اختبار الغزو المشترك للبلاعم والورم الكروي

هنا ، نقدم بروتوكولا للتحقيق في تفاعل البلاعم البشرية الأولية المشتقة من الخلايا الوحيدة مع كروي الورم في مصفوفة الكولاجين I ثلاثية الأبعاد (3D) ، مع إمكانية مقارنة تأثير الخصائص القابلة للذوبان والفيزيائية للبيئة المكروية على غزو الخلايا.

يمثل تفاعل الخلايا المناعية والسرطانية وتأثير كل منها على ورم خبيث جانبا مهما من أبحاث السرطان. حتى الآن ، لا يتوفر سوى عدد قليل من البروتوكولات التي تسمح بتقريب في المختبر للحالة في الجسم الحي . هنا ، نقدم نهجا جديدا لمراقبة تأثير البلاعم البشرية على غزو الخلايا السرطانية ، باستخدام الكرويات السرطانية لخلايا سرطان الرئة ذات الخلايا غير الصغيرة H1299 المضمنة في مصفوفة الكولاجين I ثلاثية الأبعاد (3D). من خلال إعداد الزراعة المشتركة هذا ، اختبرنا تأثير استنفاد العوامل التنظيمية المستندة إلى الحمض النووي الريبي الصغير المتداخل (siRNA) في البلاعم على الغزو ثلاثي الأبعاد للخلايا السرطانية من كروي الورم مقارنة بالضوابط. تسمح هذه الطريقة بتحديد معلمات مختلفة ، مثل المنطقة الكروية أو عدد الخلايا السرطانية الغازية ، وبالتالي اكتشاف الاختلافات في غزو الخلايا السرطانية. في هذه المقالة ، نقدم الإعداد المعني ، ونناقش التحليل اللاحق ، بالإضافة إلى المزايا والمزالق المحتملة لهذه الطريقة.

تعد البلاعم جزءا رئيسيا من الجهاز المناعي الفطري وتمثل خط الدفاع الأول في العديد من الحالات المرضية ، مثل الالتهابات أو إزالة بقايا الخلايا بعد الإصابات¹. خلال العقود الماضية ، كان تأثير الخلايا المناعية على تطور السرطان جانبا من جوانب العديد من الدراسات. وفقا لذلك ، فقد ثبت أن البلاعم يمكن أن تسهل ورم خبيث من خلال الارتباط بالأورام الأولية وتصبح ضامة مرتبطة بالورم (TAMs)². يمكن للبلاعم تغيير ملف تعريف التعبير عند تعرضها للخلايا السرطانية ، مما يفضل هروب ورم خبيث من الجهاز المناعي³. بالإضافة إلى ذلك ، فقد ثبت أن الخلايا السرطانية يمكن أن تستخدم عيوبا في المصفوفة خارج الخلية (ECM) الناتجة عن البلاعم للهروب من الورم الأساسي وأن سلوكها يتم التلاعب به أيضا عن طريق امتصاص العوامل المفرزة ، بما في ذلك الحويصلات خارج الخلية (EVs)^4،5. يتطلب هذا التفاعل بين الجوانب الفيزيائية والكيميائية تطوير طرق جديدة لتوصيف تأثير الخلايا المناعية على انتشار الورم والبيئة المكروية المحيطة.

تم تطوير مناهج مختلفة لدراسة سلوك الخلايا المناعية في سياق ورم خبيث في الجسم الحي⁶. ومع ذلك ، كما هو الحال بالنسبة لجميع التجارب بما في ذلك ، هناك حاجة إلى ترخيص للتجارب على ومنشأة حيوانية. تتطلب هذه الأساليب بالفعل الكثير من التطوير والإعداد. علاوة على ذلك ، غالبا ما يكون التحليل معقدا ، خاصة فيما يتعلق بتصوير الخلايا الحية ، حيث لا يمكن الوصول إلى جميع العينات لمعظم الإعدادات المجهرية. يعد تطوير طرق جديدة لاختبار الفرضيات أولا في ظروف مؤهلة في المختبر أمرا ضروريا وفي الوقت المناسب ، حيث يهدف العلم والمجتمع إلى إجراء أبحاث خالية من لتقليل عدد المضحى.

في منشور حديث⁷ ، قمنا بالتحقيق في تأثير الضامة البشرية الأولية على غزو الخلايا السرطانية الغازية من الورم الكروي. لهذا الغرض ، أنشأنا مقايسة الغزو الكروي المشترك لورم البلاعم القائم على الكولاجين I. في هذا السياق ، هدفنا إلى توضيح دور مسارات إعادة التدوير السريعة للبروتين المعدني المصفوفة من النوع الغشائي 1 (MT1-MMP) في الضامة. اختبرنا البلاعم التي تم استنفادها من أجل كينيسين KIF16B فائق المعالجة ، والذي حددناه كمحرك رئيسي لإعادة تدوير MT1-MMP ، وتأثيرها على القدرات الغازية لخلايا البروتين الفلوري الأخضر H1299 (GFP) من كروي صلب. تظهر البلاعم المستنفدة KIF16B مستويات منخفضة من MT1-MMP المرتبطة بالغشاء على سطحها ، في حين أن خلايا H1299 نفسها لم تتم معالجتها.

على حد علمنا ، لم يتم وصف أي طريقة مماثلة تسمح بالتصوير والتحليل الكامل للغزو المشترك للبلاعم والورم والكروي. على الرغم من أننا ركزنا في منشورنا الأخير⁷ على تحليل الخلايا المهاجرة بشكل فردي بعيدا عن الكروية ، إلا أن الفحص يسمح بإجراء العديد من التحقيقات الإضافية مثل عدد الخيوط الغازية ، والبروتينات المشاركة في تفاعل الخلايا السرطانية والبلاعم ، وكمية تحلل الكولاجين الأول أو الخصائص الكروية الأخرى مثل طول محيطها.

يتضمن هذا البروتوكول استخدام البلاعم البشرية الأولية المشتقة من عينات دم المتبرعين. وفقا للإرشادات الأخلاقية للمركز الطبي الجامعي هامبورغ-إيبندورف ، تم جمع عينات الدم وتعويض المتبرعين. وأجريت معالجة إضافية للعينات وفقا لإرشادات السلامة المحددة (مثل معالجة العينات غير المختبرة). تم الحكم على العمل مع البلاعم البشرية الأولية في هذه الدراسة من قبل Ärztekammer Hamburg ، ألمانيا.

1. توليد الورم H1299 الكروي في نهج خال من السقالات (3 أيام مقدما)

1. قم بزراعة الخلايا السرطانية في حاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ في قوارير ثقافة خلية^{25 سم 2} (انظر جدول المواد) مع وسط الخلايا السرطانية (وسط النسور المعدلة من Dulbecco [DMEM] + 1٪ بنسلين ستربتومايسين [Pen-Strepet] + 10٪ مصل بقري للجنين [FBS] + 0.1 ملي مولار أحماض أمينو غير أساسية + 2 ملي مولار L-glutamine) حتى التقاء 80٪.
2. اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام محلول ملحي مخزن بالفوسفات (DPBS) من Dulbecco وافصلها عن طريق إضافة 1 مل من حمض التربسين - إيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA) (0.25٪ ، فينول أحمر) لمدة دقيقتين. أوقف التفاعل الأنزيمي عن طريق إضافة 2 مل من وسائط الخلايا السرطانية وتحقق من الانفصال تحت المجهر الضوئي.
   ملاحظة: من المهم أن يتم فصل الخلايا السرطانية وعدم وجود مجموعات الخلايا السرطانية.
3. انقل معلق الخلية إلى أنبوب تفاعل سعة 15 مل وقم بطرده بجهاز طرد مركزي عند 245 × جم لمدة 5 دقائق. بعد ذلك ، قم بإزالة محلول التربسين عن طريق سحب العينات أو باستخدام مضخة ، واغسل الحبيبات لاحقا بإضافة 5 مل من DPBS ، وقم بطردها مرة أخرى في نفس الظروف.
4. أعد تعليق الحبيبات في 5 مل من وسط الخلايا السرطانية وعد الخلايا ، على سبيل المثال ، باستخدام غرفة Neubauer. انقل 8,000 خلية H1299-GFP إلى لوحة التصاق منخفضة للغاية مكونة من 96 بئرا (انظر جدول المواد) في حجم نهائي يبلغ 25 ميكرولتر من وسط الخلايا السرطانية.
5. احتضان الغرفة لمدة 3 أيام في الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂. افحص الكرات الكروية تحت المجهر للتأكد من التوحيد. لا تفكر في الخلايا الكروية ذات الكثافة المنخفضة أو الخلايا السرطانية الفردية غير المتصلة لمزيد من التجارب.

2. تحضير البلاعم البشرية الأولية من عينات دم المتبرعين

1. إذا لم يتم استخدام عينات دم المتبرع لعزل الخلايا على الفور ، فقم بتخزينها في درجة حرارة 4 درجات مئوية ، مع الرج.
2. نقل 20 مل من الدم من كيس نقل الدم إلى أنبوب تفاعل سعة 50 مل.
3. بعد ذلك ، قم بإعداد أنبوب جديد سعة 50 مل وأضف 15 مل من وسط فصل الخلايا الليمفاوية (LSM).
4. أضف 20 مل من الدم بعناية إلى كل أنبوب يحتوي على LSM دون خلطه وقم بالطرد المركزي عند 450 × جم لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
5. في غضون ذلك ، قم بإعداد أنبوب جديد سعة 50 مل وأضف 10 مل من المعهد التذكاري البارد (RPMI) -1640 المتوسط.
6. بعد الطرد المركزي ، انقل المرحلة البيضاء الكثيفة ("طبقة مصفرية") داخل الأنبوب المحتوي على الدم إلى الأنبوب المحتوي على RPMI المحضر وأضف الحجم إلى 50 مل مع RPMI البارد.
7. قم بالطرد المركزي للتعليق عند 450 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية وتخلص من المادة الطافية.
8. أعد تعليق الخلايا في 10 مل من RPMI البارد.
9. الطرد المركزي المزيج مرة أخرى عند 450 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية ، وتخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق الحبيبات في 50 مل من RPMI.
10. قم بالطرد المركزي للعينة مرة أخرى عند 450 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية ، وتخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق حبيبات الخلية في 1.5 مل من المخزن المؤقت للخلايا الأحادية الباردة (0.5٪ ألبومين مصل بشري + 5 ملي EDTA في 25 مل من DPBS).
11. ضع تعليق الخلية على الجليد ، وأضف 250 ميكرولتر من الميكروبيدات المضادة ل CD14 ، واحتضن لمدة 15 دقيقة على الجليد.
12. قم بإعداد عمود فصل عن طريق إضافة مرشح في رف فاصل مغناطيسي وإضافة 900 ميكرولتر من المخزن المؤقت أحادي الخلية للتوازن.
13. صب معلق الخلية على الفلتر واتركه يتدفق إلى أنبوب النفايات عن طريق الجاذبية.
14. اغسل العمود الذي يحتوي على الخلايا المرتبطة بالخرز المغناطيسي بإضافة 1 مل من المخزن المؤقت للخلايا الوحيدة.
15. قم بإعداد أنبوب جديد سعة 50 مل يحتوي على 20 مل RPMI واستبدل أنبوب النفايات الموجود أسفل العمود.
16. أضف 3 مل من المخزن المؤقت أحادي الخلية إلى العمود ، وقم بإزالته من الرف المغناطيسي ، وقم بإرفاق الختم.
17. اضغط على الخلايا في الأنبوب المحضر سعة 50 مل واملأه حتى 30 مل من الحجم باستخدام RPMI.
18. عد الخلايا (على سبيل المثال ، باستخدام غرفة عد Neubauer) تحت مجهر ضوئي واضبط رقم الخلية عن طريق إضافة RPMI إلى 2 × 10⁶ خلايا / مل.
19. قم بزرع 1 مل من تعليق الخلية في كل بئر من غرفة 6 آبار واحتضان اللوحة لمدة 2-4 ساعات عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}.
20. تحقق مما إذا كانت الخلايا ملتصقة بشكل صحيح واستبدل RPMI ب 1.5 مل أحادي الوسط (20٪ مصل بشري + 1٪ بكتيريا القلم في RPMI).
21. قم بتغيير الوسط بعد 24 ساعة من الحضانة. في ظل هذه الظروف ، تتمايز الخلايا الوحيدة إلى ضامة في غضون 6 أيام.

3. إعداد البلاعم

1. في يوم التجربة ، افصل البلاعم بكمية مناسبة من الأكوتاز لظروف الثقافة الفردية. على سبيل المثال ، استخدم 500 ميكرولتر من الأكوتاز إذا كانت الخلايا بذرة في طبق مكون من 6 آبار. احتضان الخلايا لمدة 40 دقيقة تقريبا داخل المحلول ، واغسلها مرة واحدة ب 2 مل من DPBS ، واعدها بغرفة Neubauer.
2. بالنسبة لكروي واحد ، قم بتخفيف العدد المطلوب من البلاعم في 40 ميكرولتر من الكولاجين الذي أخلطه (2.5 مجم / مل من كولاجين ذيل الفئران I) واخلطها عن طريق دوامة أنبوب التفاعل بسرعة. في التجارب التي أجريت ، أظهرت 200,000 خلية / مل فرقا يمكن اكتشافه في غزو الخلايا السرطانية. احتفظ بمزيج خلايا الكولاجين على الجليد ، حيث سيبدأ في البلمرة بسرعة في درجة حرارة الغرفة (RT).

4. إعداد اختبار الغزو المشترك

ملاحظة: اعتمادا على تنسيق غرفة التصوير أو الغرض من التحليل أو إعداد التصوير المعني ، قد يحتاج الورم الكروي إلى النقل من لوحة الالتصاق المنخفضة للغاية وتكييف قيم الكولاجين والوسائط. تصف الخطوات التالية إعداد عينة واحدة في شريحة μ 15 بئرا.

1. أولا ، اغسل الكروي بإضافة 300 ميكرولتر من DPBS. قم بقص طرف ماصة زرقاء سعة 1 مل واأخذ الكروية باستخدام DPBS. بعد شفط الكروي في الحافة ، ادفع الماصة لفترة وجيزة إلى أسفل غرفة التصوير لنقل الورم الكروي عن طريق التوتر السطحي.
   ملاحظة: من المهم ملاحظة أن الاحتكاك عند الأطراف غير المعدلة قد يزعج سلامة الكروية.
2. قم بإزالة DPBS المتبقية المنقولة باستخدام الكروي قدر الإمكان عن طريق سحب العينات.
3. أضف بسرعة 40 ميكرولتر من مزيج الكولاجين I/البلاعم (انظر الخطوة 3.4) إلى غرفة التصوير التي تحتوي على الفيرويد H1299-GFP.
4. انقل اللوحة إلى حاضنة خلية واحتضان اللوحة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ في ظل ظروف رطبة لبلمرة مزيج الكولاجين بالكامل.
5. بعد البلمرة ، أضف بعناية 25 ميكرولتر من وسائط الخلايا السرطانية إلى كل بئر واحتضن اللوحة لمدة 3 أيام في الحاضنة في ظل الظروف الموصوفة سابقا. إذا لزم الأمر ، قم بتصوير العينة الحية بمجهر المسح الضوئي بالليزر في النقاط الزمنية المطلوبة.

5. تثبيت وتلوين إضافي

1. من أجل إجراء تلطيخ التألق المناعي ، قم بإصلاح البلاعم والكرويات H1299-GFP داخل مصفوفة الكولاجين الأول. أولا ، قم بإزالة المادة الطافية بعناية من كل عينة بمضخة دون لمس المصفوفة.
   ملاحظة: لتجنب إتلاف العينة، يمكن أيضا إزالة المادة الطافية عن طريق سحب العينة يدويا دون استخدام مضخة.
2. أضف 50 ميكرولتر من 3.7٪ فورمالديهايد في DPBS إلى كل بئر واحتضان العينات لمدة 5 دقائق على الجليد. بعد ذلك ، قم بإزالة محلول التثبيت وأضف 50 ميكرولتر من محلول التثبيت الطازج إليه مرة أخرى. هذه الخطوة مهمة لتحقيق مستوى فورمالديهايد أكثر اتساقا داخل البئر. احتضان العينات طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
   ملاحظة: اعتمادا على كمية الكولاجين التي أخلطها ، قد تمتد أوقات الحضانة إلى عدة ساعات.
3. قم بإزالة المثبت في اليوم التالي واغسل العينات عن طريق الإزالة المتكررة مرتين على الأقل DPBS اعتمادا على حجم غرفة التصوير. احتضنها لفترة وجيزة لمدة 5 دقائق على الثلج على شاكر قبل إزالة DPBS عن طريق سحب العينات. العينات جاهزة الآن للتلطيخ.
4. قم بتلطيخ العينات عن طريق إضافة مزيج 1: 100 من 4 '، 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (1 مجم / مل ، لصبغة النوى) ، والفالودين 568 (لتلطيخ F-actin) في DPBS لمدة 30 دقيقة على الأقل واغسلها مرتين باستخدام DPBS قبل التصوير.

6. تصوير وتحليل المعلمات المختلفة لنمو الورم

ملاحظة: يمكن تنفيذ الخطوات التالية لأي من عينات التصوير الثابتة للخلايا الحية.

1. لمراقبة الورم الكروي ، استخدم مجهر المسح الضوئي بالليزر المقلوب المجهز بهدف 10x يسمح بتصوير كومة z من الثلث السفلي من الكروية تقريبا.
   ملاحظة: نظرا لسمك العينة ، قد يكون المجهر ثنائي الفوتون مفيدا أيضا. للتعرف الأمثل على الخلايا الفردية ، قد تكون هناك حاجة إلى طاقة ليزر أعلى ووقت تعرض.
2. بعد الاستحواذ ، قم بدمج المكدسات عن طريق الإسقاط z باستخدام فيجي ، وهو برنامج ImageJ (فيجي). علاوة على ذلك ، قم بمعالجة القناة الناتجة لإشارة H1299-GFP عن طريق تطبيق عتبة تلقائية (على سبيل المثال ، عتبة هوانغ التلقائية) وإزالة الضوضاء المتبقية عن طريق إزالة البقع من الصورة اعتمادا على مقدار الخلفية وشدة الإشارة.
3. قياس المعلمات الكروية باستخدام فيجي.
   1. المنطقة: قم بقياس الحجم الكروي باستخدام أداة العصا .
   2. المحيط: قم بتضمين المحيط في إعدادات القياس.
   3. القطر: قم بتضمين قطر النمس في إعدادات القياس.
   4. الدائرية: قم بتضمين واصفات الشكل في إعدادات القياس.
4. قياس معلمات الخلايا السرطانية الفردية باستخدام فيجي.
   1. قياس عدد الخلايا الغازية.
      1. اختر الكروي المركزي باستخدام أداة العصا واحذف الإشارة. سيؤدي ذلك إلى إزالة الإشارات الكروية وكذلك جميع الإشارات المتصلة للخلايا ، والتي لا تزال مرتبطة بالكروي ، من التحليل.
      2. بعد ذلك ، استخدم أداة تحليل الجسيمات أو حدد جميع الإشارات الفردية المتبقية.
         ملاحظة: ستكون النتيجة عدد الخلايا السرطانية الغازية. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن تظهر النتيجة أيضا المنطقة التمثيلية التي تغطيها الخلايا السرطانية ويمكن تفسيرها على أنها غزو جماعي أو غزو خلية واحدة ، اعتمادا على حجم المنطقة. لمزيد من التحقق من صحة عدد الخلايا السرطانية الغازية ، يمكن وضع قناع للجسيمات التي تم تحليلها فوق قناة DAPI ، وعد النوى.
5. علاوة على ذلك ، قم بتقييم النتائج باستخدام برنامج إحصائي مثل GraphPad Prism أو Microsoft Excel.
   ملاحظة: لقد ثبت أن هذا البروتوكول قوي ومرن. لقد تم استخدامه في مختبرنا أكثر من 50 مرة ، دائما مع البلاعم البشرية الأولية من 3 متبرعين على الأقل ، لحساب تباين المتبرعين. في شكله الحالي ، ثبت أن البروتوكول يؤدي إلى معدل نجاح يتراوح بين 90 و 95٪. ومع ذلك ، نظرا لأن الإعداد معقد ، فقد تكون النتائج المختلفة أيضا نتيجة ، حيث أن تفاعل البلاعم لكل كروي فردي. وبالتالي ، يقترح إجراء التجربة 3 مرات على الأقل باستخدام 5 كرويات للحصول على نتيجة ذات دلالة إحصائية.

يوضح الشكل 1 صورة كروية H1299-GFP في أيام الحضانة المعنية في مصفوفة الكولاجين الأول. تظهر صورة المجال الساطع ذات الصلة ، التي تم التقاطها في اليوم 0 ، أيضا البلاعم البشرية الأولية المزروعة مع الكروية. يتم تكبير الصورة التمثيلية المسجلة في اليوم 3 من التجربة بعد المعالجة. يشار إلى المعلمات المختلفة التي يمكن تحليلها ، بما في ذلك عدد الخلايا الغازية ومواقع الغزو الجماعي والمحيط الكروي. يوضح الجدول المتضمن النتائج المكتسبة من هذه الصورة. يتطابق عدد الإشارات المكتشفة مع الانطباع المرئي. لا توجد اضطرابات في الكروية المركزية مرئية ، مما يشير إلى غزو الخلايا السرطانية الفردية الفعلية بدلا من الخلايا المشتقة من الحطام الكروي. يمكن الآن مقارنة نتائج الكرويات والظروف المختلفة من خلال التحليل الإحصائي.

الشكل 1: النتائج التمثيلية. (اللوحة العلوية) تم تصوير كروي H1299-GFP في اليوم 0 واليوم 1 واليوم 2 واليوم 3 من الحضانة في مصفوفة الكولاجين I. (اللوحة الوسطى اليسرى) صورة ساحقة للكروية تظهر البلاعم البشرية الأولية المتشابكة. (اللوحة اليمنى الوسطى) تم تكبير صورة تمثيلية تم الحصول عليها في اليوم 3 بعد المعالجة ، وتظهر المعلمات المختلفة التي يمكن تحليلها (محيط كروي باللون الأحمر ؛ يتم تتبعه يدويا للحصول على تصور أفضل). (اللوحة السفلية) النتائج التي تم الحصول عليها من الصورة على اللوحة اليمنى الوسطى. ملاحظة: البلاعم غير مرئية ، حيث تم تسجيل قناة GFP فقط لتوضيح سلوك الخلايا السرطانية. أشرطة المقياس: 100 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

لا يزال غزو الخلايا السرطانية موضوعا مهما ولكنه لم تتم دراسته بشكل كاف في سياق الخلايا المناعية الغازية المشتركة مثل الضامة. يعد غزو الخلايا السرطانية الجماعي والفردي من العمليات الحرجة أثناء ورم خبيث وقد ثبت أنه يقلل من معدل البقاء على قيد الحياة لمرضى السرطان بسبب تعدد الإصابات بالأعضاء المختلفة^8،9. الدراسات في الجسم الحي معقدة وتقتصر على المختبرات التي يمكنها الوصول إلى مرافق إسكان. علاوة على ذلك ، من الصعب أيضا التحكم في الظروف في الجسم الحي أو التلاعب بالجوانب الفردية على وجه التحديد. لذلك ، تظل الحاجة إلى نظام يسهل الوصول إليه أمرا ضروريا للإجابة على الأسئلة الأساسية في السطر الأول من البحث.

من خلال الطريقة المعروضة هنا ، قمنا بتطوير طريقة يمكن من خلالها تحليل أنا) الخلية المناعية و 2) سلوك الخلايا السرطانية ، 3) نمو وتطور كروي صلب ، و 4) يمكن تحليل تأثير الخلايا في البيئة المكروية للورم المحيطة (TME) على مكونات ECM. يمكن استخدامه لمقارنة تأثير البلاعم المعدلة (على سبيل المثال ، المستنفدة لمنظمات محددة عن طريق علاج siRNA) على غزو الخلايا السرطانية الفردية من كروي صلب. ما إذا كانت إعادة الترتيب المادي ل TME أو العوامل المفرزة تمثل السبب الرئيسي لسلوك الخلايا السرطانية المرصودة غير واضح حاليا ويحتاج إلى تحليل بمزيد من التفصيل.

بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أيضا التلاعب بالخلايا السرطانية نفسها ، على سبيل المثال عن طريق علاج siRNA أو خروج المغلوب من منظمات معينة. علاوة على ذلك ، يمكن تحسين التحليل من خلال مقارنة عدد النوى التي تم عدها داخل ملف تعريف الخلية المحدد للسماح بتحديد أكثر دقة للخلايا السرطانية الغازية.

لقد استخدمنا هذا الاختبار لتحديد تأثير البلاعم في TME على غزو الخلايا السرطانية. ومع ذلك ، تجدر الإشارة أيضا إلى أن الخلايا السرطانية من المحتمل أن تؤثر على نشاط البلاعم ، ربما من خلال العوامل المفرزة داخل الوسائط. وبالتالي سيكون أيضا مسعى مفيدا لتحديد التغيرات في الضامة ، مثل حالة الاستقطاب المتغيرة (M1 مقابل M2) عن طريق تلطيخ التألق المناعي باستخدام الأجسام المضادة المعنية. في الماضي ، أظهرت المقارنة بين الخلايا التي تنمو في طبقات أحادية وتلك المزروعة في بيئة ثلاثية الأبعاد اختلافات كبيرة في ملفات تعريف التعبير^{الخاصة بها 10}.

بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يكون فرز الخلايا المنشط بالفلورة (FACS) للمجموعات السكانية الفرعية للبلاعم ودمجها في الإجراء التجريبي مفيدا. أخيرا وليس آخرا ، يمكن أن يؤدي التصوير الأكثر تفصيلا لمناطق التلامس حيث تتفاعل البلاعم مع الخلايا السرطانية أو السطح الكروي للورم إلى تحديد المزيد من الآليات ذات الصلة بالغزو والتفاعل ثلاثي الأبعاد.

وتجدر الإشارة إلى أنه لا يمكن التحكم فيه بشكل كامل هو الوضع الدقيق للكرات في وسط البئر بعد إضافة مزيج الكولاجين. يصعب تنظيم كمية الكولاجين الموجودة أسفل الكروية بشكل خاص. هنا ، تم إنشاء طرق أخرى للسماح بتحديد المواقع الدقيقة للكروي ، على سبيل المثال ، فوق قوالب الاغاروز بأرقام عينات أعلى¹¹. ومع ذلك ، نظرا لأن إطلاق السيتوكينات هو آلية شائعة ، فإن جميع الكرات الموجودة في هذا الاختبار متعدد الكرويات تتعرض لعوامل مفرزة ، ويصعب التحكم في عدد الخلايا المناعية التي تعمل على كروي واحد.

أحد القيود الأساسية لهذا البروتوكول هو قدرة خطوط الخلايا السرطانية على تكوين كرويات موحدة ، وبالتالي فهي قابلة للتطبيق فقط على مجموعة فرعية من خطوط الخلايا. على سبيل المثال ، تشكل خلايا الورم الميلانيني MeWo صفائح غير متساوية مثل هياكل ثلاثية الأبعاد ولكن لا توجد أشكال كروية موحدة.

وتجدر الإشارة أيضا إلى أن الاختبار قابل للتكيف بدرجة كبيرة ، حيث يمكن تعديل العديد من ميزاته ، مثل مادة ECM أو رقم الخلية أو عن طريق إضافة عوامل محددة مثل السيتوكينات إلى المادة الطافية. لذلك ، يجب أن يكون مناسبا للغاية للدراسات الأولية في المختبر لتفاعل الخلية السرطانية / الخلية المناعية ويمكن تكييفه وفقا لسؤال البحث المحدد الذي يتم تناوله حاليا.

ويعلن أصحاب البلاغ عدم وجود مصالح متضاربة.

يود المؤلفون أن يشكروا أندريا موردهورست على الدعم الفني الممتاز وزراعة الخلايا ومارتن إيفلباخر على الدعم المستمر. يتم دعم العمل على غزو البلاعم في مختبر SL من قبل Deutsche Forschungsgemeinschaft (CRC877 / B13; LI925 / 13-1).