Ensayo de coinvasión de esferoides macrófagos y tumores

Aquí, presentamos un protocolo para investigar la interacción de macrófagos primarios derivados de monocitos humanos con un esferoide tumoral en una matriz tridimensional (3D) de colágeno I, con la posibilidad de comparar el impacto de las propiedades solubles y físicas del microambiente en la invasión celular.

La interacción de las células inmunitarias y cancerosas y su respectivo impacto en la metástasis representa un aspecto importante de la investigación del cáncer. Hasta el momento, solo se dispone de unos pocos protocolos que permiten una aproximación in vitro de la situación in vivo . Aquí, presentamos un enfoque novedoso para observar el impacto de los macrófagos humanos en la invasividad de las células cancerosas, utilizando esferoides tumorales de células de carcinoma de pulmón de células no pequeñas H1299 incrustadas en una matriz tridimensional (3D) de colágeno I. Con esta configuración de cocultivo, probamos el impacto de la depleción de los factores reguladores en los macrófagos basada en ARN interferente pequeño (siRNA) en la invasión 3D de las células cancerosas desde el esferoide tumoral en comparación con los controles. Este método permite determinar diferentes parámetros, como el área esferoide o el número de células cancerosas invasoras, y así, detectar diferencias en la invasión de células cancerosas. En este artículo, presentamos la configuración respectiva, discutimos el análisis posterior, así como las ventajas y posibles trampas de este método.

Los macrófagos son una parte importante del sistema inmunitario innato y representan la primera línea de defensa en muchas condiciones patológicas, como las infecciones o la eliminación de restos celulares después^{de lesiones.} Durante las últimas décadas, el impacto de las células inmunitarias en la progresión del cáncer ha sido un aspecto de muchos estudios. En este sentido, se ha demostrado que los macrófagos pueden facilitar la metástasis al asociarse con tumores primarios y convertirse en macrófagos asociados al tumor (TAM)². Los macrófagos pueden cambiar su perfil de expresión cuando se exponen a las células cancerosas, favoreciendo el escape de metástasis del sistema inmune³. Además, se ha demostrado que las células cancerosas pueden utilizar defectos en la matriz extracelular (MEC) generados por los macrófagos para escapar del tumor primario y que su comportamiento también es manipulado por la absorción de factores secretados, incluyendo vesículas extracelulares (VE)^4,5. Esta interacción de aspectos físicos y químicos requiere el desarrollo de nuevos métodos para caracterizar el impacto de las células inmunitarias en la propagación tumoral y el microambiente circundante.

Se han desarrollado diferentes enfoques para estudiar el comportamiento de las células inmunitarias en el contexto de la metástasis in vivo⁶. Sin embargo, como para todos los experimentos, incluidos los animales, se necesita una licencia para la experimentación con animales y un animalario; Estos enfoques ya exigen mucho desarrollo y preparación. Además, el análisis suele ser complicado, especialmente en lo que respecta a la obtención de imágenes de células vivas, ya que no todas las muestras son accesibles para la mayoría de las configuraciones microscópicas. El desarrollo de nuevos métodos para probar hipótesis primero en condiciones in vitro calificadas también es necesario y oportuno, ya que la ciencia y la sociedad apuntan a la investigación sin animales para reducir el número de animales sacrificados.

En una publicación reciente⁷, investigamos el impacto de los macrófagos humanos primarios en la invasividad de las células cancerosas invasoras de un esferoide tumoral. Para ello, establecimos un ensayo de coinvasión de esferoides tumorales y macrófagos basados en colágeno I. En este contexto, nos propusimos dilucidar el papel de las vías de reciclaje rápido de la metaloproteinasa de matriz de membrana tipo 1 (MT1-MMP) en macrófagos. Probamos macrófagos que estaban agotados para la quinesina súper procesiva KIF16B, que identificamos como un importante impulsor del reciclaje de MT1-MMP, y su impacto en las capacidades invasivas de las células H1299-Proteína Verde Fluorescente (GFP) de un esferoide sólido. Los macrófagos empobrecidos por KIF16B muestran niveles reducidos de MT1-MMP unido a la membrana en su superficie, mientras que las células H1299 no fueron tratadas.

Hasta donde sabemos, no se ha descrito ningún método similar que permita obtener imágenes y análisis completos de la coinvasión macrófago-tumor-esferoide. Aunque en nuestra reciente publicación⁷ nos centramos en el análisis de las células que migran individualmente y están lejos del esferoide, el ensayo permite múltiples investigaciones adicionales, como el número de hebras invasoras, las proteínas involucradas en la interacción entre las células cancerosas y los macrófagos, la cantidad de degradación del colágeno I u otras propiedades del esferoide como la longitud de su perímetro.

Este protocolo implica el uso de macrófagos humanos primarios derivados de muestras de sangre de donantes. De acuerdo con las directrices éticas del Centro Médico Universitario de Hamburgo-Eppendorf, se recogieron muestras de sangre y se indemnizó a los donantes. El procesamiento posterior de las muestras se llevó a cabo siguiendo las pautas de seguridad dadas (por ejemplo, tratamiento de muestras no analizadas). El trabajo con macrófagos humanos primarios en este estudio ha sido considerado inobjetable por Ärztekammer Hamburg, Alemania.

1. Generación de esferoides tumorales H1299 en un enfoque sin andamio (3 días de anticipación)

1. Cultivar células cancerosas en una incubadora a 37 °C con 5% de CO₂ en matraces de cultivo celular de 25^cm2 (ver Tabla de Materiales) con medio de células cancerosas (medio de águilas modificado de Dulbecco [DMEM] + 1% de penicilina-estreptomicina [pen-strep] + 10% de suero fetal bovino [FBS] + 0,1 mM de aminoácidos no esenciales + 2 mM de L-glutamina) hasta una confluencia del 80%.
2. Lavar las células una vez con solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco y separarlas añadiendo 1 mL de ácido tripsina-etilendiaminotetraacético (EDTA) (0,25%, fenol-rojo) durante 2 min. Detenga la reacción enzimática agregando 2 mL de medio de células cancerosas y verifique el desprendimiento bajo un microscopio óptico.
   NOTA: Es importante que las células cancerosas estén separadas y que no haya grupos de células cancerosas presentes.
3. Transfiera la suspensión celular a un tubo de reacción de 15 mL y centrifugue a 245 x g durante 5 min. A continuación, retire la solución de tripsina mediante pipeteo o con una bomba, lave el pellet posteriormente añadiendo 5 mL de DPBS y vuelva a centrifugarlos en las mismas condiciones.
4. Vuelva a suspender el pellet en 5 mL de medio para células cancerosas y cuente las células, por ejemplo, con una cámara de Neubauer. Transfiera 8.000 células H1299-GFP a una placa de adhesión ultrabaja de 96 pocillos (consulte la tabla de materiales) en un volumen final de 25 μL de medio de células cancerosas.
5. Incubar la cámara durante 3 días en la incubadora a 37 °C y 5% de_CO2. Revise los esferoides bajo el microscopio para ver si están uniformados. No considere esferoides con una densidad más baja o células cancerosas individuales no adheridas para experimentos posteriores.

2. Preparación de macrófagos humanos primarios a partir de muestras de sangre de donantes

1. Si las muestras de sangre del donante no se utilizan inmediatamente para el aislamiento celular, almacenarlas a 4 °C, agitándolas.
2. Transfiera 20 mL de sangre de una bolsa de transfusión a un tubo de reacción de 50 mL.
3. Posteriormente, prepare un nuevo tubo de 50 mL y agregue 15 mL de medio de separación de linfocitos (LSM).
4. Añadir con cuidado los 20 ml de sangre a cada tubo que contenga LSM sin mezclar y centrifugarlo a 450 x g durante 30 min a 4 °C.
5. Mientras tanto, prepare un nuevo tubo de 50 mL y agregue 10 mL de medio frío Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640.
6. Después de la centrifugación, transfiera la fase densa y blanca ("capa leucocitaria") dentro del tubo que contiene sangre al tubo que contiene RPMI preparado y sume el volumen a 50 ml con RPMI frío.
7. Centrifugar la suspensión a 450 x g durante 10 min a 4 °C y desechar el sobrenadante.
8. Resuspender las células en 10 mL de RPMI frío.
9. Centrifugar la mezcla de nuevo a 450 x g durante 10 min a 4 °C, desechar el sobrenadante y resuspender el pellet en 50 mL de RPMI.
10. Centrifugar la muestra de nuevo a 450 x g durante 10 min a 4 °C, desechar el sobrenadante y resuspender el pellet celular en 1,5 mL de tampón de monocitos frío (0,5% de albúmina sérica humana + 5 mM de EDTA en 25 mL de DPBS).
11. Coloque la suspensión celular en hielo, agregue 250 μL de microperlas anti-CD14 e incube durante 15 minutos en hielo.
12. Prepare una columna de separación mediante la adición de un filtro en un bastidor separador magnético y agregue 900 μL de tampón de monocitos para el equilibrio.
13. Vierta la suspensión de la celda en el filtro y deje que fluya a través de un tubo de desagüe por gravedad.
14. Lave la columna, que contiene las células unidas a las perlas magnéticas, añadiendo 1 ml de tampón de monocitos.
15. Prepare un tubo nuevo de 50 mL que contenga 20 mL de RPMI y reemplace el tubo de desagüe debajo de la columna.
16. Agregue 3 ml de tampón de monocitos a la columna, retírelo de la rejilla magnética y coloque el sello.
17. Presione las células en el tubo preparado de 50 mL y llénelo hasta 30 mL de volumen con RPMI.
18. Cuente las células (por ejemplo, utilizando una cámara de recuento de Neubauer) bajo un microscopio óptico y ajuste el número de células añadiendo RPMI a 2 x 10⁶ células/mL.
19. Siembre 1 mL de la suspensión celular en cada pocillo de una cámara de 6 pocillos e incube la placa durante 2-4 h a 37 °C y 5% de CO₂.
20. Compruebe si las células se adhirieron correctamente y sustituya el RPMI por monomedio de 1,5 mL (20% de suero humano + 1% de pen-estreptococo en RPMI).
21. Cambie el medio después de 24 h de incubación. En estas condiciones, los monocitos se diferencian en macrófagos en un plazo de 6 días.

3. Preparación de macrófagos

1. El día del experimento, separe los macrófagos con una cantidad adecuada de accutasa para las condiciones individuales de cultivo. Por ejemplo, use 500 μL de accutasa si las células se siembran en un plato de 6 pocillos. Incubar las células durante unos 40 minutos dentro de la solución, lavarlas una vez con 2 mL de DPBS y contarlas con una cámara de Neubauer.
2. Para un esferoide, diluir el número deseado de macrófagos en 40 μL de mezcla de colágeno I (2,5 mg/mL de colágeno de cola de rata I) y mezclarlos mediante un breve vórtice en el tubo de reacción. En los experimentos realizados, 200.000 células/mL han mostrado una diferencia detectable en la invasión de células cancerosas. Mantenga la mezcla de células de colágeno en hielo, ya que comenzará a polimerizarse rápidamente a temperatura ambiente (RT).

4. Configuración del ensayo de coinvasión

NOTA: Dependiendo del formato de la cámara de imagen, el propósito del análisis o la configuración de imagen respectiva, es posible que sea necesario transferir el esferoide tumoral desde la placa de adhesión ultra baja y adaptar los valores de colágeno y medios. En los siguientes pasos se describe la configuración de una muestra en un portaobjetos de μ de 15 pocillos.

1. En primer lugar, lave el esferoide añadiendo 300 μL de DPBS. Corte la punta de una pipeta azul de 1 mL y tome el esferoide con DPBS. Después de que la aspiración del esferoide se haya asentado en la punta, empuje brevemente la pipeta hasta el fondo de la cámara de imágenes para transferir el esferoide tumoral por tensión superficial.
   NOTA: Es importante tener en cuenta que la fricción en las puntas no modificadas puede perturbar la integridad del esferoide.
2. Elimine los DPBS residuales transferidos con el esferoide tanto como sea posible mediante pipeteo.
3. Añada rápidamente 40 μL de mezcla de colágeno I/macrófagos (ver paso 3.4) a la cámara de imagen que contiene el esferoide H1299-GFP.
4. Transfiera la placa a una incubadora de células e incube la placa durante 30 minutos a 37 °C y 5% de CO₂ en condiciones húmedas para polimerizar completamente la mezcla de colágeno.
5. Después de la polimerización, agregue cuidadosamente 25 μL de medio de células cancerosas a cada pocillo e incube la placa durante 3 días en la incubadora en las condiciones descritas anteriormente. Si es necesario, obtenga imágenes de la muestra viva con un microscopio de barrido láser en los puntos de tiempo deseados.

5. Fijación y tinción adicionales

1. Para realizar la tinción de inmunofluorescencia, fije los macrófagos y los esferoides H1299-GFP dentro de la matriz de colágeno I. Primero, retire con cuidado el sobrenadante de cada muestra con una bomba sin tocar la matriz.
   NOTA: Para evitar la destrucción de la muestra, el sobrenadante también se puede eliminar mediante pipeteo manual sin utilizar una bomba.
2. Añadir 50 μL de formaldehído al 3,7% en DPBS a cada pocillo e incubar las muestras durante 5 min en hielo. A continuación, retire la solución fijadora y vuelva a añadirle 50 μL de solución fijadora fresca. Este paso es importante para lograr un nivel de formaldehído más uniforme dentro del pozo. Incubar las muestras durante la noche a 4 °C.
   NOTA: Dependiendo de la cantidad de colágeno que mezcle, los tiempos de incubación pueden extenderse a varias horas.
3. Retire el fijador al día siguiente y lave las muestras mediante la extracción repetida de al menos dos veces DPBS dependiendo del volumen de la cámara de imagen. Intergélelos brevemente durante 5 minutos en hielo en un agitador antes de retirar el DPBS mediante pipeteo. Las muestras ya están listas para la tinción.
4. Teñir las muestras añadiendo una mezcla 1:100 de 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (1 mg/mL, para teñir los núcleos) y faloidina 568 (para teñir la F-actina) en DPBS durante al menos 30 min y lavarlas dos veces con DPBS antes de la toma de imágenes.

6. Imagen y análisis de diferentes parámetros de crecimiento tumoral

NOTA: Los siguientes pasos se pueden realizar para muestras de imágenes fijas de células vivas.

1. Para la observación del esferoide tumoral, utilice un microscopio de barrido láser invertido equipado con un objetivo 10x que permita obtener imágenes de una pila z de aproximadamente el tercio inferior del esferoide.
   NOTA: Debido al grosor de la muestra, un microscopio de 2 fotones también podría ser ventajoso. Para una identificación óptima de las células individuales, es posible que se necesite una mayor potencia láser y tiempo de exposición.
2. Después de la adquisición, combine las pilas por proyección z utilizando Fiji, que es el software ImageJ (Fiji). Además, procese el canal resultante de la señal H1299-GFP aplicando un umbral automático (por ejemplo, umbral automático Huang) y elimine el ruido residual eliminando las manchas de la imagen en función de la cantidad de fondo y la intensidad de la señal.
3. Mida los parámetros del esferoide utilizando Fiji.
   1. Área: Mida el tamaño del esferoide con la herramienta Varita .
   2. Perímetro: Incluya el perímetro en la configuración de medición.
   3. Diámetro: Incluya el diámetro de Feret en la configuración de medición.
   4. Circularidad: Incluya los descriptores de forma en la configuración de medición.
4. Mida los parámetros individuales de las células cancerosas utilizando Fiji.
   1. Mide el número de células invasoras.
      1. Elija el esferoide central con la herramienta Vara y elimine la señal. Esto eliminará el esferoide del análisis, así como todas las señales conectadas de las células, que aún están unidas al esferoide.
      2. A continuación, utilice la herramienta Analizar partícula o cuantifique todas las señales individuales residuales.
         NOTA: El resultado será el número de células cancerosas invasoras. Además, el resultado también podría mostrar el área representativa cubierta por las células cancerosas y ser interpretado como invasión colectiva o invasión unicelular, dependiendo del tamaño del área. Para validar aún más el número de células cancerosas invasoras, se podría colocar una máscara de las partículas analizadas sobre el canal DAPI y contar los núcleos.
5. Además, evalúe los resultados utilizando un programa estadístico como GraphPad Prism o Microsoft Excel.
   NOTA: Se ha demostrado que este protocolo es robusto y flexible. Se ha utilizado en nuestro laboratorio más de 50 veces, siempre con macrófagos humanos primarios de al menos 3 donantes, para tener en cuenta la variabilidad de los donantes. En su forma actual, se ha demostrado que el protocolo conduce a una tasa de éxito del 90-95%. Sin embargo, como la configuración es compleja, también pueden ser resultados variables, ya que la interacción de los macrófagos para cada esferoide es individual. Por lo tanto, se sugiere realizar el experimento al menos 3 veces con 5 esferoides para obtener un resultado estadísticamente significativo.

La Figura 1 muestra un esferoide H1299-GFP fotografiado en los respectivos días de incubación en una matriz de colágeno I. Una imagen de campo claro respectiva, tomada en el día 0, también muestra los macrófagos humanos primarios cocultivados con el esferoide. La imagen representativa registrada el día 3 del experimento se amplía después del procesamiento. Se indican diferentes parámetros que se pueden analizar, incluido el número de células invasoras, los sitios de invasión colectiva y el perímetro esferoide. La tabla incluida muestra los resultados obtenidos de esta imagen. El número de señales detectadas coincide con la impresión visual. No se observan alteraciones del esferoide central, lo que indica una invasión real de células cancerosas individuales en lugar de células derivadas de desechos esferoides. Los resultados de diferentes esferoides y condiciones ahora se pueden comparar a través del análisis estadístico.

Figura 1: Resultados representativos. (Panel superior) Imagen del esferoide H1299-GFP en el día 0, día 1, día 2 y día 3 de incubación en una matriz de colágeno I. (Panel central izquierdo) Una imagen de campo claro del esferoide que muestra los macrófagos humanos primarios cocultivados. (Panel central a la derecha) Una imagen representativa adquirida en el día 3 ampliada después del procesamiento, que muestra los diferentes parámetros que se pueden analizar (perímetro del esferoide en rojo; trazado manualmente para una mejor visualización). (Panel inferior) Los resultados obtenidos de la imagen en el panel central derecho. Nota: Los macrófagos no son visibles, ya que solo se registró el canal GFP para dilucidar el comportamiento de las células cancerosas. Barras de escala: 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La invasión de células cancerosas sigue siendo un tema importante pero poco estudiado en el contexto de las células inmunitarias coinvasoras como los macrófagos. La invasión colectiva e individual de células cancerosas son procesos críticos durante la metástasis y se ha demostrado que disminuyen la tasa de supervivencia de los pacientes con cáncer debido a la multiplicidad de infestaciones de diferentes órganos ^8,9. Los estudios in vivo son complejos y están restringidos a laboratorios con acceso a las instalaciones de alojamiento de animales. Además, también es difícil controlar las condiciones in vivo o manipular específicamente aspectos individuales. Por lo tanto, la necesidad de un sistema más accesible sigue siendo esencial para responder preguntas básicas en la primera línea de investigación.

Con el método presentado aquí, desarrollamos una forma en la que i) el comportamiento de las células inmunitarias y ii) las células cancerosas, iii) el crecimiento y desarrollo de un esferoide sólido, y iv) el impacto de las células en el microambiente tumoral circundante (TME) en los componentes de la MEC se puede analizar más a fondo. Se puede utilizar para comparar el impacto de los macrófagos modificados (por ejemplo, agotados para reguladores específicos por el tratamiento con siRNA) en la invasividad de las células cancerosas individuales de un esferoide sólido. Actualmente no está claro si el reordenamiento físico de la TME o los factores secretados representan la causa principal del comportamiento observado de las células cancerosas y es necesario analizarlo con más detalle.

Además, también las propias células cancerosas podrían ser manipuladas, por ejemplo, mediante tratamiento con siRNA o knockout de reguladores específicos. Además, el análisis se puede mejorar comparando el número de núcleos contados dentro del perfil celular identificado para permitir una determinación más precisa de las células cancerosas invasoras.

Hemos utilizado este ensayo para determinar el impacto de los macrófagos en el TME en la invasión de células tumorales. Sin embargo, también debe tenerse en cuenta que es probable que las células tumorales influyan en la actividad de los macrófagos, posiblemente a través de factores secretados dentro de los medios. Por lo tanto, también valdría la pena identificar los cambios en los macrófagos, como el estado de polarización alterado (M1 vs. M2) mediante la tinción de inmunofluorescencia utilizando los anticuerpos respectivos. En el pasado, la comparación entre las células que crecen en monocapas y las que se cultivan en un entorno 3D ha mostrado diferencias significativas en sus perfiles de expresión¹⁰.

Además, la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) de subpoblaciones de macrófagos y su integración en el procedimiento experimental podría ser instructiva. Por último, pero no menos importante, la obtención de imágenes más detalladas de las áreas de contacto donde los macrófagos interactúan con las células cancerosas o la superficie del esferoide tumoral podría conducir a la identificación de otros mecanismos relevantes para la invasión e interacción 3D.

Cabe destacar que no se puede controlar completamente es el posicionamiento preciso del esferoide en el centro del pocillo después de la adición de la mezcla de colágeno. La cantidad de colágeno debajo del esferoide es especialmente difícil de regular. Aquí, se han establecido otros métodos para permitir el posicionamiento preciso del esferoide, por ejemplo, en la parte superior de moldes de agarosa con un número de muestra más alto¹¹. Sin embargo, como la liberación de citocinas es un mecanismo común, todos los esferoides dentro de este ensayo multiesferoide están expuestos a factores secretados, y el número de células inmunitarias que actúan sobre un solo esferoide es difícil de controlar.

Una limitación básica de este protocolo es la capacidad de las líneas celulares cancerosas para formar esferoides uniformes, por lo que solo son aplicables a un subconjunto de líneas celulares. Por ejemplo, las células de melanoma MeWo forman estructuras 3D desiguales en forma de láminas, pero no esferoides uniformes.

También hay que tener en cuenta que el ensayo es altamente adaptable, ya que muchas de sus características pueden ser modificadas, como el material de la MEC, el número de células o añadiendo factores específicos como citoquinas al sobrenadante. Por lo tanto, debe ser muy adecuado para los estudios iniciales in vitro de la interacción entre las células cancerosas y las células inmunitarias y puede adaptarse a la pregunta de investigación específica que se aborda actualmente.

Los autores declaran que no existen intereses contrapuestos.

Los autores desean agradecer a Andrea Mordhorst por su excelente soporte técnico y cultivo celular y a Martin Aepfelbacher por su continuo apoyo. El trabajo sobre la invasión de macrófagos en el laboratorio de SL cuenta con el apoyo de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (CRC877/B13; LI925/13-1).