐためにシールします。
4. プレートを4°Cで一晩インキュベートします。

ブロック

5. 翌日、層流フードにELISPOTプレートを発見。プレートを滅菌ワイプに素早く反転させ、各ウェルから捕捉抗体溶液を除去します。
6. 次に、各ウェルに200μLの細胞培養培地を添加する。このステップは、アッセイ中に非特異的結合をブロックします。
7. プレートカバーを交換し、37°Cで2時間インキュベートします。

めっきと細胞の活性化

8. プレートがインキュベートされている間、細胞培養培地中に50ng/mL PMAおよび1μMイオノマイシンを含む2Xマイトゲン溶液を調出す。
9. 次いで、標的細胞懸濁液を2x10⁶細胞/mLのストック濃度に調出する。
10. インキュベーションが完了したら、層流フード内の無菌ワイプにプレートを素早く反転させ、各ウェルから細胞培養培地を取り除きます。
11. 次に、ストックセル懸濁液の2Xシリアル希釈を生成する。そうするには、まずELISPOTプレートの一番上の行のウェルに、準備された細胞懸濁液ストック溶液の200 μLを追加します。
12. 次に、細胞ストック溶液を含む行の下のプレートの次の5行にプレーン細胞培地の100 μLを加える。
13. その後、一番上の行から直下の行にセルラー懸濁液の100 μLをピペッティングして2Xシリアル希釈を行います。この溶液を上下にゆっくりとピペッティングして適切な混合を行い、セルの分配を均等にします。
14. 残りの 4 行に対してこのプロセスを繰り返します。
15. 6 行目はカルチャ メディアのみに残します。これは、実験的な制御として機能します。
16. 次に、準備されたマイトゲン溶液の100 μLをプレートの最初の5列の実験井戸に加える。制御ウェルと6列目に、マイトゲンを含まない細胞培養培養培養剤の100μLを添加する。
17. プレートカバーを交換し、プレートを37°C、5%CO₂をインキュベーターで20~48時間交換します。(注:20~24時間は通常、IL-2およびTNF-αを検出するのに十分ですが、IL-4およびIFN-γには48時間が最適です。

検出

一次抗体

18. アッセイ希釈剤中の2μg/mLの濃度に対する抗体を検出するバイオチン化抗サイトカインを調製する。
19. PBSで0.05%のTween-20を混合することにより、この時点で洗浄バッファーの20〜25 mLを調製します。
20. インキュベーションが完了したら、プレートのキャップを外し、シンクの上に素早く反転して、井戸からすべての液体を除去します。(注:この時点の後、プレートはもはや無菌状態に保つ必要はありません)。
21. 次いで、各ウェルに〜200μL洗浄バッファーを加えてプレートを洗浄する。この液体を素早く反転させ、シンクの上にプレートをフリックして排出します。合計 5 回の洗い流しの場合は、このプロセスを繰り返します。
22. 次に、希釈されたビオチン化抗サイトカイン検出抗体溶液を各ウェルに100μLを添加する。室温で2時間、または4°Cで一晩インキュベートします。

二次抗体

23. インキュベーションが完了したら、シンク上のプレートを反転してフリックして検出抗体を排出します。
24. 前と同様に、プレートを〜200μL洗浄バッファーで5回洗浄し、各洗浄の間に液体を排出する。
25. 次に、希釈されたストレプトアビジン-ワサビ酸ペルオキシダーゼ溶液を各ウェルに100μL添加する(アッセイ希釈剤で予め決定された最適濃度に希釈)。
26. プレートカバーを交換し、室温で37°Cで1.5~2時間インキュベートします。

基板

27. インキュベーション後、使用の15分以内に、まずメーカーの指示に従ってAEC基板溶液を活性化する。
28. 次に、井戸の中身を捨て、以前と同様に洗浄バッファーでプレートを5回洗浄します。
29. 次に、直ちに各ウェルに100μLのAEC基板溶液を添加する。
30. スポットの発達を監視しながら、室温でプレートを10~20分間インキュベートします。
31. プレートを水ですすいで、流しの上でプレートをフリックして反応を止めます。
32. ペーパータオルにプレートをブロットし、プレートが一晩または完全に乾燥するまで乾燥させます。プレートの下のプラスチックトレイを取り外すと、乾燥が容易になります。

3. データ取得・分析

1. 乾燥後、スポットは自動プレートリーダーでカウントする準備ができています。ここでは、CTL免疫スポットリーダーが使用されるが、このプロトコルは、任意のリーダーに適合させることができる。
2. まず楽器の電源を入れ、次にコンピュータの電源を入れます。次に、CTLプログラムを開き、「スキャンカウント」をクリックします。
3. トレイを「イジェクト」押してマシンから伸ばします。次に、プラスチック製のアダプターを取り外し、ELISPOTプレートとアダプターの行「A」を揃えます。
4. 保存するファイル名と場所を選択し、プレートをトレイにロードします。
5. 次に、ソフトウェアの「ロード」をクリックし、マシンの側面にあるドアを閉じます。
6. 「カウント後開始」を押します。ファイルが保存されていることを確認し、品質管理「QC」ソフトウェアを開いてデータを分析し、スポット数をカウントします。

ノート：

1. 細胞の最小数は、予備実験で決定する必要があります。最適なスポット数は~50/ウェルです。読み込まれるセルが多すぎると、個別のスポットを検出するのが難しくなります。さらに、細胞は重なり合い、膜上に単層を形成しない可能性があるため、検出のレベルが低下する可能性があります。
2. 実験を最適化する際には、標的タンパク質の期待発現レベルを考慮する。発現が低いほど、ウェルあたりに必要なセル数が多くなります。
3. ELISAとは異なり、プレートウォッシャーを使用するよりも、プレートを手洗いする方が良いです。ELISPOTプレートはより繊細であり、PVDF膜の穿刺を避ける必要があります。
4. スポットが汚れる可能性があるため、インキュベーション期間中のプレートの動きを制限する必要があります。
5. 直接光にさらされるとスポットがフェードするので、プレートは暗闇の中に保管する必要があります。

このELISPOTアッセイでは、野生型および腫瘍性マウス由来の脾臓白血病をIFN-γについて分析した。図2は、アッセイ結果の視覚画像を示す。緑色の数字は、ウェルあたりのスポット数を示します(TNTCは「数えるには数えきれない」ことを示します)。細胞濃度が低下するとスポット数が減少します。

図2A:腫瘍を有するマウスにおける免疫応答の減少この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

通常、ELISPOTデータは、めっきされたセル数あたりのスポット数として表示されます。図 2 B では、スポット数が棒グラフに表示され、それぞれのセルラー濃度が X 軸に表示されます。グラフ作成のために、150 はスポットの最大数を示すために使用されました。腫瘍を有する動物におけるマウス脾臓白血病産生IFN-γの数は、野生型のものよりも低い。

図2B:腫瘍を有するマウスにおける免疫応答の減少脾細胞は対照C57BL/6(野生型)および腫瘍性マウスから採取し、PMA/イオノマイシンで48時間刺激した。ELISPOTアッセイは、IFN-γ産生脾臓白血病の数を定量するために使用された。(A) データの視覚的および (B) グラフィカルな表現。TNTC はカウントする数が多すぎることを示します。グラフ作成のために、150 はスポットの最大数を示すために使用されました。緑色の数字は、ウェルごとにカウントされるスポットの数を示します。赤い数字は、どのスポットがセルで、どのスポットが破片、アーティファクト、またはエッジ効果であるかを判断するために使用された参照ウェルを示し、解析から除外する必要があります。

ELISPOTアッセイは、特定の解体を分泌する細胞の数を決定することによって、免疫細胞の活性化を評価することを可能にする。スポットの大きさと強度は、各細胞によって生成される分析量に関する情報を提供します。上記のプロトコルは、単一のサイトカインの検出を詳細に説明した。しかし、最近の開発は、このアッセイの有用性を高めています。現在、ウェル内の複数の解素を検出するために蛍光検出染料を使用することができます。これにより、一方または両方の解体を分泌するセルの異なる亜集団の検出が可能です。

1. Czerkinsky, C. C., Nilsson, L. A., Nygren, H., Ouchterlony, O., & Tarkowski, A. A solid-phase enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay for enumeration of specific antibody-secreting cells. Journal of Immunological Methods, 65 (1), 109-121(1983).
2. Wahid, R., Simon, J. K., Picking, W. L., Kotloff, K. L., Levine, M. M., & Sztein, M. B. Shigella antigen-specific B memory cells are associated with decreased disease severity in subjects challenged with wild-type Shigella flexneri 2a. Clinical Immunology, 148 (1), 35-43 (2013).
3. Roberts, T. J., Lin, Y., Spence, P. M., Van Kaer, L., & Brutkiewicz, R. R. CD1d1-dependent control of the magnitude of an acute antiviral immune response. The Journal of Immunology, 172, 3454-3461 (2004).