ここでは、受精後少なくとも1〜7日の任意の段階で、ゼブラフィッシュの胚と幼虫に高い空間的および時間的解像度で細胞を移植するためのプロトコルを紹介します。

発生と再生は、遺伝的にコード化された時空間的に動的な細胞相互作用のプロセスによって発生します。動物間の細胞移植を使用して細胞の運命を追跡し、ドナー細胞と宿主細胞の遺伝的、空間的、または時間的特性のミスマッチを誘発することは、これらの相互作用の性質を調べるための強力な手段です。ヒヨコや両生類などの生物は、主に移植に適しているため、それぞれ発生と再生の理解に重要な貢献をしてきました。しかし、これらのモデルの能力は、遺伝的扱い性が低いために制限されてきた。同様に、主要な遺伝子モデル生物は移植に対する適合性が低い。

ゼブラフィッシュは発生と再生の主要な遺伝モデルであり、ゼブラフィッシュでは細胞移植が一般的ですが、一般的には発生の初期の胞胚および原腸段階での未分化細胞の移植に限定されています。この記事では、ゼブラフィッシュの移植ウィンドウを受精後少なくとも1〜7日の間の任意の胚期または幼虫期に拡張するシンプルで堅牢な方法を紹介します。このアプローチの精度により、ドナー動物と宿主動物の両方で、ほぼ完璧な空間的および時間的解像度で、わずか1つの細胞を移植することができます。ここでは、神経の発生と再生の研究のために、それぞれ胚ニューロンと幼虫ニューロンの移植に焦点を当てていますが、このアプローチは、幅広い前駆細胞と分化細胞の種類、および研究課題に適用できます。

細胞移植は、発生生物学の基礎技術として長い歴史を持っています。20^世紀初頭頃、移植を含む発生過程を物理的に操作するアプローチにより、発生学は観察科学から実験科学へと変貌を遂げた^1,2。ある画期的な実験では、ハンス・シュペーマンとヒルデ・マンゴールドが、サンショウウオ胚の背側胚盤胞唇を宿主胚の反対側に異所性移植し、近くの組織に二次^{体軸を形成する}ように誘導した3。この実験により、細胞が他の細胞を特定運命に誘導できることが示され、その後、移植は、能力と細胞運命決定、細胞系譜、誘導能力、可塑性、および幹細胞の^{効力に関する}発生生物学の重要な問題を問うための強力な方法として開発されました^1,4,5。

最近の科学の進歩により、移植アプローチの力が拡大しています。1969年、Nicole Le Douarinが核小体染色によりウズラ-ヒヨドリキメラの起源種を区別できるという発見により、移植された細胞とその子孫の追跡が可能になりました⁶。この概念は、後にトランスジェニック蛍光マーカーと高度なイメージング技術⁵の出現によって加速され、細胞運命の追跡^6,7、幹細胞とその効力の同定^8,9、および脳発生中の細胞運動の追跡¹⁰に活用されました。さらに、分子遺伝学の台頭は、異なる遺伝子型の宿主とドナーとの間の移植を促進し、発生因子の自律的および非自律的な機能の正確な解剖を支持した¹¹。

移植はまた、再生組織の成長とパターン形成を調節する細胞の同一性と相互作用を解明することにより、特にプラナリアやウーパールーパーなどの強力な再生能力を持つ生物の再生の研究にも重要な貢献をしてきました。移植研究により、効力¹²、空間パターン^化13,14、特定の組織の寄与^15,16、および再生における細胞記憶^12,17の役割の原理が明らかになった。

ゼブラフィッシュは、保存された遺伝的プログラム、高い遺伝的扱いやすさ、体外受精、大きなクラッチサイズ、および光学的透明度18,19,20により、神経系を含む発生と再生の研究のための主要な脊椎動物モデルです。また、ゼブラフィッシュは発生初期に移植するのに非常に適しています。最も顕著なアプローチは、標識されたドナー胚から胞胚または原腸の段階で宿主胚に細胞を移植してモザイク動物を生成することです。胞胚期に移植された細胞は、エピボリーが始まると散乱して分散し、胚²¹全体に標識された細胞と組織のモザイクを生成する。胃腸移植は、シールドが形成され、A-P軸とD-V軸が決定される²¹として、大まかな運命マップに従って移植された細胞のいくつかの標的化を可能にする。得られたモザイクは、遺伝子が細胞に自律的に作用するかどうかの判断、細胞の関与の試験、および発生全体にわたる組織の動きと細胞移動のマッピングに役立っています^5,11。モザイクゼブラフィッシュは、エレクトロポレーション²²、組換え²³、F0トランスジェネシス²⁴、突然変異誘発²⁵など、いくつかの方法で作製することができるが、移植は、空間、時間、細胞の数と種類において最大の操作性と精度を提供する。ゼブラフィッシュ移植の現状は、脊髄運動ニューロン^26,27、網膜神経節細胞^28,29、受精後10-30時間以内の神経堤細胞(HPF)³⁰、成体ゼ^{ブラフィッシュ}の造血細胞および腫瘍細胞^5,31などの例外を除いて、初期段階では主に前駆細胞に限られている.移植法を幅広い年齢、分化段階、細胞型に拡大することで、このアプローチの力が大幅に向上し、発生および再生プロセスに関する洞察が得られるでしょう。

ここでは、ゼブラフィッシュの胚と幼虫に受精後少なくとも7日まで有効な高解像度細胞移植のための柔軟で堅牢な技術を実証します。標的組織に蛍光タンパク質を発現するトランスジェニック宿主およびドナーフィッシュを使用して、単一細胞を抽出し、ほぼ完璧な空間的および時間的分解能で移植することができます。ゼブラフィッシュの胚と幼生の光学的透明度により、宿主動物が発育または再生する間、移植された細胞を生きたまま画像化することができます。このアプローチは、時空間的なシグナル伝達ダイナミクスが胚³²のニューロンの同一性と軸索の誘導にどのように影響するかを調べ、内因性および外因性の因子が幼魚の再生中に軸索の誘導を促進するロジックを調べるために以前に使用されてきました³³。ここでは分化したニューロンの移植に焦点を当てていますが、私たちの方法は、発生と再生の問題に対処するために、多くの段階や組織にわたって未分化細胞タイプと分化細胞タイプの両方に広く適用できます。

生きたゼブラフィッシュの取り扱いに関連するこの手順のすべての側面は、ミネソタ大学の動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認されており、IACUCガイドラインに準拠して実施されています。

1. 移植装置の1回限りの初期設定(図1)

1. メーカーの指示に従って移植顕微鏡を組み立てます。
   注:このプロトコルでは、40倍の水浸対物レンズを備えた正立蛍光顕微鏡を使用します。
2. 粗いマイクロマニピュレーターと細かいマイクロマニピュレーターを組み立て、製造元の指示に従って顕微鏡の右側に取り付けます。
   注:ステージが針に対してZ次元に移動しないことが重要であるため、マイクロマニピュレーターを顕微鏡ベースに取り付けた固定ステージ顕微鏡を使用します。固定ステージ顕微鏡が利用できない場合は、マイクロマニピュレーターをステージに取り付けることができます。
3. 電極ハンドルに微小電極ホルダーを取り付け、マイクロマニピュレーターに取り付けます。
4. 三方活栓の片側をマイクロシリンジポンプに接続します。クロマトグラフィーアダプターを使用して、ストップコックの反対側をポリエチレンチューブに接続します。
5. クロマトグラフィーアダプターを使用して、ポリエチレンチューブの反対側を微小電極ホルダーに接続します。
6. 10mLのリザーバーシリンジに軽質鉱物油を入れ、ストップコックの上面に取り付けます。
7. マイクロシリンジポンプとチューブ(油圧ライン)にリザーバーからの鉱油を充填し、すべての気泡を確実に取り除きます。
   注:装置がセットアップされると、油圧ラインの時折のメンテナンスのみが必要になります。リザーバーシリンジは取り外して、必要に応じて鉱物油を補充することができます。

2.胚プッシャーを準備します。

1. 2cmの釣り糸を切り、P1000ピペットの先端の狭い方の端に部分的に挿入し、~1.5cm露出させます。釣り糸を瞬間接着剤で少し固定し、乾かします。

3.溶液を準備します。

1. 胚培地(LMA)に溶解した1%低融点アガロースを調製するには、アガロースを沸騰胚培地³⁴に溶解する。丸底試験管に1〜2mLのアリコートを作り、4°Cで保存します。
2. ペニシリン-ストレプトマイシンとトリカイン(RPT)を含むリンゲル溶液を調製し、以下の成分を116 mM NaCl、2.9 mM KCl、1.8 mM CaCl2、5 mM HEPES pH 7.2、50 units/mL penicillin、および50 ug/mL streptomycinの最終濃度まで組み合わせ、溶解するまで攪拌し、真空フィルターを通過します。室温で保存してください。使用直前にトリカインを0.02%の濃度で添加してください。

4.移植のためのドナー動物とホスト動物を準備します。

1. 適切な遺伝子型の宿主動物とドナー動物を、目的の細胞に蛍光標識して、目的の年齢まで育てます。
   注:これらの移植には、 Tg(isl1:EGFPCAAX)^fh474 ドナー動物³² と Tg(isl1:mRFP)^fh1 宿主動物³⁵ を使用し、ドナーから宿主迷走神経核にニューロンを3dpfで移植しました。
2. 各スライドガラスに透明なマニキュアの長方形の輪郭を塗って、移植スライドを準備します(図2A)。マニキュアは、ステップ4.8で追加されたRPTを保持するための疎水性バリアを作成します。使用する前に完全に乾かしてください。
   注:スライドは事前に準備して、無期限に保管することができます。
3. 40mLの水が入った50mLビーカーにLMAのチューブを入れ、50%の電力で1分間、または溶けるまで電子レンジで加熱することにより、1つのLMAアリコートを溶かします。LMAをドライバスヒーターで40°Cに維持します。
4. 宿主動物とドナー動物を鉗子(該当する場合)でデコレーションし、室温のRPTで満たされた小さなペトリ皿に入れて麻酔をかけます。動物が完全に麻酔されるまで5分待ってから続行します。
5. 個々のドナー動物と宿主動物をマウントする:パスツールピペットとピペットポンプを使用して、動物をRPTからLMAに移し、次にLMAの小さな滴で動物をマニキュアの輪郭内のスライドに移します。LMAが希釈されないように、LMAに転送されるRPTの量を最小限に抑えます。LMAが固化する前に、胚プッシャーを使用して動物の向きを合わせ、各動物が目的の針挿入部位を右側に取り付け、すべての動物が垂直に整列していることを確認します(図2B)。アガロースが完全に固まるまで(~5分)待ってから、先に進みます。
   注:各ドナー動物から多くの細胞を採取できるため、各スライドに1人のドナーを持つ2〜4匹の宿主動物をマウントする方が効率的です。
6. メスを使用して、マウントされた動物のすぐ右側にあるすべてのアガロース液滴をまっすぐに垂直にスライスします(図2C)。実験室用ワイプでスライドから緩いアガロースを取り除きます。.
7. メスを使用して、アガロースからくさびを切り取り、針の挿入部位を露出させます(図2C)。実験室用ワイプでスライドから緩いアガロースを取り除きます。.
8. アガロース液滴が完全に沈むまで、スライドにRPTを適用します(図2D)。
9. 準備したスライドを移植顕微鏡に取り付けます。ドナー動物を40倍対物レンズの下にピントを合わせます。これを行うには、対物レンズがメディアの表面を壊すまで下げてから、対物レンズを目的の焦点面まで上げます。
   注:対物レンズによる液体接触は、移植が完了するまで維持する必要があります(図3C)。
10. 蛍光標識された目的のドナー細胞に焦点を合わせます。次に、移植針を見つけるためにステージを左に動かします。
    注意: この時点では、セクション5でドナー動物を簡単に再見つけることができるように、顕微鏡をY軸またはZ軸で調整しないでください。

5.移植針を準備します。

1. マイクロピペットをマイクロピペットプーラーに挿入し、マイクロインジェクション針を引っ張ります。
   注:針の形状は、1細胞期のゼブラフィッシュ胚注射またはパッチクランプに使用されるものと類似している必要があります。PRESSURE = 500、HEAT = ramp + 80、PULL = 90、VELOCITY = 70、TIME = 250( 材料の表を参照)のプログラムでマイクロピペットプーラーを使用しますが、各プーラーの正しい設定は経験的に決定する必要があるでしょう。
2. 解剖スコープの下で、針先をステージマイクロメータの分割に合わせます。マイクロメータを測定ガイドとして使用して、鋭利な一対の鉗子を使用して、針を目的の細胞の直径よりわずかに大きいボアサイズに折します(図3A)。ギザギザのエッジは針の詰まりの原因となる可能性があるため、ブレークができるだけきれいであることを確認してください。注:迷走神経運動ニューロン(直径5〜7μm)の場合、針は内径10μmまで折る必要があります。これは外径20μmに相当します。必要に応じて、針先のサイズ、形状、および/または角度を、マイクロフォージまたはマイクログライン^ダー36を用いて改良することができる。
3. 軽質鉱物油を充填し、ピペットフィラーを装備した50 mLシリンジを使用して、針に鉱油を完全に充填します(図3B)。気泡がないことを確認してください。取り付けの準備ができるまで、充填された針を脇に置きます。
   注意: 気泡がないように、ピペットフィラーを針に完全に挿入し、フィラーを針からゆっくりと引き出しながらオイルを放出します。
4. 移植装置で、三方向ストップコックを回して、その長いアームがマイクロシリンジポンプに面するようにし、リザーバーシリンジプランジャーを押し下げて、油圧ラインからすべての気泡を洗い流します。プランジャーに軽い圧力をかけて(空気がラインに逆流するのを防ぐため)、長いアームがリザーバーシリンジに向くように三方向ストップコックを回します。
5. 気泡が入らないように注意しながら、針をホルダーに挿入します。針の角度を調整して、水平から10〜15°の角度でまっすぐ左を向くようにします(図3C)。
6. 粗いマイクロマニピュレーターと細かいマイクロマニピュレーターを使用して、顕微鏡の対物レンズの下で針の先端を操作し、焦点を合わせます(図3D)。
   注:X平面とY平面での針の粗い位置決めは、針が対物レンズの下に配置されると透過光ビームを反射するため、針を操作しながら対物レンズの下の領域を直接観察することによって行うことができます。その後、顕微鏡の接眼レンズを使用して、細かい位置決めを行うことができます。このステップでは、顕微鏡のステージ位置や焦点を調整しないでください。マイクロマニピュレーターを使用して、針先を既存の焦点位置に近づけます。
7. 液体が針先に出入りしている場合は、シリンジポンプを使用して圧力を調整し、鉱油とリンゲル溶液との間に安定したメニスカスが観察されます(図3D)。
   注意: 安定化後も針先に油泡が残っている場合は、粗いマイクロマニピュレーターのX平面調整を使用して、針を右に動かして先端をRPTから引き抜き、次に左に戻して対物レンズの下に再配置することで、油泡を取り除くことができます。

6. 移植

注:すべての針の動きは、このセクションの細かいマイクロマニピュレーターを使用して行う必要があります。

1. ドナー動物が再び視界に入るまでステージを右に動かし、針が誤って挿入されないように注意します。
2. 移植する細胞に再び中心を合わせて焦点を合わせ、針を動物のすぐ外側の細胞に合わせます(図4A)。
   注:適切な位置合わせを確保するために、明視野と蛍光を頻繁に切り替える必要がある場合があります。NDフィルターを使用すると、両方を同時に視覚化するのに役立ちます。
3. ドナー動物に針を挿入します。
   注意: 針でインとアウトを繰り返すと、皮膚に浸透するのに役立ちます。
4. 手順5.7で説明されているように、マイクロシリンジポンプで針先のオイルメニスカスをすぐに再安定させます。.
5. 針先を目的の細胞に当て、マイクロシリンジポンプで穏やかに吸引します(図4B)。
   注:吸引中の穏やかなインとアウトの動きは、細胞を緩めるのに役立ちます。
6. 十分な数の細胞が取り込まれたら、ドナーから針を取り外し、すぐにマイクロシリンジポンプで針先のオイルメニスカスを再安定化します。.
7. 動物やアガロースが針に触れないように注意しながら、ステージの位置を変えて最初の宿主動物が見えるようにします。
8. 細胞を配置する領域を中心にして焦点を合わせ、動物のすぐ外側のこの領域に針を合わせます(図4C)。
9. 針を宿主動物に挿入し、すぐにマイクロシリンジポンプで針先のオイルメニスカスを再安定化します。
10. 針先を堆積部位に配置し、正しい数のドナー細胞が針から放出されるまで、マイクロシリンジポンプで穏やかな圧力をかけます(図4D)。
    注:ドナー細胞と宿主細胞が異なる蛍光色素で標識されている場合、この段階では、同時可視化を可能にするマルチバンドフィルターが非常に役立ちます。
11. ホストから針を取り外し、すぐにマイクロシリンジポンプで針先のオイルメニスカスを再安定させます。.
12. 残りのすべてのホストについて、手順 6.7 から 6.11 を繰り返します。

7. 宿主動物の回復

1. 40倍の対物レンズを上げ、粗いマイクロマニピュレーターを使用して針をローディング位置に戻します。
   注:針は複数のスライドに再利用できます。
2. 移植顕微鏡からスライドを取り出し、解剖顕微鏡の下に置きます。
3. 宿主動物を鉗子でLMAドロップから慎重に取り外して、マウントを解除します。ガラス製のパスツールピペットを使用して、宿主動物をペニシリン/ストレプトマイシンを含む新鮮なリンゲル溶液の入った皿に移します。動物が麻酔から回復することを確認し、イメージングの準備ができるまで胚インキュベーターに保持します。承認されたプロトコルに従ってドナー動物を安楽死させます。
   注:安楽死のための私たちの方法は、動物を氷浴に少なくとも1時間浸し、その後500 mg / L次亜塩素酸ナトリウムに浸すことです。

移植実験の結果は、移植後の適切な時点における宿主動物の蛍光標識ドナー細胞を蛍光顕微鏡で可視化することで直接観察することができます。ここでは、個々の前迷走神経ニューロンを3dpfで移植しました。その後、宿主動物を12時間または48時間インキュベートし、麻酔をかけ、ガラスカバースリップ上にLMAにマウントし、共焦点顕微鏡でイメージングしました(図5)。移植後12時間(hpt)で、移植に成功したドナーニューロンを観察します(図5A)。細胞は宿主迷走神経運動核の前部にある宿主迷走神経ニューロンの中に位置しているため、細胞の正しい位置を確認できます。また、細胞は無傷で健康に見えるが、これはいくつかの短い神経突起の延長によって示される(図5A)。移植後2日(dpt)で、単一のニューロンが宿主核の正しい位置に正常に移植されたことを再び確認できます(図5B)。この時点で、ニューロンが新しい軸索を第4咽頭弓まで伸ばしたことが観察されます(図5B)。直接観察すると、手順が失敗したことも明らかになります。この例では、ドナーニューロンが存在しない2dptの宿主を観察します。むしろ、移植後に死んだドナーニューロンの断片である可能性が高い小さな緑色の斑点が明らかです(図5C)。移植の成功率は、ユーザーの経験と移植された細胞の数と種類によって異なりますが、3-4 dpf³³で行われた迷走神経運動ニューロン移植の成功率(2-3 dptで宿主の軸索を伸ばした生存ニューロンの存在として定義される)は66%(n = 453回の移植)を経験します。

図1:移植装置の概要(A)正立蛍光顕微鏡;(B)40倍の水浸対物レンズ。(c)粗いマイクロマニピュレータ;(d)微細なマイクロマニピュレータ。(e)微小電極ホルダー;(F)電極ハンドル;(G)三方活栓;(H)マイクロシリンジポンプ;(i)ポリエチレンチューブ;(J)クロマトグラフィーアダプター;(K)10mLリザーバーシリンジ。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:移植用の動物の装着(A)3インチ×1インチのすりガラススライドに透明なマニキュアを長方形のアウトラインで塗布したもの(破線)。(B)アガロースの滴に装着されたドナー動物(矢印)と宿主動物(矢じり)を、移植対象部位(後脳)を右に向けて垂直に整列させたもの。(C)右端とくさびを切り取って移植対象部位を露出させたアガロース。インセット: ボックス化された領域のズーム。(D)ペニシリン-ストレプトマイシンとトリカインを含むリンガー溶液で溢れた移植スライド。スケールバー = 5 mm。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:移植針の準備 (A)ステージマイクロメーターの上にある壊れた移植針。(B)ピペットフィラー(1)を移植針(2)に挿入して、針に鉱物油を充填します。(C)移植スライドと針を移植顕微鏡の所定の位置に準備しました。1:40倍ディッピング対物レンズと浸水スライドの間の水メニスカス 2:移植針 3:微小電極ホルダー。(D)40倍の倍率で移植顕微鏡で見た安定したオイルメニスカス(矢じり)を備えた壊れた移植針の先端。スケールバー= 100 μm この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:顕微鏡下での移植プロセス。 (A)ドナー動物の外に配置された針で、迷走神経ニューロンを狙ったもの(緑、矢印)。(B)蛍光標識のあるドナーニューロン(矢印)をとった後、ドナー動物の内側に配置された針。(C)宿主動物の外部に配置されたいくつかのドナーニューロン(矢印)を含む針で、前宿主迷走神経ニューロン(赤、アスタリスク)を狙ったもの。(D)針を抜いた移植後の宿主動物。移植されたGFP(矢印)を発現するドナーニューロンのクラスターが宿主に排出されています。スケールバー= 30 μm この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図5:代表的な結果。 (A,B)成功した移植。(A)ドナーニューロンを含む12 hptの宿主迷走神経運動核(マゼンタ)の前部領域(緑、A'の黒)。ドナーニューロンはいくつかの神経突起を伸ばしています(A'の矢印)。(B)ドナーニューロン(B'、B'''の黒)を含む2dptホスト(マゼンタ)の迷走神経運動核(B-B')および咽頭軸索枝(B''-B''、軸索枝のラベル付け)。ドナーニューロンは、新しい軸索を分岐4(矢印)に伸ばしました。図5A、Bはさまざまな動物を表しています。(C)移植の失敗。2 dptホスト(マゼンタ)の迷走神経運動核。ドナーニューロンは存在しません。むしろ、死んだドナーニューロン(矢印)の断片を表している可能性が高い小さな斑点(C'の緑、黒)が存在します。スケールバー = 20 μm。略語:dpt =移植後日数;HPT = 移植後数時間。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

発生生物学と再生生物学は、1世紀以上にわたり、細胞シグナル伝達と細胞運命決定の原理を調べるために移植実験に依存してきました。ゼブラフィッシュモデルは、すでに遺伝的アプローチと移植アプローチの強力な融合を表しています。胞胚期と原腸期に移植してモザイク動物を作製することは一般的ですが、対処できる問題の種類は限られています。後期移植はまれですが、胚性脊髄運動ニューロンと網膜神経節細胞をそれぞれ16-18 hpfおよび30-33 hpfで移植する方法が報告されています26,27,28。これらのこれまでの取り組みからインスピレーションを得て、この研究は、後期胚期および幼虫期に適用可能なアプローチを説明し、再生研究への扉を開き、最新の蛍光トランスジェニックアプローチを統合して細胞の標識、移植、および長期追跡を強化することにより、ゼブラフィッシュ移植の力をさらに強化します。

このプロトコルは、再生の文脈を含む、多くの異なる分化段階と年齢の細胞を移植する新たな機会を提供します。例えば、分化したニューロンの移植は、ニューロンが発達する空間的および時間的文脈を変えることによって、シグナル伝達ダイナミクスがニューロンのアイデンティティにどのように影響するかを調べるために使用されてきた³²。ニューロンの決定のタイミングを調べる²⁶;軸索を損傷し、単一細胞分解能でそれらの再成長を追跡する手段として³³;変異型から野生型への移植による軸索再生中の受容体の細胞自律的役割を調べること³³;そして、再生軸索ガイダンス³³における標的記憶の役割を調べること。これまでは神経細胞移植に注目してきましたが、このアプローチに特有の神経細胞を特に適したものにするニューロンの特性は認識していません。むしろ、このアプローチは多くの細胞タイプに適用できると考えています。私たちは、研究者がこの手法を用いて、さまざまな状況で発生と再生のダイナミクスを調べる創造的な方法を見つけることを望み、期待しています。

このプロトコルにおける重要な考慮事項には、細胞標識の選択、移植のための細胞の適合性、および組織のアクセシビリティが含まれます。ドナー細胞用の 明るく安定した永久蛍光標識は、 移植とその後の追跡の両方を容易にするために重要です。注入された色素と導入遺伝子の両方を使用できますが、導入遺伝子はより永続的で、目的の細胞により特異的である可能性があります。光退色に対する耐性は、移植を行うのにかかる時間も延長します。ドナー細胞は、 十分に緩く接着し 、過度の損傷なしに周囲の組織/細胞外マトリックスから針に引き込まれる 適切な形状 でなければなりません。さまざまな細胞タイプの変更には、針穴のサイズの調整が含まれ、これは目的の細胞の直径よりもわずかに大きくする必要があります。目的の細胞へのアクセスを容易にするために、マウント中に動物を適切に方向付けます。細胞を緩めて引き上げるために必要な吸引または物理的破壊のレベルを最適化します。動物が 年をとるにつれて、特定の組織が視覚的および/または物理的にアクセスできなくなることがありますが、特定の年齢制限は認識されていません。たとえば、頭蓋骨は最終的にニューロンへのアクセスを制限する可能性があります。修正には、内部組織をより容易に視覚化するための非色素動物の使用、または予備的な小さな切開の作成、マイクロキャピラリーチューブの厚さの調整、または針の挿入を容易にするための引っ張られた針の形状が含まれる場合があります。

このプロトコルの限界には、上記のように、特定の種類および年齢の細胞が移植に適していないこと、および移植中に組織レベルの構造を維持することの困難さが含まれる。この手順では、除去中に個々の細胞を周囲から解離させる必要があるため、細胞間相互作用と高次構造が失われます。胚形成中に機能するようになる自然免疫系は、組織の損傷や移植部位の死んだ細胞や破片の存在に反応する可能性があり、これはドナー細胞の生存に影響を与える可能性があります^37,38。後の段階では、ドナー細胞も適応免疫系によって拒絶される可能性があり、それは受精後^3-6週間で機能するようになる^39,40。この問題は、適応免疫または自然免疫を欠く宿主に移植することで回避できるかもしれない41,42,43,44。

トラブルシューティングが必要になる可能性のあるプロトコルの潜在的な問題には、次のものがあります:まず、針内の材料は、吸引と圧力中に滑らかで応答性の高い方法で移動する必要があります。びくびくして一貫性のない動きは、油圧ラインに気泡が存在するか、針に部分的な詰まりがあることが原因である可能性があります。したがって、セットアップ中にニードルと油圧ラインからすべての気泡を取り除くように注意する必要があります。気泡が見つかった場合は、粗いマイクロマニピュレーターを使用して針をローディング位置に戻し、ホルダーから針を取り外し、針と裏地を鉱物油で洗い流してから再組み立てします。針の詰まりは、ギザギザの針の折れを避けることで軽減できます。詰まりは、針先から鉱物油を排出して詰まりを押し出すか、針を完全に引っ込めてからRPTに再挿入することで解決できる場合があります。それ以外の場合は、新しい針を使用する必要があります。第二に、除去中に細胞を緩めるのが難しい場合があります。針先を斜めに折って斜めにしたり、吸引時に針を前後に動かしたり、吸引力を調整したりすることで、細胞をほぐして組織から剥離させることができます。マイクログラインダーは、特定の開口部サイズおよび角度³⁶を有する開先針を調製するためにも使用することができる。最後に、除去中に細胞が損傷する可能性があります。重度に損傷を受けた細胞は、明確な形状を失い、注射針に小さな断片または非晶質蛍光塊として現れることがあります。移植後に細胞が生存しないことも損傷の兆候である可能性があり、宿主に蛍光標識のある細胞が存在しないことで容易に分析できます。細胞損傷が繰り返された場合のトラブルシューティングには、針の穴のサイズを大きくしたり、せん断力を減らすために適用される吸引量を制限したりすることが含まれます。針が部分的に詰まっていると、せん断力が増加し、損傷につながる可能性があります。

著者には、開示すべき利益相反はありません。

ゼブラフィッシュ移植のトレーニングを提供してくれたCecilia Moensに感謝します。マーク・タイは優れた魚の世話をしてくれます。エマ・カールソンは原稿に対するフィードバックをくれました。この研究は、NIHのA.J.I.への助成金NS121595によって支援されました。