マクロファージ-腫瘍スフェロイド共浸潤アッセイ

ここでは、3次元(3D)コラーゲンIマトリックス中の初代ヒト単球由来マクロファージと腫瘍スフェロイドとの相互作用を調査するためのプロトコルを提示し、微小環境の可溶性および物理的特性が細胞浸潤に与える影響を比較する可能性を示します。

免疫細胞とがん細胞の相互作用、およびそれぞれの転移への影響は、がん研究の重要な側面を表しています。これまでのところ、in vivoの状況をin vitroで近似できるプロトコルはごくわずかです。ここでは、三次元(3D)コラーゲンIマトリックスに埋め込まれたH1299非小細胞肺がん細胞の腫瘍スフェロイドを使用して、ヒトマクロファージががん細胞の浸潤性に及ぼす影響を観察するための新しいアプローチを紹介します。この共培養セットアップでは、マクロファージの低分子干渉RNA(siRNA)に基づく調節因子の枯渇が、腫瘍スフェロイドからのがん細胞の3D浸潤に及ぼす影響を、対照と比較してテストしました。この方法により、スフェロイド領域や浸潤するがん細胞の数など、さまざまなパラメータを決定できるため、がん細胞の浸潤の違いを検出できます。この記事では、それぞれのセットアップを紹介し、その後の分析、およびこの方法の利点と潜在的な落とし穴について説明します。

マクロファージは自然免疫系の主要な部分であり、感染や損傷後の細胞残骸の除去など、多くの病的状態における防御の最前線を表しています¹。過去数十年間、免疫細胞ががんの進行に与える影響は、多くの研究の側面でした。したがって、マクロファージは原発腫瘍と会合し、腫瘍関連マクロファージ(^{TAM)になること}で転移を促進することが示されています2。マクロファージは、がん細胞に曝露されると発現プロファイルを変化させることがあり、免疫系からの転移の回避を促進します³。また、がん細胞は、マクロファージが生成する細胞外マトリックス(ECM)の欠損を利用して原発腫瘍から逃れることができることや、その振る舞いが細胞外小胞(^EV)などの分泌因子の取り込みによっても操作されることが示されている^4,5。この物理的側面と化学的側面の相互作用には、免疫細胞が腫瘍の広がりと周囲の微小環境に与える影響を特徴付ける新しい方法の開発が必要です。

in vivo⁶の転移の状況における免疫細胞の挙動を研究するために、さまざまなアプローチが開発されてきました。ただし、動物を含むすべての実験については、動物実験の免許と動物施設が必要です。これらのアプローチには、すでに多くの開発と準備が必要です。さらに、特に生細胞イメージングに関しては、ほとんどの顕微鏡セットアップですべての標本にアクセスできるわけではないため、分析はしばしば複雑になります。科学と社会が犠牲になる動物の数を減らすための動物を使用しない研究を目指しているため、適格なin vitro条件で最初に仮説を検証する新しい方法の開発も必要かつタイムリーです。

最近の論文⁷では、腫瘍スフェロイドからがん細胞に浸潤する際の浸潤性に対する初代ヒトマクロファージの影響を調査しました。この目的のために、コラーゲンIベースのマクロファージ-腫瘍スフェロイド共浸潤アッセイを確立しました。これに関連して、マクロファージにおける膜型1型マトリックスメタロプロテイナーゼ(MT1-MMP)の高速リサイクル経路の役割を解明することを目指しました。MT1-MMPリサイクルの主要な推進力として特定した超プロセシブキネシンKIF16Bが枯渇したマクロファージと、固体スフェロイド由来のH1299-緑色蛍光タンパク質(GFP)細胞の侵襲性への影響を試験しました。KIF16Bで枯渇したマクロファージは、H1299細胞自体は未処理であるのに対し、その表面では膜結合型MT1-MMPのレベルが低下しています。

私たちの知る限り、マクロファージ-腫瘍-スフェロイドの共浸潤の完全なイメージングと分析を可能にする同様の方法は記載されていません。最近の論文⁷ では、スフェロイドから離れた個々の移動細胞の解析に焦点を当てましたが、このアッセイでは、侵入鎖の数、がん細胞とマクロファージの相互作用に関与するタンパク質、コラーゲンIの分解量、スフェロイドの周囲長などの他の特性など、さらに複数の調査が可能です。

このプロトコルには、ドナーの血液サンプルに由来する一次ヒトマクロファージの使用が含まれます。ハンブルク・エッペンドルフ大学医療センターの倫理ガイドラインによると、血液サンプルが採取され、ドナーに報酬が支払われました。サンプルのさらなる処理は、所定の安全ガイドラインに従って行いました(例:未試験サンプルの処理)。この研究における初代ヒトマクロファージの研究は、ドイツのÄrztekammer Hamburgによって異論の余地がないと判断されました。

1. スキャフォールドフリーアプローチによるH1299腫瘍スフェロイドの作製(3日前)

1. がん細胞培地(ダルベッコ改変ワシ培地[DMEM]+1%ペニシリン-ストレプトマイシン[ペン連鎖球菌]+10%ウシ胎児血清[FBS]+0.1 mM非必須アミノ酸+2 mM L-グルタミン)を含む5% CO₂ in 25 cm² 細胞培養フラスコ( 材料表を参照)を備えた37°Cインキュベーターでがん細胞を培養します80%の合流点まで。
2. 細胞をダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)で一度洗浄し、トリプシン-エチレンジアミン四酢酸(EDTA)(0.25%、フェノールレッド)1mLを2分間加えて細胞を剥離します。2 mLのがん細胞培地を添加して酵素反応を停止し、光学顕微鏡で剥離を確認します。
   注:がん細胞が分離され、がん細胞クラスターが存在しないことが重要です。
3. 細胞懸濁液を15 mLの反応チューブに移し、245 x g で5分間遠心分離します。その後、ピペッティングまたはポンプを使用してトリプシン溶液を除去し、続いて5mLのDPBSを加えてペレットを洗浄し、同じ条件下で再度遠心分離します。
4. ペレットを5 mLのがん細胞培地に再懸濁し、ノイバウアーチャンバーなどで細胞をカウントします。8,000個のH1299-GFP細胞を96ウェル超低接着プレート( 材料表を参照)に移し、最終容量25 μLのがん細胞培地に入れます。
5. チャンバーをインキュベーター内で37°C、5%_CO2で3日間インキュベートします。顕微鏡下でスフェロイドの均一性を確認します。密度の低いスフェロイドや、個々のがん細胞が付着していないスフェロイドは、さらなる実験のために考慮しないでください。

2. ドナー血液サンプルからのヒト初代マクロファージの調製

1. ドナーの血液サンプルをすぐに細胞単離に使用しない場合は、振とうしながら4°Cで保存してください。
2. 輸血バッグから20mLの血液を50mLの反応チューブに移します。
3. 続いて、新しい50 mLチューブを調製し、15 mLのリンパ球分離培地(LSM)を追加します。
4. 20 mLの血液を混合せずに各LSM含有チューブに慎重に加え、450 x g で40分間、4°Cで遠心分離します。
5. その間に、新しい50 mLチューブを準備し、10 mLの冷たいロズウェルパークメモリアルインスティテュート(RPMI)-1640培地を追加します。
6. 遠心分離後、血液含有チューブ内の高密度の白色相(「バフィーコート」)を調製したRPMI含有チューブに移し、冷たRPMIで容量を50mLに加算します。
7. 懸濁液を450 x g で4°Cで10分間遠心分離し、上清を捨てます。
8. 細胞を10 mLの冷RPMIに再懸濁します。
9. 混合物を再び450 x g で4°Cで10分間遠心分離し、上清を廃棄し、ペレットを50 mLのRPMIに再懸濁します。
10. サンプルを再び 450 x g で 4 °C で 10 分間遠心分離し、上清を廃棄し、細胞ペレットを 1.5 mL の冷単球バッファー (0.5% ヒト血清アルブミン + 25 mL の DPBS に 5 mM EDTA) に再懸濁します。
11. 細胞懸濁液を氷上に置いて、250 μLの抗CD14マイクロビーズを加え、氷上で15分間インキュベートします。
12. 磁気セパレーターラックにフィルターを添加して分離カラムを調製し、平衡化のために900 μLの単球バッファーを添加します。
13. セル懸濁液をフィルターに注ぎ、重力によって廃棄物チューブに流し込みます。
14. 磁気ビーズに結合した細胞を含むカラムを、1 mLの単球緩衝液を加えて洗浄します。
15. 20 mL RPMIを含む新しい50 mLチューブを準備し、カラムの下の廃液チューブを交換します。
16. カラムに3mLの単球バッファーを加え、マグネティックラックから取り出し、スタンプを取り付けます。
17. 調製した50mLチューブに細胞を押し込み、RPMIで最大30mLの容量まで充填します。
18. 光学顕微鏡で細胞をカウントし(例えば、ノイバウアーカウントチャンバーを使用)、RPMIを2 x 10⁶ 細胞/mLに添加して細胞数を調整します。
19. 1 mLの細胞懸濁液を6ウェルチャンバーの各ウェルに播種し、プレートを37°Cおよび5%CO₂で2〜4時間インキュベートします。
20. 細胞が適切に接着したかどうかを確認し、RPMIを1.5 mLのモノメディウム(RPMIで20%ヒト血清+ 1%ペン連鎖球菌)に交換します。
21. インキュベーションの24時間後に培地を交換してください。これらの条件下では、単球は6日以内にマクロファージに分化します。

3. マクロファージの調製

1. 実験当日は、個々の培養条件に適した量のアキュターゼでマクロファージを分離します。例えば、細胞を6ウェルディッシュに播種する場合は、500 μLのアキュターゼを使用します。溶液中で細胞を約40分間インキュベートし、2mLのDPBSで1回洗浄し、ノイバウアーチャンバーでカウントします。
2. 1つのスフェロイドについて、40 μLのコラーゲンIミックス(2.5 mg/mLラットテールコラーゲンI)で必要な数のマクロファージを希釈し、反応チューブをまもなくボルテックスして混合します。実施された実験では、200,000細胞/ mLが癌細胞の浸潤に検出可能な違いを示しました。コラーゲン-細胞ミックスは、室温(RT)で急速に重合し始めるため、氷の上に置いておきます。

4. 共侵襲アッセイのセットアップ

注:イメージングチャンバーのフォーマット、分析の目的、またはそれぞれのイメージング設定によっては、腫瘍スフェロイドを超低接着プレートから移し、コラーゲンと培地の値を適合させる必要がある場合があります。次の手順では、15ウェルμスライドの1つのサンプルのセットアップについて説明します。

1. まず、300 μLのDPBSを加えてスフェロイドを洗浄します。1 mLの青色ピペットチップの先端を切断し、DPBSでスフェロイドを巻き取ります。スフェロイドの吸引が先端に落ち着いた後、ピペットをイメージングチャンバーの底部に短く押し込み、表面張力によって腫瘍スフェロイドを転写します。
   注:未加工の先端部での摩擦は、回転楕円体の完全性を乱す可能性があることに注意することが重要です。
2. スフェロイドで転写した残留DPBSをピペッティングにより可能な限り除去します。
3. H1299-GFPスフェロイドを含むイメージングチャンバーに、40 μLのコラーゲンI/マクロファージミックス(ステップ3.4を参照)を迅速に加えます。
4. プレートをセルインキュベーターに移し、湿潤条件下でプレートを37°Cおよび5%CO₂ で30分間インキュベートし、コラーゲンミックスを完全に重合させます。
5. 重合後、各ウェルに25 μLのがん細胞培地を慎重に加え、前述の条件下でプレートをインキュベーター内で3日間インキュベートします。必要に応じて、レーザー走査型顕微鏡で目的の時点でライブサンプルをイメージングします。

5. 追加の固定と染色

1. 免疫蛍光染色を行うには、マクロファージとH1299-GFPスフェロイドをコラーゲンIマトリックス内に固定します。まず、マトリックスに触れずにポンプで各サンプルから上清を慎重に取り除きます。
   注:サンプルの破壊を避けるために、上清はポンプを使用せずに手動ピペッティングによって除去することもできます。
2. DPBS中の3.7%ホルムアルデヒドを50 μLずつ各ウェルに加え、サンプルを氷上で5分間インキュベートします。その後、固定液を取り出し、再度50μLの新鮮な固定液を加えます。このステップは、井戸内でより均一なホルムアルデヒドレベルを達成するために重要です。サンプルを4°Cで一晩インキュベートします。
   注:混合するコラーゲンの量によっては、インキュベーション時間が数時間に及ぶ場合があります。
3. 翌日に固定液を取り外し、イメージングチャンバーの容積に応じてDPBSの少なくとも2倍を繰り返し除去してサンプルを洗浄します。それらを氷上で5分間短時間インキュベートしてから、ピペッティングでDPBSを取り出します。これで、サンプルを染色する準備が整いました。
4. 4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)(核を染色するために1 mg/mL)とファロイジン568(F-アクチンを染色するため)の1:100混合物をDPBSに少なくとも30分間加えてサンプルを染色し、イメージングする前にDPBSで2回洗浄します。

6.腫瘍増殖のさまざまなパラメータのイメージングと分析

注:次の手順は、固定生細胞イメージングサンプルのいずれかに対して実行できます。

1. 腫瘍スフェロイドの観察には、スフェロイドの約下3分の1のZスタックをイメージングできる10倍対物レンズを備えた倒立レーザー走査型顕微鏡を使用します。
   注:サンプルの厚さにより、2光子顕微鏡も有利な場合があります。個々の細胞を最適に同定するためには、より高いレーザー出力と露光時間が必要になる場合があります。
2. 取得後、ImageJソフトウェア(フィジー)であるフィジーを使用してz投影でスタックを結合します。さらに、H1299-GFP信号の結果チャネルを自動閾値(Huang auto-thresholdなど)を適用して処理し、背景の量と信号強度に応じて画像をノイズ除去することにより残留ノイズを除去します。
3. フィジーを使用してスフェロイドパラメータを測定します。
   1. Area(面積): Wand ツールで回転楕円体のサイズを測定します。
   2. 周囲長: 周囲を 測定設定に含めます。
   3. 直径: フェレットの直径 を測定設定に含めます。
   4. 真円度: 形状記述子 を測定設定に含めます。
4. フィジーを使用して個々のがん細胞パラメータを測定します。
   1. 侵入セルの数を測定します。
      1. ワンドツールで中央の回転楕円体を選択し、信号を削除します。これにより、スフェロイドと、スフェロイドにまだ結合している細胞のすべての関連シグナルが解析から削除されます。
      2. その後、 粒子の解析 ツールを使用するか、すべての残留個々の信号を定量化します。
         注:結果は、浸潤するがん細胞の数になります。さらに、結果は、がん細胞がカバーする代表的な領域を示し、領域のサイズに応じて、集団浸潤または単一細胞浸潤と解釈することもできます。浸潤するがん細胞の数をさらに検証するために、分析した粒子のマスクをDAPIチャネルの上に置き、核をカウントすることができます。
5. さらに、GraphPad PrismやMicrosoft Excelなどの統計プログラムを使用して結果を評価します。
   注:このプロトコルは、堅牢で柔軟性があることが示されています。私たちの研究室では、ドナーのばらつきを説明するために、常に少なくとも3人のドナーからの一次ヒトマクロファージで50回以上使用されています。現在の形では、プロトコルは90-95%の成功率につながることが示されています。ただし、セットアップが複雑であるため、すべてのスフェロイドに対するマクロファージの相互作用は個別であるため、結果が異なる可能性もあります。したがって、5つのスフェロイドで実験を少なくとも3回行うと、統計的に有意な結果が得られることが示唆されます。

図1は、コラーゲンIマトリックス中でのインキュベーションのそれぞれの日に画像化されたH1299-GFPスフェロイドを示しています。0日目に撮影されたそれぞれの明視野画像も、スフェロイドと共培養された主要なヒトマクロファージを示しています。実験3日目に記録された代表的な画像は、処理後に拡大されます。侵入細胞の数、集団侵入の場所、スフェロイドの境界など、分析可能なさまざまなパラメーターが示されています。含まれている表は、この画像から得られた結果を示しています。検出された信号の数は、視覚的な印象と一致します。中央のスフェロイドの破壊は見られず、スフェロイドの破片に由来する細胞ではなく、実際の個々のがん細胞の浸潤を示しています。さまざまなスフェロイドと条件の結果は、統計分析によって比較できるようになりました。

図1:代表的な結果( 上段)コラーゲンIマトリックス中でのインキュベーションの0日目、1日目、2日目、3日目にH1299-GFPスフェロイドを画像化。(左中段)共培養された初代ヒトマクロファージを示すスフェロイドの明視野画像。(中央右パネル)3日目に取得した代表的な画像を処理後に拡大し、分析可能なさまざまなパラメーターを示しています(回転楕円体の周囲を赤で表示、視覚化のために手動でトレースしています)。(底面パネル)右中央パネルの画像から得られた結果。注:がん細胞の挙動を解明するためにGFPチャネルのみが記録されているため、マクロファージは見えません。スケールバー:100μmこの 図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

がん細胞の浸潤は、マクロファージのような免疫細胞への同時侵入という文脈で、依然として重要な研究が進んでいないトピックです。集団的および個々のがん細胞の浸潤は、転移中の重要なプロセスであり、さまざまな臓器の蔓延の多様性により、がん患者の生存率を低下させることが示されています^8,9。In vivo 研究は複雑で、動物飼育施設にアクセスできる研究室に限定されています。また、生体内の条件を制御したり、個々の側面を特異的に操作したりすることも困難です。したがって、研究の最前線で基本的な質問に答えるためには、よりアクセスしやすいシステムの必要性が依然として不可欠です。

今回紹介した方法により、i)免疫細胞、ii)がん細胞の挙動、iii)固体スフェロイドの増殖と発達、iv)周囲の腫瘍微小環境(TME)の細胞がECM成分に及ぼす影響をさらに解析する方法を開発しました。これは、固体スフェロイドからの個々のがん細胞の浸潤性に対する修飾マクロファージ(siRNA処理によって特定の調節因子に対して枯渇するなど)の影響を比較するために使用できます。TMEの物理的再配列または分泌因子が観察されたがん細胞の挙動の主な原因を表しているかどうかは現在のところ不明であり、より詳細に分析する必要があります。

さらに、がん細胞自体も、例えばsiRNA処理や特定の調節因子のノックアウトによって操作することもできる。さらに、同定された細胞プロファイル内のカウントされた核の数を比較することで、浸潤するがん細胞をより正確に測定できるように、分析を改善することができます。

このアッセイを使用して、TMEのマクロファージが腫瘍細胞の浸潤に及ぼす影響を決定しました。しかしながら、腫瘍細胞は、おそらく培地内の分泌因子を通じて、マクロファージの活性に影響を与える可能性が高いことにも留意すべきである。したがって、それぞれの抗体を用いた免疫蛍光染色により、分極状態の変化(M1対M2)など、マクロファージの変化を同定することも意義深い試みとなるでしょう。過去には、単層で増殖した細胞と3D環境で培養した細胞との比較では、それらの発現プロファイルに大きな違いが示されていました¹⁰。

さらに、マクロファージ亜集団の蛍光活性化細胞選別(FACS)とそれらを実験手順に組み込むことは有益である可能性があります。最後に、マクロファージががん細胞や腫瘍スフェロイド表面と相互作用する接触領域をより詳細にイメージングすることで、3D浸潤や相互作用に関連するさらなるメカニズムの特定につながる可能性があります。

完全に制御できない注目すべきは、コラーゲンミックスの添加後のウェルの中央でのスフェロイドの正確な位置決めです。スフェロイドの下のコラーゲンの量は、特に調節が困難です。ここでは、スフェロイドの正確な位置決めを可能にする他の方法、例えば、より高いサンプル数を有するアガロース型^の上に11が確立されている。しかし、サイトカインの放出は一般的なメカニズムであるため、このマルチスフェロイドアッセイ内のすべてのスフェロイドは分泌因子にさらされており、1つのスフェロイドに作用する免疫細胞の数を制御することは困難です。

このプロトコルの基本的な制限の1つは、がん細胞株が均一なスフェロイドを形成する能力であり、したがって細胞株のサブセットにのみ適用できることです。例えば、MeWoメラノーマ細胞は不均一なシート状の3D構造を形成しますが、均一なスフェロイドは形成されません。

また、このアッセイは、ECM材料、細胞数、または上清にサイトカインなどの特定の因子を添加することにより、その特徴の多くを変更できるため、非常に適応性が高いことにも注意する必要があります。したがって、がん細胞と免疫細胞の相互作用に関する初期の in vitro 研究に非常に適しており、現在取り組んでいる特定の研究課題に合わせて調整することができます。

著者らは、競合する利益は存在しないと宣言します。

著者らは、優れた技術サポートと細胞培養を提供してくださったAndrea Mordhorst氏と、継続的なサポートを提供してくださったMartin Aepfelbacher氏に感謝します。SL研究室でのマクロファージ浸潤に関する研究は、Deutsche Forschungsgemeinschaft(CRC877/B13;LI925/13-1)。