כאן אנו מציגים פרוטוקול להשתלת תאים ברזולוציה מרחבית וזמנית גבוהה בעוברים ובזחלים של דגי זברה בכל שלב בין יום אחד לשבעה ימים לפחות לאחר ההפריה.

התפתחות והתחדשות מתרחשות בתהליך של אינטראקציות תאיות מרחביות-זמניות דינמיות מקודדות גנטית. השימוש בהשתלת תאים בין בעלי חיים כדי לעקוב אחר גורל התא ולגרום לאי-התאמות בתכונות הגנטיות, המרחביות או הטמפורליות של תאי התורם והמאכסן הוא אמצעי רב עוצמה לבחון את טבען של אינטראקציות אלה. אורגניזמים כמו אפרוחים ודו-חיים תרמו תרומה מכרעת להבנתנו את ההתפתחות וההתחדשות, בהתאמה, במידה רבה בגלל יכולתם להשתלה. כוחם של מודלים אלה, עם זאת, הוגבל על ידי גמישות גנטית נמוכה. כמו כן, לאורגניזמי המודל הגנטי העיקריים יש יכולת נמוכה יותר להשתלה.

דג הזברה הוא מודל גנטי מרכזי להתפתחות והתחדשות, ובעוד שהשתלת תאים נפוצה בדגי זברה, היא מוגבלת בדרך כלל להעברת תאים לא ממוינים בשלבי ההתפתחות המוקדמים של הבלסטולה והגסטרולה. במאמר זה אנו מציגים שיטה פשוטה וחזקה המרחיבה את חלון ההשתלה של דגי זברה לכל שלב עוברי או זחל בין יום אחד לשבעה ימים לפחות לאחר ההפריה. הדיוק של גישה זו מאפשר השתלה של תא אחד בלבד ברזולוציה מרחבית וזמנית כמעט מושלמת הן בבעלי חיים תורמים והן במארחים. בעוד אנו מדגישים כאן את השתלת נוירונים עובריים וזחלים לחקר התפתחות עצבית והתחדשות, בהתאמה, גישה זו ישימה למגוון רחב של סוגי תאים אבותיים ומובחנים ושאלות מחקר.

להשתלת תאים יש היסטוריה ארוכה ורבת קומות כטכניקה בסיסית בביולוגיה התפתחותית. בסביבות תחילת המאה^ה-20, גישות המשתמשות במניפולציות פיזיות כדי להפריע לתהליך ההתפתחותי, כולל השתלות, הפכו את האמבריולוגיה ממדע תצפיתי למדע ניסיוני ^1,2. בניסוי פורץ דרך אחד, הנס ספמן והילדה מנגולד השתילו באופן אקטופי את שפת הבלסטופור הגבי של עובר סלמנדרה בצד הנגדי של עובר פונדקאי, וגרמו לרקמה הסמוכה ליצור ציר גוף משני³. ניסוי זה הראה כי תאים יכולים לגרום לתאים אחרים לאמץ גורלות מסוימים, וכתוצאה מכך, ההשתלה התפתחה כשיטה רבת עוצמה לחקר שאלות קריטיות בביולוגיה התפתחותית לגבי כשירות וקביעת גורל התא, שושלת תאים, יכולת השראתית, פלסטיות ועוצמת תאי גזע ^1,4,5.

התפתחויות מדעיות עדכניות יותר הרחיבו את כוחה של גישת ההשתלה. בשנת 1969, תגליתה של ניקול לה דוארין כי צביעת גרעין יכולה להבחין בין מינים של מוצא בכימרות שליו וגוזלים אפשרה מעקב אחר תאים מושתלים וצאצאיהם⁶. רעיון זה הועצם מאוחר יותר על ידי הופעתם של סמנים פלואורסצנטיים טרנסגניים וטכניקות הדמיה מתקדמות⁵, והוא מונף כדי לעקוב אחר גורל התא ^6,7, לזהות תאי גזע ואת עוצמתם ^8,9, ולעקוב אחר תנועות תאים במהלך התפתחות המוח¹⁰. בנוסף, עליית הגנטיקה המולקולרית אפשרה השתלות בין מארחים ותורמים של גנוטיפים שונים, ותמכה בדיסקציה מדויקת של פונקציות אוטונומיות ולא אוטונומיות של גורמים התפתחותיים¹¹.

השתלות תרמו גם תרומות חשובות לחקר ההתחדשות, במיוחד באורגניזמים בעלי יכולות התחדשות חזקות כגון פלנרים ואקסולוטלים, על ידי הבהרת הזהויות התאיות והאינטראקציות המווסתות את הצמיחה והדפוס של רקמות מתחדשות. מחקרי השתלות גילו עקרונות של עוצמה¹², תבניות מרחביות ^13,14, תרומות של רקמות ספציפיות ^15,16, ותפקידים לזיכרון תאי ^12,17 בהתחדשות.

דגי זברה הם מודל חולייתי מוביל לחקר התפתחות והתחדשות, כולל במערכת העצבים, בשל התוכניות הגנטיות השמורות שלהם, יכולת גנטית גבוהה, הפריה חיצונית, גודל מצמד גדול ובהירות אופטית 18,19,20. דגי זברה גם נוחים מאוד להשתלה בשלבים התפתחותיים מוקדמים. הגישה הבולטת ביותר היא השתלת תאים מעובר תורם מסומן לעובר פונדקאי בשלב הבלסטולה או הגסטרולה ליצירת חיות פסיפס. תאים שהושתלו בשלב הבלסטולה יתפזרו ויתפזרו עם תחילת האפיבולי, וייצרו פסיפס של תאים ורקמות מסומנים על פני העובר²¹. השתלות גסטרולה מאפשרות מיקוד מסוים של תאים מושתלים על פי מפת גורל גסה כאשר המגן נוצר וניתן לקבוע את צירי A-P ו- D-V²¹. הפסיפסים שנוצרו היו בעלי ערך בקביעה אם גנים פועלים באופן אוטונומי של התא, בבדיקת מחויבות התא ובמיפוי תנועת רקמות ונדידת תאים במהלך ההתפתחות ^5,11. דגי זברה פסיפס יכולים להיווצר במספר דרכים, כולל אלקטרופורציה²², רקומבינציה²³, טרנסגנזה F0²⁴ ומוטגנזה²⁵, אך השתלה מספקת את המניפולציה והדיוק הגדולים ביותר במרחב, בזמן ובמספר וסוגי התאים. המצב הנוכחי של השתלת דגי זברה מוגבל במידה רבה לתאי אב בשלבים מוקדמים, עם כמה יוצאים מן הכלל, כולל השתלת נוירונים מוטוריים בעמוד השדרה^26,27, תאי גנגליון רשתית^28,29, ותאי פסגה עצבית ב-10-30 השעות הראשונות לאחר ההפריה (HPF)³⁰, ושל תאים המטופויטיים וגידוליים בדגי זברה בוגרים ^5,31. הרחבת שיטות ההשתלה לטווח רחב של גילאים, שלבי התמיינות וסוגי תאים תשפר מאוד את כוחה של גישה זו לספק תובנות לגבי תהליכים התפתחותיים ומתחדשים.

כאן, אנו מדגימים טכניקה גמישה וחזקה להשתלת תאים ברזולוציה גבוהה יעילה בעוברים וזחלים של דגי זברה עד לפחות 7 ימים לאחר ההפריה. ניתן להשתמש בדגים פונדקאים ותורמים טרנסגניים המבטאים חלבונים פלואורסצנטיים ברקמות המטרה כדי לחלץ תאים בודדים ולהשתיל אותם ברזולוציה מרחבית וזמנית כמעט מושלמת. הבהירות האופטית של עוברים וזחלים של דגי זברה מאפשרת לצלם את התאים המושתלים בשידור חי בזמן שהחיה המארחת מתפתחת או מתחדשת. גישה זו שימשה בעבר כדי לבחון כיצד דינמיקת איתות מרחבית-זמנית משפיעה על הזהות העצבית ועל הנחיית האקסון בעובר³², ולבחון את ההיגיון שבאמצעותו גורמים פנימיים וחיצוניים מקדמים הנחיית אקסונים במהלך התחדשות בדגי זחל³³. בעוד אנו מתמקדים כאן בהשתלת נוירונים ממוינים, השיטה שלנו ישימה באופן נרחב הן לסוגי תאים לא ממוינים והן לסוגי תאים ממוינים על פני שלבים ורקמות רבים כדי לענות על שאלות בהתפתחות והתחדשות.

כל ההיבטים של הליך זה הנוגעים לעבודה עם דגי זברה חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת מינסוטה (IACUC) ומבוצעים בהתאם להנחיות IACUC.

1. הקמה ראשונית חד-פעמית של מנגנון השתלה (איור 1)

1. הרכיבו את מיקרוסקופ ההשתלה בהתאם להוראות היצרן.
   הערה: פרוטוקול זה משתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי זקוף עם יעד טבילה במים פי 40.
2. להרכיב את המיקרומניפולטורים הגסים והעדינים ולהרכיב אותם בצד ימין של המיקרוסקופ בהתאם להוראות היצרן.
   הערה: מכיוון שחשוב שהשלב לא ינוע בממד Z ביחס למחט, אנו משתמשים במיקרוסקופ שלב קבוע כאשר המיקרומניפולטורים מותקנים על בסיס המיקרוסקופ. אם מיקרוסקופ שלב קבוע אינו זמין, ניתן להתקין את המיקרומניפולטור על הבמה.
3. חבר את מחזיק המיקרואלקטרודות לידית האלקטרודה, והרכיב על המיקרומניפולטור.
4. חבר צד אחד של הסטופקוק התלת-כיווני למשאבת המיקרומזרק. חבר את הצד השני של הסטופקוק לצינורות הפוליאתילן באמצעות מתאם הכרומטוגרפיה.
5. חבר את הצד הנגדי של צינור הפוליאתילן למחזיק המיקרואלקטרודות באמצעות מתאם הכרומטוגרפיה.
6. ממלאים את מזרק המאגר של 10 מ"ל בשמן מינרלי קל ומרכיבים אותו בצד העליון של הסטופקוק.
7. מלאו את משאבת המיקרומזרק והצנרת (הקו ההידראולי) בשמן מינרלי מהמאגר, והקפידו להסיר את כל בועות האוויר.
   הערה: לאחר התקנת המנגנון, הוא ידרוש רק תחזוקה מזדמנת של הקו ההידראולי. ניתן להסיר את מזרק המאגר ולמלא אותו מחדש בשמן מינרלי לפי הצורך.

2. הכינו דוחפי עוברים.

1. חותכים חתיכת חוט דיג בקוטר 2 ס"מ ומכניסים אותה חלקית לקצה הצר של קצה פיפטה P1000, ומשאירים ~1.5 ס"מ חשופים. אבטחו את קו הדיג עם טיפה קטנה של דבק-על והניחו לו להתייבש.

3. הכינו פתרונות.

1. כדי להכין 1% נקודת התכה נמוכה agarose מומס במדיה עוברית (LMA), להמיס agarose במדיה עובר רותח³⁴. הפוך 1-2 מ"ל aliquots במבחנות תחתונות עגולות לאחסן ב 4 ° C.
2. הכינו את התמיסה של רינגר עם פניצילין-סטרפטומיצין וטריקאין (RPT) על ידי שילוב המרכיבים הבאים לריכוזים סופיים של 116 mM NaCl, 2.9 mM KCl, 1.8 mM CaCl2, 5 mM HEPES pH 7.2, 50 יחידות/מ"ל פניצילין וסטרפטומיצין 50ug/mL, תוך ערבוב עד להמסה ומעבר דרך מסנן ואקום. יש לאחסן בטמפרטורת החדר. יש להוסיף טריקאין מיד לפני השימוש לריכוז של 0.02%.

4. הכינו את בעלי החיים התורמים והמארחים להשתלה.

1. לגדל בעלי חיים מארחים ותורמים בעלי גנוטיפים מתאימים, ועם תאים בעלי עניין מסומנים באופן פלואורסצנטי, לגיל הרצוי.
   הערה: עבור השתלות אלה, השתמשנו ב-Tg(isl1:EGFPCAAX)^fh474 בעלי חיים תורמים³² וב-Tg(isl1:mRFP)^fh1 בעלי חיים מארחים³⁵ והשתילנו תאי עצב מתורם לגרעינים מוטוריים של הוואגוס המארח ב-3dpf.
2. הכינו שקופיות השתלה על-ידי מריחת קווי מתאר מלבניים של לק שקוף על כל שקופית זכוכית (איור 2A). הלק יוצר מחסום הידרופובי לאחיזה ב-RPT שנוסף בשלב 4.8. הניחו לייבוש מלא לפני השימוש.
   הערה: ניתן להכין שקופיות מראש ולאחסן אותן ללא הגבלת זמן.
3. יש להמיס אליציטוט LMA אחד על ידי הנחת צינור LMA בתוך 50 מ"ל המכילה 40 מ"ל מים וגלי מיקרו למשך דקה אחת בהספק של 50% או עד להמסתה. יש לשמור על LMA בטמפרטורה של 40°C בתנור חימום יבש.
4. יש להרדים בעלי חיים מארחים ותורמים באמצעות מלקחיים (אם רלוונטי) ולהרדים אותם על ידי הכנסתם לצלחות פטרי קטנות מלאות RPT בטמפרטורת החדר. יש להמתין 5 דקות להרדמה מלאה של בעלי החיים לפני שתמשיך.
5. הר תורם בודד ובעלי חיים מארחים: באמצעות פיפטה פסטר ומשאבת פיפטה, להעביר בעלי חיים מ RPT ל LMA, ולאחר מכן להעביר בעלי חיים בטיפות קטנות של LMA על שקופיות בתוך מתאר הלק. מזערו את כמות ה-RPT המועברת ל-LMA כך שה-LMA לא ידולל. לפני שה-LMA מתמצק, השתמשו בדוחף עוברים כדי לכוון את החיות, וודאו שכל חיה מורכבת עם אתר החדרת המחט המיועד מימין, וכל החיות מיושרות אנכית (איור 2B); הניחו לאגרוז להתייצב באופן מלא (~ 5 דקות) לפני שתמשיכו.
   הערה: מכיוון שניתן לקחת תאים רבים מכל בעל חיים תורם, יעיל יותר להרכיב 2-4 בעלי חיים מארחים עם תורם אחד בכל שקופית.
6. בעזרת אזמל, חתכו פרוסה אנכית ישרה דרך כל טיפות האגרוז מימין לחיות הרכובות (איור 2C). הסר אגרוז רופף מהמגלשה עם מגבוני מעבדה.
7. בעזרת אזמל, חתכו טריזים מתוך האגרוז כדי לחשוף את אתר החדרת המחט (איור 2C). הסר אגרוז רופף מהמגלשה עם מגבוני מעבדה.
8. מרחו RPT על המגלשה עד שטיפות האגרוז יהיו שקועות לחלוטין (איור 2D).
9. הרכיבו את המגלשה המוכנה על מיקרוסקופ ההשתלה. הביאו את בעל החיים התורם למיקוד תחת המטרה פי 40. כדי לעשות זאת, להוריד את המטרה עד שהוא שובר את פני השטח של התקשורת, ולאחר מכן להעלות את המטרה למישור המוקד הרצוי.
   הערה: יש לשמור על מגע נוזלים על-ידי המטרה עד להשלמת ההשתלה (איור 3C).
10. למקד את תאי התורם המסומנים באופן פלואורסצנטי כבעלי עניין; לאחר מכן, הזז את השלב שמאלה כהכנה לאיתור מחט ההשתלה.
    הערה: בשלב זה, אל תכוונן את המיקרוסקופ על צירי Y או Z, כדי להבטיח שתוכל למצוא מחדש בקלות את בעל החיים התורם בסעיף 5.

5. הכינו את מחט ההשתלה.

1. הכנס מיקרופיפטה למושך המיקרופיפטה ומשוך מחט מיקרו-הזרקה.
   הערה: צורת המחט צריכה להיות דומה לאלה המשמשות לזריקות עובר דג זברה בשלב 1 או הידוק טלאי. אנו משתמשים במושך מיקרופיפטה עם התוכנית הבאה: לחץ = 500, חום = רמפה + 80, משיכה = 90, VELOCITY = 70, זמן = 250 (ראה טבלת חומרים), אם כי סביר להניח שיהיה צורך לקבוע אמפירית הגדרות נכונות עבור כל מושך.
2. יישרו את קצה המחט עם חלוקות מיקרומטר הבמה תחת טווח ניתוח. השתמשו במיקרומטר כמדריך מדידה, השתמשו בזוג מלקחיים מושחזים כדי לשבור את המחט לגודל משעמם שהוא מעט גדול יותר מקוטר התאים המעניינים (איור 3A). ודא כי השבר נקי ככל האפשר, כמו קצוות משוננים יכול לתרום סתימת מחטים. הערה: עבור נוירונים מוטוריים הואגוס (קוטר 5-7 מיקרומטר), יש לשבור מחטים לקוטר פנימי של 10 מיקרומטר, המתאים לקוטר חיצוני של 20 מיקרומטר. במידת הצורך, ניתן לעדן את הגודל, הצורה ו/או הזווית של קצה המחט באמצעות מיקרופורג' או מיקרו-מטחנה³⁶.
3. באמצעות מזרק של 50 מ"ל מלא בשמן מינרלי קל ומצויד במילוי פיפטה, מלא לחלוטין את המחט בשמן מינרלי (איור 3B). ודא שאין בועות אוויר. הניחו את המחט המלאה בצד עד שהיא מוכנה להרכבה.
   הערה: כדי לוודא שאין בועות אוויר, הכנס את מילוי פיפטה כל הדרך לתוך המחט ושחרר שמן תוך משיכה איטית של חומר המילוי מהמחט.
4. במכשיר ההשתלה, סובב את הסטופקוק התלת-כיווני כך שזרועו הארוכה פונה למשאבת המיקרומזרק ולחץ על בוכנה מזרק המאגר כדי לשטוף את כל בועות האוויר מהקו ההידראולי. שמרו על לחץ קל על הבוכנה (כדי למנוע זרימה חוזרת של אוויר לקו) וסובבו את הסטופקוק התלת-כיווני כך שזרועו הארוכה תפנה למזרק המאגר.
5. הכנס את המחט למחזיק, תוך הקפדה לא להכניס בועות אוויר. התאימו את זווית המחט כך שהיא תפנה ישירות שמאלה בזווית של 10-15° מאופקית (איור 3C).
6. השתמשו במיקרומניפולטורים הגסים והעדינים כדי לתמרן את קצה המחט מתחת למטרת המיקרוסקופ ולהביא אותה למיקוד (איור 3D).
   הערה: מיקום גס של המחט במישורי X ו- Y יכול להיעשות על ידי התבוננות ישירה באזור שמתחת למטרה בזמן שאתה מתמרן את המחט, מכיוון שהמחט תשקף את קרן האור המועברת כאשר היא ממוקמת מתחת למטרה. לאחר מכן ניתן להשתמש בעיניות המיקרוסקופ למיקום עדין. אין לכוונן את מיקום שלב המיקרוסקופ או את המיקוד במהלך שלב זה. השתמש micromanipulators כדי להביא את קצה המחט למצב המוקד הקיים.
7. אם נוזל זורם לתוך קצה המחט או החוצה ממנו, התאימו את הלחץ באמצעות משאבת המזרק עד שיבחינו במיניסקוס יציב בין השמן המינרלי לתמיסת רינגר (איור 3D).
   הערה: אם בועת שמן נשארת בקצה המחט לאחר הייצוב, ניתן להסיר אותה באמצעות כוונון מישור X על המיקרומניפולטור הגס כדי להזיז את המחט ימינה עד שקצהו נסוג מה-RPT, ואז חזרה שמאלה עד שהיא ממוקמת מחדש מתחת למטרה.

6. השתלה

הערה: כל תנועות המחט צריכות להיעשות באמצעות המיקרומניפולטור העדין עבור סעיף זה.

1. הזיזו את הבמה ימינה עד שהחיה התורמת תוחזר לתמונה, היזהרו כדי למנוע חדירה מקרית עם המחט.
2. מרכזו מחדש והתמקדו בתאים המיועדים להשתלה, ויישרו את המחט עם התאים שנמצאים ממש מחוץ לחיה (איור 4A).
   הערה: ייתכן שיהיה עליך לעבור בין שדה בהיר לפלואורסצנטיות לעתים קרובות כדי להבטיח יישור תקין. השימוש במסנן דחיסות נייטרלית יכול לסייע בהצגה חזותית של שניהם בו-זמנית.
3. הכנס את המחט לבעל החיים התורם.
   הערה: תנועות חוזרות ונשנות פנימה והחוצה עם המחט יכולות לסייע בחדירה לעור.
4. ייצב מחדש באופן מיידי את מניסקוס השמן בקצה המחט באמצעות משאבת המיקרומזרק, כמתואר בשלב 5.7.
5. מקמו את קצה המחט כנגד התאים המעניינים והפעילו יניקה עדינה בעזרת משאבת המיקרומזרק (איור 4B).
   הערה: תנועות עדינות פנימה והחוצה במהלך היניקה יכולות לעזור לשחרר תאים.
6. כאשר מספר מתאים של תאים נלקחו, להסיר את המחט מן התורם ומיד לייצב מחדש את מניסקוס השמן בקצה המחט עם משאבת microsyringe.
7. היזהרו להימנע ממגע עם בעלי חיים או אגרוז עם המחט, מקמו מחדש את הבמה כדי להביא את החיה המארחת הראשונה לתצוגה.
8. מרכז והתמקד באזור שבו יש למקם את התאים ויישר את המחט עם האזור הזה ממש מחוץ לחיה (איור 4C).
9. הכנס את המחט לחיה המארחת ומיד ייצב מחדש את מניסקוס השמן בקצה המחט באמצעות משאבת המיקרומזרק.
10. מקמו את קצה המחט באתר השיקוע והפעילו לחץ עדין עם משאבת המיקרומזרק עד שהמספר הנכון של תאי התורם ישתחרר מהמחט (איור 4D).
    הערה: אם תאי התורם והמאכסן מסומנים בפלואורופורים שונים, מסנן רב-תחומי כדי לאפשר הדמיה בו-זמנית יכול להיות מועיל מאוד בשלב זה.
11. הסר את המחט מהמארח ומיד ייצב מחדש את מניסקוס השמן בקצה המחט באמצעות משאבת המיקרומזרק.
12. חזור על שלבים 6.7-6.11 עבור כל המארחים הנותרים.

7. התאוששות בעלי חיים מארחים

1. הרם את המטרה פי 40 והשתמש במיקרומניפולטור הגס כדי לתמרן את המחט חזרה למצב העמסה.
   הערה: ניתן לעשות שימוש חוזר במחט עבור שקופיות מרובות.
2. הסר את המגלשה מהמיקרוסקופ המושתל והנח אותה תחת מיקרוסקופ מנתח.
3. שחררו את בעלי החיים המארחים על ידי הסרתם בזהירות מטיפת ה-LMA בעזרת מלקחיים. בעזרת פיפטת פסטר מזכוכית, מעבירים את החיות המארחות לתבשיל עם תמיסת רינגר טרייה עם פניצילין/סטרפטומיצין. ודאו שבעלי החיים מתאוששים מההרדמה ושמרו אותם באינקובטור עוברי עד שיהיו מוכנים לצילום. יש להרדים את בעלי החיים התורמים על פי פרוטוקולים מאושרים.
   הערה: השיטה שלנו להמתת חסד היא לטבול בעלי חיים באמבט קרח למשך שעה לפחות ואחריה טבילה בהיפוכלוריט נתרן של 500 מ"ג/ליטר.

תוצאות ניסויי ההשתלה נצפות ישירות על ידי הדמיה של תאי תורם המסומנים באופן פלואורסצנטי בבעלי חיים מארחים בנקודות זמן מתאימות לאחר ההשתלה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. כאן, השתלנו נוירונים תועה קדמיים בודדים ב 3 dpf. חיות מארחות הודגרו במשך 12 או 48 שעות, הורדמו, הורכבו ב-LMA על מכסה זכוכית, וצולמו במיקרוסקופ קונפוקלי (איור 5). 12 שעות לאחר ההשתלה (hpt), אנו צופים בתא עצב מתורם שהושתל בהצלחה (איור 5A). אנו יכולים לאשר מיקום נכון של התא, כפי שהוא ממוקם בין נוירונים vagus המארח באזור הקדמי של הגרעין המנוע vagus המארח; התא גם נראה שלם ובריא, כפי שניתן לראות על-ידי הרחבה של כמה בליטות נוירוריט קצרות (איור 5A). יומיים לאחר ההשתלה (dpt), אנו יכולים שוב לאשר שתא עצב יחיד הושתל בהצלחה במיקום הנכון של הגרעין המארח (איור 5B). בנקודה זו אנו רואים שתא העצב הרחיב אקסון חדש לקשת הלוע הרביעית (איור 5B). התבוננות ישירה מגלה גם מתי ההליך נכשל. בדוגמה זו, אנו צופים במארח 2 dpt שבו לא נמצא נוירון תורם; במקום זאת, ניתן לראות כתם ירוק קטן, ככל הנראה שבר של תא עצב מתורם שמת לאחר ההשתלה (איור 5C). למרות ששיעורי ההצלחה של השתלות ישתנו בהתאם לחוויית המשתמש ומספר התאים המושתלים וסוגם, אנו חווים שיעור הצלחה (המוגדר כנוכחות של נוירון שורד שהרחיב אקסון במארח ב 2-3 dpt) של 66% (n = 453 השתלות) עבור השתלות נוירון מוטורי הואגוס המבוצעות ב 3-4 dpf³³.

איור 1: סקירה כללית של מנגנון ההשתלה. (A) מיקרוסקופ פלואורסצנטי זקוף; (ב) יעד טבילה במים פי 40; (ג) מיקרומניפולטור גס; (ד) מיקרומניפולטור עדין; (E) מחזיק מיקרואלקטרודות; (ו) ידית אלקטרודה; (ז) סטופר תלת-כיווני; (H) משאבת מזרק; (I) צינורות פוליאתילן; (י) מתאמי כרומטוגרפיה; (K) מזרק מאגר 10 מ"ל. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: הרכבה של בעלי חיים להשתלה. (A) מגלשת זכוכית חלבית בגודל 3 אינץ' x 1 אינץ' עם לק שקוף שנמרח בקו מתאר מלבני (קו מקווקו). (B) בעלי חיים של תורם (חץ) ופונדקאי (ראש חץ) המותקנים בטיפות אגרוז, מיושרים אנכית עם אתר היעד להשתלה (המוח האחורי) בכיוון ימין. (C) אגרוז עם קצה ימני וטריזים חתוכים כדי לחשוף את אתר היעד להשתלה. כניסה: זום של האזור הארוז. (D) שקופית השתלה מוצפת בתמיסה של רינגר עם פניצילין-סטרפטומיצין וטריקאין. פסי קנה מידה = 5 מ"מ. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: הכנת מחט השתלה. (A) מחט השתלה שבורה על גבי מיקרומטר שלב. (B) מילוי פיפטה (1) המוחדר למחט השתלה (2) למילוי מחט בשמן מינרלי. (C) מגלשת השתלה מוכנה ומחט במקומן במיקרוסקופ ההשתלה. 1: מניסקוס מים בין יעד הטבילה פי 40 לבין המגלשה המוצפת 2: מחט השתלה 3: מחזיק מיקרואלקטרודות. (D) קצה של מחט השתלה שבורה עם מניסקוס שמן יציב (ראש חץ) שנצפה דרך מיקרוסקופ השתלה בהגדלה של פי 40. פסי קנה מידה = 100 מיקרומטר לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: תהליך ההשתלה מתחת למיקרוסקופ. (A) מחט הממוקמת מחוץ לבעל החיים התורם, ומכוונת לנוירונים מוטוריים תועים (ירוק, ראש חץ). (B) מחט הממוקמת בתוך בעל החיים התורם לאחר שקלטה תאי עצב של תורם מסומנים פלואורסצנטית (ראשי חץ). (C) מחט המכילה מספר תאי עצב מתורם (ראשי חץ) הממוקמים מחוץ לחיה המארחת, ומכוונים לתאי עצב מוטוריים של הואגוס המארח הקדמי (אדום, כוכבית). (D) בעל חיים מארח לאחר השתלה עם מחט משוכה. אשכול של תאי עצב מתורם מושתל המבטאים GFP (ראש חץ) גורשו לתוך הפונדקאי. פסי קנה מידה = 30 מיקרומטר לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

תרשים 5: תוצאות מייצגות. (א,ב) השתלות מוצלחות. (A) האזור הקדמי של גרעין מנוע הואגוס מארח 12 hpt (מגנטה) המכיל נוירון תורם (ירוק, שחור ב-A'). תא העצב התורם הרחיב מספר נוירוטים (חצים ב-A'). (B) הגרעין המוטורי התועה (B-B') וענפי האקסון הלועי (B''-B', ענפי אקסון מסומנים) של מארח 2 dpt (מגנטה) המכיל נוירון תורם (ירוק, שחור ב-B', B'''). תא העצב התורם הרחיב אקסון חדש לענף 4 (ראשי חץ). איור 5A,B מייצג חיות שונות. (ג) השתלה לא מוצלחת. הגרעין המוטורי התועה של מארח 2 dpt (מגנטה). אין נוירון תורם נוכח; במקום זאת, כתם קטן (ירוק, שחור ב-C'), המייצג ככל הנראה שבר של נוירון תורם מת (ראש חץ), נוכח. פסי קנה מידה = 20 מיקרומטר. קיצורים: dpt = ימים לאחר ההשתלה; HPT = שעות לאחר ההשתלה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

ביולוגיה התפתחותית ורגנרטיבית מסתמכת כבר למעלה ממאה שנה על ניסויי השתלות כדי לבחון עקרונות של איתות תאי וקביעת גורל התא. מודל דג הזברה כבר מייצג מיזוג רב עוצמה של גישות גנטיות והשתלות. השתלה בשלבי בלסטולה וגסטרולה ליצירת חיות פסיפס היא נפוצה אך מוגבלת באילו סוגי שאלות היא יכולה לטפל. השתלה בשלב מאוחר יותר היא נדירה, אם כי שיטות להשתלת נוירונים מוטוריים עובריים בעמוד השדרה ותאי גנגליון ברשתית ב 16-18 HPF ו 30-33 HPF, בהתאמה, דווחו 26,27,28. עבודה זו, השואבת השראה ממאמצים קודמים אלה, מעצימה עוד יותר את כוחה של השתלת דגי זברה על ידי תיאור גישה ישימה לשלבים עובריים וזחלים מאוחרים, ופותחת את הדלת לשימוש בה במחקרי התחדשות, ומשלבת גישות טרנסגניות פלואורסצנטיות מודרניות לשיפור התיוג, ההעברה והמעקב ארוך הטווח אחר תאים.

פרוטוקול זה מציג הזדמנויות חדשות להשתלת תאים בשלבי התמיינות וגילאים רבים ושונים, כולל בהקשר הרגנרטיבי. לדוגמה, השתלת נוירונים מובחנים שימשה לבחינת האופן שבו דינמיקת איתות משפיעה על הזהות העצבית על ידי שינוי ההקשרים המרחביים והזמניים שבהם נוירונים מתפתחים³² ; לבחון את עיתוי הקביעה העצבית²⁶; כאמצעי לפצוע אקסונים ולעקוב אחר צמיחתם מחדש ברזולוציה של תא יחיד³³; לבחון את התפקיד האוטונומי התאי של קולטן במהלך התחדשות האקסון באמצעות השתלות מסוג מוטנט לבר³³; ולבחון את תפקידו של זיכרון המטרה בהנחיית אקסונים רגנרטיביים³³. בעוד שהתמקדנו עד כה בהשתלות נוירונים, איננו מודעים לשום מאפיין של תאי עצב שהופך אותם למתאימים באופן ייחודי לגישה זו; במקום זאת, אנו מאמינים כי גישה זו ישימה לסוגי תאים רבים. אנו מקווים ומצפים שחוקרים ימצאו דרכים יצירתיות לבחון את הדינמיקה של התפתחות והתחדשות בהקשרים רבים באמצעות טכניקה זו.

שיקולים קריטיים בפרוטוקול זה כוללים בחירת תוויות תאים, התאמת תאים להשתלה ונגישות רקמות. תווית פלואורסצנטית בהירה, יציבה וקבועה לתאי התורם חשובה כדי להקל הן על ההשתלה והן על המעקב שלאחר מכן. ניתן להשתמש הן בצבעים מוזרקים והן בטרנסגנים, אם כי טרנסגנים יכולים להיות קבועים יותר וספציפיים יותר לתאים המעניינים. עמידות בפני פוטו-הלבנה גם מאריכה את הזמן שניתן לקחת בביצוע השתלה. התאים התורמים חייבים להיות דבוקים מספיק באופן רופף ובעלי צורה מתאימה כדי להישאב לתוך המחט מהרקמה שמסביב / מטריצה חוץ-תאית ללא נזק מוגזם. שינויים עבור סוגי תאים שונים כוללים התאמת גודל המחט, אשר צריך להיות מעט גדול יותר מאשר קוטר התא של עניין; כיוון נכון של החיה במהלך הרכבה כדי להקל על הגישה לתאים המעניינים; ואופטימיזציה של רמת היניקה או השיבוש הפיזי הנדרשים כדי לשחרר ולמשוך תאים. ככל שבעל החיים מזדקן, רקמות מסוימות עשויות להפוך לבלתי נגישות מבחינה חזותית ו/או פיזית, אם כי איננו מודעים למגבלות גיל ספציפיות. לדוגמה, סביר להניח שהגולגולת תגביל בסופו של דבר את הגישה לנוירונים. שינויים עשויים לכלול שימוש בבעלי חיים ללא פיגמנט כדי לדמיין בקלות רבה יותר רקמות פנימיות, או ביצוע חתכים קטנים ראשוניים, התאמות לעובי צינור מיקרוקפילרי, או צורת מחט משוכה כדי להקל על כניסת המחט.

מגבלות פרוטוקול זה כוללות תאים מסוגים וגילאים מסוימים שאינם ניתנים להשתלה, כפי שתואר לעיל, ואת הקושי לשמור על מבנים ברמת הרקמה במהלך ההשתלה. מכיוון שהליך זה דורש ניתוק של תאים בודדים מסביבתם במהלך ההסרה, אינטראקציות בין תאים ומבנים מסדר גבוה יותר יאבדו. מערכת החיסון המולדת, אשר הופכת מתפקדת במהלך האמבריוגנזה, עשויה להגיב לנזק לרקמות או לנוכחות של תאים מתים ופסולת באתר ההשתלה, מה שעלול להשפיע על הישרדות תאי התורם^37,38. בשלבים מאוחרים יותר, תאי התורם עשויים גם להידחות על ידי מערכת החיסון הנרכשת, אשר הופכת פונקציונלית ב 3-6 שבועות לאחר ההפריה^39,40. ניתן להימנע מבעיה זו על ידי השתלה בפונדקאים חסרי חסינות מסתגלת או מולדת 41,42,43,44.

קשיים פוטנציאליים בפרוטוקול שעשויים לדרוש פתרון בעיות כוללים את הדברים הבאים: ראשית, החומר בתוך המחט צריך לנוע בצורה חלקה ומגיבה במהלך היניקה והלחץ. תנועה קופצנית ולא עקבית נגרמת ככל הנראה על ידי נוכחות של בועות אוויר בקו הידראולי או סתימה חלקית במחט; לכן, יש לנקוט משנה זהירות כדי להסיר את כל בועות האוויר מן המחט ואת הקו הידראולי במהלך ההתקנה. אם נמצאו בועות אוויר, החזירו את המחט למצב העמסה באמצעות המיקרומניפולטור הגס, הסירו את המחט מהמחזיק ושטפו את המחט וריפד בשמן מינרלי לפני ההרכבה מחדש. ניתן להקל על סתימת מחטים על ידי הימנעות משברי מחטים משוננים. לפעמים ניתן לפתור סתימות על ידי הוצאת שמן מינרלי מקצה המחט כדי לדחוף החוצה את הסתימה או על ידי נסיגה מלאה ולאחר מכן החדרה מחדש של המחט לתוך RPT; אחרת, יש להשתמש במחט חדשה. שנית, ייתכן קושי לשחרר תאים במהלך ההסרה. שבירת קצה המחט בזווית לקבלת צורה משופעת, הזזת המחט קדימה ואחורה במהלך היניקה והתאמת עוצמת היניקה יכולים לעזור לשחרר את התאים לניתוק מהרקמה. מיקרו-מטחנה יכולה לשמש גם להכנת מחטים משופעות עם גודל פתיחה ספציפי וזווית³⁶. לבסוף, עלול להיות נזק לתאים במהלך ההסרה. תאים שניזוקו קשות עלולים לאבד את צורתם המוגדרת ולהופיע כשברים קטנים או כתמים פלואורסצנטיים אמורפיים במחט ההזרקה. כישלון של תאים לשרוד לאחר ההשתלה עשוי גם להיות אינדיקציה לנזק וניתן לאבחן אותו בקלות על ידי היעדר תאים מסומנים פלואורסצנטית בפונדקאי. פתרון בעיות עבור נזק חוזר לתאים יכול לכלול הגדלת גודל המשעמם של המחט והגבלת כמות היניקה המופעלת כדי להפחית את כוח הגזירה. מחט סתומה חלקית עלולה גם להגביר את כוחות הגזירה, מה שמוביל לנזק.

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

אנו מודים לססיליה מואנס על הכשרתה בהשתלת דגי זברה; מארק טיי לטיפול מעולה בדגים; ואמה קרלסון על משוב על כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי NS121595 המענקים של ה-NIH ל-A.J.I.