Qui presentiamo un protocollo per trapiantare cellule con un'elevata risoluzione spaziale e temporale in embrioni e larve di zebrafish in qualsiasi fase tra almeno 1 e 7 giorni dopo la fecondazione.

Lo sviluppo e la rigenerazione avvengono attraverso un processo di interazioni cellulari spazio-temporali dinamiche geneticamente codificate. L'uso del trapianto di cellule tra animali per tracciare il destino cellulare e per indurre discrepanze nelle proprietà genetiche, spaziali o temporali delle cellule donatrici e ospiti è un potente mezzo per esaminare la natura di queste interazioni. Organismi come i pulcini e gli anfibi hanno dato un contributo cruciale alla nostra comprensione dello sviluppo e della rigenerazione, rispettivamente, in gran parte a causa della loro adattabilità al trapianto. La potenza di questi modelli, tuttavia, è stata limitata dalla bassa trattabilità genetica. Allo stesso modo, i principali organismi modello genetici hanno una minore adattabilità al trapianto.

Il pesce zebra è un importante modello genetico per lo sviluppo e la rigenerazione e, sebbene il trapianto di cellule sia comune nel pesce zebra, è generalmente limitato al trasferimento di cellule indifferenziate nelle prime fasi di sviluppo della blastula e della gastrula. In questo articolo, presentiamo un metodo semplice e robusto che estende la finestra di trapianto di zebrafish a qualsiasi stadio embrionale o larvale tra almeno 1 e 7 giorni dopo la fecondazione. La precisione di questo approccio consente il trapianto di una sola cellula con una risoluzione spaziale e temporale quasi perfetta sia negli animali donatori che in quelli ospiti. Mentre qui evidenziamo il trapianto di neuroni embrionali e larvali per lo studio dello sviluppo e della rigenerazione nervosa, rispettivamente, questo approccio è applicabile a un'ampia gamma di tipi di cellule progenitrici e differenziate e a domande di ricerca.

Il trapianto di cellule ha una storia lunga e leggendaria come tecnica fondamentale nella biologia dello sviluppo. Intorno alla fine del XX^secolo, gli approcci che utilizzano manipolazioni fisiche per perturbare il processo di sviluppo, compreso il trapianto, hanno trasformato l'embriologia da una scienza osservativa in una sperimentale ^1,2. In un esperimento di riferimento, Hans Spemann e Hilde Mangold hanno trapiantato ectopicamente il labbro dorsale del blastopore di un embrione di salamandra sul lato opposto di un embrione ospite, inducendo il tessuto vicino a formare un asse secondario del corpo³. Questo esperimento ha dimostrato che le cellule potrebbero indurre altre cellule ad adottare determinati destini e, successivamente, il trapianto si è sviluppato come un potente metodo per interrogare questioni critiche nella biologia dello sviluppo riguardanti la competenza e la determinazione del destino cellulare, la linea cellulare, la capacità induttiva, la plasticità e la potenza delle cellule staminali ^1,4,5.

I progressi scientifici più recenti hanno ampliato la potenza dell'approccio del trapianto. Nel 1969, la scoperta di Nicole Le Douarin che la colorazione nucleolare poteva distinguere le specie di origine nelle chimere di quaglia permise di tracciare le cellule trapiantate e la loro progenie⁶. Questo concetto è stato successivamente potenziato dall'avvento dei marcatori fluorescenti transgenici e delle tecniche di imaging avanzate⁵ ed è stato sfruttato per tracciare il destino cellulare ^6,7, identificare le cellule staminali e la loro potenza ^8,9 e tracciare i movimenti cellulari durante lo sviluppo del cervello¹⁰. Inoltre, l'aumento della genetica molecolare ha facilitato il trapianto tra ospiti e donatori di genotipi distinti, supportando una precisa dissezione delle funzioni autonome e non autonome dei fattori di sviluppo¹¹.

Il trapianto ha anche dato importanti contributi allo studio della rigenerazione, in particolare in organismi con forti capacità rigenerative come le planarie e gli axolotl, chiarendo le identità cellulari e le interazioni che regolano la crescita e il pattern dei tessuti rigeneranti. Gli studi sui trapianti hanno rivelato i principi della potenza¹², del patterning spaziale^13,14, dei contributi di tessuti specifici^15,16 e dei ruoli della memoria cellulare^12,17 nella rigenerazione.

I pesci zebra sono un modello di vertebrato leader per lo studio dello sviluppo e della rigenerazione, anche nel sistema nervoso, grazie ai loro programmi genetici conservati, all'elevata trattabilità genetica, alla fecondazione esterna, alle grandi dimensioni della covata e alla chiarezza ottica 18,19,20. I pesci zebra sono anche molto suscettibili al trapianto nelle prime fasi di sviluppo. L'approccio più importante è il trapianto di cellule da un embrione di donatore marcato a un embrione ospite allo stadio di blastula o gastrula per generare animali a mosaico. Le cellule trapiantate durante la fase di blastula si disperderanno e si disperderanno all'inizio dell'epibolia, producendo un mosaico di cellule e tessuti marcati in tutto l'embrione²¹. I trapianti di gastrula consentono di indirizzare le cellule trapiantate secondo una mappa approssimativa del destino, poiché le forme dello scudo e gli assi A-P e D-V possono essere determinati²¹. I mosaici risultanti sono stati preziosi per determinare se i geni agiscono in modo autonomo nelle cellule, testando l'impegno cellulare e mappando il movimento dei tessuti e la migrazione cellulare durante lo sviluppo ^5,11. Il pesce zebra mosaico può essere generato in diversi modi, tra cui l'elettroporazione²², la ricombinazione²³ e la transgenesi F0²⁴ e la mutagenesi²⁵, ma il trapianto offre la massima manipolabilità e precisione nello spazio, nel tempo, nel numero e nei tipi di cellule. Lo stato attuale del trapianto di zebrafish è in gran parte limitato alle cellule progenitrici nelle fasi iniziali, con poche eccezioni tra cui il trapianto di motoneuroni spinali^26,27, cellule gangliari retiniche^28,29 e cellule della cresta neurale nelle prime 10-30 ore dopo la fecondazione (hpf)³⁰ e di cellule ematopoietiche e tumorali in zebrafish adulto ^5,31. L'espansione dei metodi di trapianto a un'ampia gamma di età, stadi di differenziazione e tipi di cellule aumenterebbe notevolmente la potenza di questo approccio nel fornire informazioni sui processi di sviluppo e rigenerativi.

Qui, dimostriamo una tecnica flessibile e robusta per il trapianto di cellule ad alta risoluzione efficace in embrioni e larve di zebrafish fino ad almeno 7 giorni dopo la fecondazione. I pesci ospiti e donatori transgenici che esprimono proteine fluorescenti nei tessuti bersaglio possono essere utilizzati per estrarre singole cellule e trapiantarle con una risoluzione spaziale e temporale quasi perfetta. La chiarezza ottica degli embrioni e delle larve di zebrafish consente di visualizzare le cellule trapiantate dal vivo mentre l'animale ospite si sviluppa o si rigenera. Questo approccio è stato precedentemente utilizzato per esaminare come le dinamiche di segnalazione spazio-temporale influenzino l'identità neuronale e la guida degli assoni nell'embrione³² e per esaminare la logica con cui i fattori intrinseci ed estrinseci promuovono la guida degli assoni durante la rigenerazione nei pesci larvali³³. Mentre ci concentriamo qui sul trapianto di neuroni differenziati, il nostro metodo è ampiamente applicabile sia a tipi di cellule indifferenziate che differenziate in molti stadi e tessuti per affrontare le questioni relative allo sviluppo e alla rigenerazione.

Tutti gli aspetti di questa procedura che riguardano il lavoro con il pesce zebra vivo sono stati approvati dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali (IACUC) dell'Università del Minnesota e vengono eseguiti in conformità con le linee guida IACUC.

1. Messa a punto iniziale una tantum dell'apparecchio per il trapianto (Figura 1)

1. Assemblare il microscopio per trapianti secondo le istruzioni del produttore.
   NOTA: Questo protocollo utilizza un microscopio a fluorescenza verticale con un obiettivo a immersione in acqua 40x.
2. Assemblare i micromanipolatori grossolani e fini e montarli sul lato destro del microscopio secondo le istruzioni del produttore.
   NOTA: Poiché è importante che il tavolino non si muova nella dimensione Z rispetto all'ago, utilizziamo un microscopio a tavolino fisso con i micromanipolatori montati sulla base del microscopio. Se non è disponibile un microscopio a tavolino fisso, il micromanipolatore può essere montato sul tavolino.
3. Fissare il supporto del microelettrodo all'impugnatura dell'elettrodo e montarlo sul micromanipolatore.
4. Collegare un lato del rubinetto a tre vie alla pompa a microsiringa. Collegare l'altro lato del rubinetto al tubo in polietilene utilizzando l'adattatore per cromatografia.
5. Collegare il lato opposto del tubo in polietilene al supporto del microelettrodo utilizzando l'adattatore per cromatografia.
6. Riempire la siringa del serbatoio da 10 ml con olio minerale leggero e montarla sul lato superiore del rubinetto.
7. Riempire la pompa a microsiringa e il tubo (la linea idraulica) con olio minerale dal serbatoio, assicurandosi di rimuovere tutte le bolle d'aria.
   NOTA: Una volta che l'apparato è stato installato, richiederà solo una manutenzione occasionale della linea idraulica. La siringa del serbatoio può essere rimossa e riempita con olio minerale, se necessario.

2. Prepara gli spingiembrioni.

1. Taglia un pezzo di lenza di 2 cm e inseriscilo parzialmente nell'estremità stretta di un puntale per pipetta P1000, lasciando ~1,5 cm esposti. Fissare la lenza con una piccola goccia di supercolla e lasciare asciugare.

3. Prepara le soluzioni.

1. Per preparare l'agarosio a basso punto di fusione all'1% disciolto in terreno embrionale (LMA), sciogliere l'agarosio in terreno embrionale bollente³⁴. Versare 1-2 mL di aliquote in provette a fondo tondo e conservare a 4 °C.
2. Preparare la soluzione di Ringer con penicillina-streptomicina e tricaina (RPT) combinando i seguenti ingredienti fino a concentrazioni finali di 116 mM di NaCl, 2,9 mM di KCl, 1,8 mM di CaCl2, 5 mM di HEPES pH 7,2, 50 unità/mL di penicillina e 50ug/mL di streptomicina, mescolando fino a quando non si sarà sciolta e passando attraverso un filtro sottovuoto. Conservare a temperatura ambiente. Aggiungere la tricaina immediatamente prima dell'uso a una concentrazione dello 0,02%.

4. Preparare gli animali donatori e ospiti per il trapianto.

1. Allevare animali ospiti e donatori dei genotipi appropriati e con cellule di interesse marcate in fluorescenza, all'età desiderata.
   NOTA: Per questi trapianti, abbiamo utilizzato Tg(isl1:EGFPCAAX)^fh474 animali donatori³² e Tg(isl1:mRFP)^fh1 animali ospiti³⁵ e trapiantato neuroni dal donatore ai nuclei motori vagari ospiti a 3dpf.
2. Preparare i vetrini da trapianto applicando un contorno rettangolare di smalto trasparente su ciascun vetrino (Figura 2A). Lo smalto crea una barriera idrofobica da trattenere nell'RPT aggiunto al passaggio 4.8. Lasciare asciugare completamente prima dell'uso.
   NOTA: I vetrini possono essere preparati in anticipo e conservati a tempo indeterminato.
3. Sciogliere un'aliquota di LMA mettendo un tubo di LMA in un becher da 50 ml contenente 40 ml di acqua e cuocendo nel microonde per 1 minuto al 50% della potenza o fino a quando non si scioglie. Mantenere l'LMA a 40 °C in un riscaldatore a bagno secco.
4. Decorionare gli animali ospiti e donatori con un forcipe (se applicabile) e anestetizzarli mettendoli in piccole piastre di Petri riempite con RPT a temperatura ambiente. Attendere 5 minuti affinché gli animali siano completamente anestetizzati prima di procedere.
5. Montare i singoli animali donatori e ospiti: utilizzando la pipetta Pasteur e la pompa per pipette, trasferire gli animali da RPT a LMA, quindi trasferire gli animali in piccole gocce di LMA su vetrini all'interno del contorno dello smalto. Ridurre al minimo la quantità di RPT trasferita nell'LMA in modo che l'LMA non si diluisca. Prima che l'LMA si solidifichi, utilizzare uno spingitore di embrioni per orientare gli animali, assicurandosi che ogni animale sia montato con il sito di inserimento dell'ago previsto a destra e che tutti gli animali siano allineati verticalmente (Figura 2B); Lasciare che l'agarosio si solidifichi completamente (~5 min) prima di procedere.
   NOTA: Poiché è possibile prelevare molte cellule da ciascun animale donatore, è più efficiente montare 2-4 animali ospiti con un donatore su ciascun vetrino.
6. Usando un bisturi, tagliare una fetta verticale diritta attraverso tutte le gocce di agarosio appena a destra degli animali montati (Figura 2C). Rimuovere l'agarosio sciolto dal vetrino con salviette da laboratorio.
7. Usando un bisturi, tagliare dei cunei dall'agarosio per esporre il sito di inserimento dell'ago (Figura 2C). Rimuovere l'agarosio sciolto dal vetrino con salviette da laboratorio.
8. Applicare RPT sul vetrino fino a quando le gocce di agarosio non sono completamente immerse (Figura 2D).
9. Montare il vetrino preparato sul microscopio per trapianti. Metti a fuoco l'animale donatore con l'obiettivo 40x. Per fare ciò, abbassare l'obiettivo fino a rompere la superficie del supporto, quindi sollevare l'obiettivo sul piano focale desiderato.
   NOTA: Il contatto con il liquido da parte dell'obiettivo deve essere mantenuto fino al completamento del trapianto (Figura 3C).
10. Mettere a fuoco le cellule del donatore marcate in fluorura; Quindi, sposta il tavolino a sinistra in preparazione per individuare l'ago da trapianto.
    NOTA: A questo punto, non regolare il microscopio sugli assi Y o Z, per assicurarsi di poter ritrovare facilmente l'animale donatore nella sezione 5.

5. Preparare l'ago da trapianto.

1. Inserire una micropipetta nell'estrattore per micropipette ed estrarre un ago per microiniezione.
   NOTA: La forma dell'ago deve essere simile a quella utilizzata per le iniezioni di embrioni di zebrafish a 1 cellula o per il patch clamping. Utilizziamo un estrattore per micropipette con il seguente programma: PRESSIONE = 500, CALORE = rampa + 80, TRAZIONE = 90, VELOCITÀ = 70, TEMPO = 250 (vedi Tabella dei materiali), anche se probabilmente sarà necessario determinare empiricamente le impostazioni corrette per ciascun estrattore.
2. Allineare la punta dell'ago con le divisioni del tavolino micrometrico sotto un cannocchiale da dissezione. Utilizzando il micrometro come guida alla misurazione, utilizzare un paio di pinze affilate per rompere l'ago a una dimensione del foro leggermente più grande del diametro delle celle di interesse (Figura 3A). Assicurarsi che la rottura sia il più pulita possibile, poiché i bordi frastagliati possono contribuire all'intasamento dell'ago. NOTA: Per i motoneuroni vago (diametro 5-7 μm), gli aghi devono essere rotti a un diametro interno di 10 μm, che corrisponde a un diametro esterno di 20 μm. Se necessario, le dimensioni, la forma e/o l'angolo della punta dell'ago possono essere perfezionati con una microforgia o una microsmerigliatrice³⁶.
3. Utilizzando una siringa da 50 ml riempita con olio minerale leggero e dotata di un riempitore per pipette, riempire completamente l'ago con olio minerale (Figura 3B). Assicurarsi che non ci siano bolle d'aria. Mettere da parte l'ago pieno fino al momento del montaggio.
   NOTA: Per assicurarsi che non vi siano bolle d'aria, inserire completamente il riempitivo della pipetta nell'ago e rilasciare l'olio mentre si estrae lentamente il riempitivo dall'ago.
4. Sull'apparecchio per il trapianto, ruotare il rubinetto a tre vie in modo che il suo braccio lungo sia rivolto verso la pompa della microsiringa e premere lo stantuffo della siringa del serbatoio per eliminare tutte le bolle d'aria dalla linea idraulica. Mantenere una leggera pressione sullo stantuffo (per evitare il riflusso dell'aria nella linea) e ruotare il rubinetto a tre vie in modo che il suo braccio lungo sia rivolto verso la siringa del serbatoio.
5. Inserire l'ago nel supporto, facendo attenzione a non introdurre bolle d'aria. Regolare l'angolo dell'ago in modo che sia rivolto direttamente a sinistra con un angolo di 10-15° rispetto all'orizzontale (Figura 3C).
6. Utilizzare i micromanipolatori grossolani e fini per manovrare la punta dell'ago sotto l'obiettivo del microscopio e metterlo a fuoco (Figura 3D).
   NOTA: Il posizionamento approssimativo dell'ago nei piani X e Y può essere effettuato osservando direttamente l'area sotto l'obiettivo mentre si manovra l'ago, poiché l'ago rifletterà il raggio di luce trasmesso quando è posizionato sotto l'obiettivo. Gli oculari del microscopio possono quindi essere utilizzati per il posizionamento di precisione. Non regolare la posizione del tavolino del microscopio o la messa a fuoco durante questa fase. Utilizzare i micromanipolatori per portare la punta dell'ago nella posizione focale esistente.
7. Se il liquido scorre dentro o fuori dalla punta dell'ago, regolare la pressione utilizzando la pompa a siringa fino a quando non si osserva un menisco stabile tra l'olio minerale e la soluzione di Ringer (Figura 3D).
   NOTA: Se dopo la stabilizzazione rimane una bolla d'olio sulla punta dell'ago, può essere rimossa utilizzando la regolazione del piano X sul micromanipolatore grossolano per spostare l'ago verso destra fino a quando la sua punta non è stata ritirata dall'RPT, quindi di nuovo a sinistra fino a quando non viene riposizionato sotto l'obiettivo.

6. Trapianto

NOTA: Tutti i movimenti dell'ago devono essere eseguiti utilizzando il micromanipolatore fine per questa sezione.

1. Spostare il tavolino verso destra fino a quando l'animale donatore non viene riportato in vista, facendo attenzione per evitare la penetrazione accidentale con l'ago.
2. Centrati e concentrati sulle cellule da trapiantare e allinea l'ago con le cellule appena fuori dall'animale (Figura 4A).
   NOTA: Potrebbe essere necessario passare spesso dal campo chiaro alla fluorescenza per garantire un allineamento corretto. L'uso di un filtro a densità neutra può aiutare a visualizzare entrambi contemporaneamente.
3. Inserire l'ago nell'animale donatore.
   NOTA: Movimenti ripetuti dentro e fuori con l'ago possono aiutare a penetrare nella pelle.
4. Ristabilizzare immediatamente il menisco oleoso nella punta dell'ago con la microsiringa, come descritto al punto 5.7.
5. Posizionare la punta dell'ago contro le cellule di interesse e aspirare delicatamente con la micropompa a siringa (Figura 4B).
   NOTA: Movimenti delicati dentro e fuori durante l'aspirazione possono aiutare a sciogliere le cellule.
6. Quando è stato prelevato un numero adeguato di cellule, rimuovere l'ago dal donatore e ristabilizzare immediatamente il menisco oleoso nella punta dell'ago con la pompa a microsiringa.
7. Facendo attenzione a non entrare in contatto con gli animali o con l'agarosio, riposizionare il tavolino per portare in vista il primo animale ospite.
8. Centrare e concentrarsi sull'area in cui devono essere posizionate le cellule e allineare l'ago con questa regione appena fuori dall'animale (Figura 4C).
9. Inserire l'ago nell'animale ospite e ristabilizzare immediatamente il menisco oleoso nella punta dell'ago con la micropompa a siringa.
10. Posizionare la punta dell'ago nel sito di deposizione e applicare una leggera pressione con la micropompa a siringa fino a quando il numero corretto di cellule del donatore non viene rilasciato dall'ago (Figura 4D).
    NOTA: Se le cellule del donatore e dell'ospite sono marcate con fluorofori diversi, un filtro multibanda per consentire la visualizzazione simultanea può essere molto utile in questa fase.
11. Rimuovere l'ago dall'ostia e ristabilizzare immediatamente il menisco oleoso nella punta dell'ago con la micropompa.
12. Ripetere i passaggi 6.7-6.11 per tutti gli host rimanenti.

7. Recupero dell'animale ospite

1. Sollevare l'obiettivo 40x e utilizzare il micromanipolatore grossolano per riportare l'ago nella posizione di caricamento.
   NOTA: L'ago può essere riutilizzato per più diapositive.
2. Rimuovere il vetrino dal microscopio per trapianti e posizionarlo sotto un microscopio da dissezione.
3. Smonta gli animali ospiti rimuovendoli con cura dalla caduta LMA con una pinza. Usando una pipetta di vetro Pasteur, trasferisci gli animali ospiti in un piatto con soluzione fresca di Ringer con penicillina/streptomicina. Assicurati che gli animali si riprendano dall'anestesia e mantenili in un'incubatrice per embrioni fino a quando non sono pronti per l'immagine. Sopprimere gli animali donatori secondo i protocolli approvati.
   NOTA: Il nostro metodo per l'eutanasia consiste nell'immergere gli animali in un bagno di ghiaccio per almeno 1 ora, seguito dall'immersione in 500 mg/L di ipoclorito di sodio.

I risultati degli esperimenti di trapianto sono osservati direttamente visualizzando cellule di donatori marcate in fluorescenza in animali ospiti in momenti appropriati dopo il trapianto utilizzando un microscopio a fluorescenza. Qui, abbiamo trapiantato singoli neuroni del vago anteriore a 3 dpf. Gli animali ospiti sono stati quindi incubati per 12 o 48 ore, anestetizzati, montati in LMA su un vetrino coprioggetti e sottoposti a imaging con un microscopio confocale (Figura 5). A 12 ore dopo il trapianto (hpt), osserviamo un neurone donatore trapiantato con successo (Figura 5A). Possiamo confermare il corretto posizionamento della cellula, poiché si trova tra i neuroni vago dell'ospite nella regione anteriore del nucleo motorio vago dell'ospite; la cellula appare anche intatta e sana, come indicato dall'estensione di diverse sporgenze neuritiche corte (Figura 5A). A 2 giorni dal trapianto (dpt), possiamo nuovamente confermare che un singolo neurone è stato trapiantato con successo nella posizione corretta del nucleo ospite (Figura 5B). A questo punto, osserviamo che il neurone ha esteso un nuovo assone fino al 4° arco faringeo (Figura 5B). L'osservazione diretta rivela anche quando la procedura è fallita. In questo esempio, osserviamo un ospite di 2 dpt in cui non è presente alcun neurone donatore; piuttosto, è evidente un piccolo granello verde, probabilmente un frammento di un neurone di donatore morto dopo il trapianto (Figura 5C). Sebbene le percentuali di successo del trapianto varino in base all'esperienza dell'utente e al numero e al tipo di cellule trapiantate, sperimentiamo un tasso di successo (definito come la presenza di un neurone sopravvissuto che ha esteso un assone nell'ospite a 2-3 dpt) del 66% (n = 453 trapianti) per i trapianti di motoneurone vago eseguiti a 3-4 dpf³³.

Figura 1: Panoramica dell'apparato per il trapianto. (A) Microscopio a fluorescenza verticale; (B) Obiettivo di immersione in acqua 40x; (C) micromanipolatore grossolano; (D) micromanipolatore fine; (E) portamicroelettrodo; (F) impugnatura dell'elettrodo; (G) rubinetto a tre vie; (H) pompa a microsiringa; (I) tubi in polietilene; (J) adattatori per cromatografia; (K) Siringa serbatoio da 10 mL. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Montaggio di animali per il trapianto. (A) Un vetrino in vetro smerigliato da 3 pollici x 1 pollice con smalto trasparente applicato in un contorno rettangolare (linea tratteggiata). (B) Animali donatori (freccia) e ospiti (punta di freccia) montati in gocce di agarosio, allineati verticalmente con il sito bersaglio del trapianto (rombencefalo) orientato verso destra. (C) Agarosio con bordo destro e cunei tagliati per esporre il sito bersaglio del trapianto. Riquadro: zoom della regione in scatola. (D) Vetrino da trapianto inondato con soluzione di Ringer con penicillina-streptomicina e tricaina. Barre della scala = 5 mm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Preparazione dell'ago da trapianto. (A) Ago da trapianto rotto in cima a un micrometro da tavolino. (B) Riempitivo per pipette (1) inserito nell'ago da trapianto (2) per riempire l'ago con olio minerale. (C) Vetrino da trapianto preparato e ago in posizione sul microscopio per trapianti. 1: Menisco d'acqua tra l'obiettivo di immersione 40x e il vetrino allagato 2: Ago da trapianto 3: Porta microelettrodo. (D) Punta di un ago da trapianto rotto con menisco d'olio stabile (punta di freccia) visto attraverso il microscopio per trapianti con ingrandimento 40x. Barre di scala = 100 μm Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Il processo di trapianto al microscopio. (A) Ago posizionato all'esterno dell'animale donatore, puntato sui motoneuroni vagi (verde, punta di freccia). (B) Ago posizionato all'interno dell'animale donatore dopo aver prelevato i neuroni del donatore contrassegnati in modo fluorescente (punte di freccia). (C) Ago contenente diversi neuroni donatori (punte di freccia) posizionati all'esterno dell'animale ospite, puntato sui motoneuroni vago dell'ospite anteriore (rosso, asterisco). (D) Animale ospite post-trapianto con ago ritirato. Un gruppo di neuroni di donatori trapiantati che esprimono GFP (punta di freccia) è stato espulso nell'ospite. Barre di scala = 30 μm Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Risultati rappresentativi. (A,B) Trapianti di successo. (A) La regione anteriore di un nucleo motore vago ospite di 12 hpt (magenta) contenente un neurone donatore (verde, nero in A'). Il neurone donatore ha esteso diversi neuriti (frecce in A'). (B) Il nucleo motore vago (B-B') e i rami assoniali faringei (B''-B''', rami assonici etichettati) di un ospite 2 dpt (magenta) contenente un neurone donatore (verde, nero in B', B'''). Il neurone donatore ha esteso un nuovo assone al ramo 4 (punte di freccia). Le figure 5A, B rappresentano diversi animali. (C) Trapianto non riuscito. Il nucleo motore vago di un ospite di 2 dpt (magenta). Non è presente alcun neurone donatore; piuttosto, è presente un piccolo granello (verde, nero in C'), che probabilmente rappresenta un frammento di un neurone donatore morto (punta di freccia). Barre di scala = 20 μm. Abbreviazioni: dpt = giorni dopo il trapianto; HPT = ore dopo il trapianto. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

La biologia dello sviluppo e rigenerativa si è basata per oltre un secolo su esperimenti di trapianto per esaminare i principi della segnalazione cellulare e della determinazione del destino cellulare. Il modello zebrafish rappresenta già una potente fusione di approcci genetici e di trapianto. Il trapianto negli stadi di blastula e gastrula per generare animali a mosaico è comune ma limitato nei tipi di domande che può affrontare. Il trapianto in stadio avanzato è raro, sebbene siano stati riportati metodi per trapiantare motoneuroni spinali embrionali e cellule gangliari retiniche rispettivamente a 16-18 hpf e 30-33 hpf 26,27,28. Traendo ispirazione da questi sforzi precedenti, questo lavoro migliora ulteriormente il potere del trapianto di zebrafish descrivendo un approccio applicabile agli stadi embrionali e larvali tardivi, aprendo la porta al suo utilizzo negli studi di rigenerazione e che integra i moderni approcci transgenici fluorescenti per migliorare l'etichettatura, il trasferimento e il monitoraggio a lungo termine delle cellule.

Questo protocollo presenta nuove opportunità per il trapianto di cellule di diversi stadi di differenziazione ed età, anche nel contesto rigenerativo. Ad esempio, il trapianto di neuroni differenziati è stato utilizzato per esaminare come le dinamiche di segnalazione influenzano l'identità neuronale modificando i contesti spaziali e temporali in cui i neuroni si sviluppano³²; esaminare i tempi della determinazione neuronale²⁶; come mezzo per danneggiare gli assoni e monitorare la loro ricrescita con la risoluzione di una singola cellula³³; esaminare il ruolo cellulo-autonomo di un recettore durante la rigenerazione assonale tramite trapianti da mutante a wild type³³; e per esaminare il ruolo della memoria target nella guida rigenerativa degli assoni³³. Sebbene finora ci siamo concentrati sul trapianto neuronale, non siamo a conoscenza di alcuna caratteristica dei neuroni che li renda particolarmente adatti a questo approccio; Piuttosto, crediamo che questo approccio sia applicabile a molti tipi di cellule. Speriamo e ci aspettiamo che i ricercatori trovino modi creativi per esaminare le dinamiche dello sviluppo e della rigenerazione in molti contesti utilizzando questa tecnica.

Le considerazioni critiche in questo protocollo includono la selezione delle marcature cellulari, l'idoneità delle cellule per il trapianto e l'accessibilità dei tessuti. Un'etichetta fluorescente luminosa, stabile e permanente per le cellule del donatore è importante per facilitare sia il trapianto che il successivo tracciamento. Possono essere utilizzati sia coloranti iniettati che transgeni, sebbene i transgeni possano essere più permanenti e più specifici per le cellule di interesse. La resistenza al fotosbiancamento prolunga anche il tempo che si può impiegare per eseguire il trapianto. Le cellule del donatore devono essere sufficientemente aderenti e di forma appropriata per essere aspirate nell'ago dal tessuto/matrice extracellulare circostante senza danni eccessivi. Le modifiche per i diversi tipi di celle includono la regolazione della dimensione del foro dell'ago, che dovrebbe essere leggermente più grande del diametro della cella di interesse; orientare correttamente l'animale durante il montaggio per facilitare l'accesso alle celle di interesse; e l'ottimizzazione del livello di aspirazione o di interruzione fisica necessaria per allentare e sollevare le cellule. Con l'avanzare dell'età, alcuni tessuti possono diventare visivamente e/o fisicamente inaccessibili, anche se non siamo a conoscenza di limiti di età specifici. Ad esempio, il cranio probabilmente alla fine limiterà l'accesso ai neuroni. Le modifiche possono includere l'uso di animali non pigmentati per visualizzare più facilmente i tessuti interni, o l'esecuzione di piccole incisioni preliminari, aggiustamenti allo spessore del tubo microcapillare o forma dell'ago tirato per facilitare l'ingresso dell'ago.

Le limitazioni di questo protocollo includono cellule di determinati tipi ed età non suscettibili di trapianto, come descritto sopra, e la difficoltà di mantenere le strutture a livello tissutale durante il trapianto. Poiché questa procedura richiede che le singole cellule siano dissociate dall'ambiente circostante durante la rimozione, le interazioni cellula-cellula e le strutture di ordine superiore andranno perse. Il sistema immunitario innato, che diventa funzionale durante l'embriogenesi, può rispondere al danno tissutale o alla presenza di cellule morte e detriti nel sito di trapianto, che potrebbero influire sulla sopravvivenza delle cellule del donatore^37,38. Nelle fasi successive, le cellule del donatore possono anche essere rigettate dal sistema immunitario adattativo, che diventa funzionale a 3-6 settimane dopo la fecondazione^39,40. Questo problema può essere evitato trapiantandolo in ospiti privi di immunità adattativa o innata 41,42,43,44.

Le potenziali difficoltà con il protocollo che potrebbero richiedere la risoluzione dei problemi includono quanto segue: Innanzitutto, il materiale all'interno dell'ago dovrebbe muoversi in modo fluido e reattivo durante l'aspirazione e la pressione. Il movimento nervoso e incoerente è probabilmente causato dalla presenza di bolle d'aria nella linea idraulica o da un parziale intasamento dell'ago; Pertanto, è necessario prestare attenzione per rimuovere tutte le bolle d'aria dall'ago e dalla linea idraulica durante la configurazione. Se vengono rilevate bolle d'aria, riportare l'ago in posizione di caricamento utilizzando il micromanipolatore grossolano, rimuovere l'ago dal supporto e sciacquare l'ago e il rivestimento con olio minerale prima di rimontarlo. L'intasamento dell'ago può essere mitigato evitando rotture frastagliate dell'ago. Gli intasamenti a volte possono essere risolti espellendo l'olio minerale dalla punta dell'ago per spingere fuori l'intasamento o ritraendo completamente e quindi reinserendo l'ago nell'RPT; in caso contrario, è necessario utilizzare un nuovo ago. In secondo luogo, potrebbero esserci difficoltà ad allentare le cellule durante la rimozione. Rompere la punta dell'ago ad angolo per ottenere una forma smussata, muovere l'ago avanti e indietro durante l'aspirazione e regolare la forza di aspirazione può aiutare a sciogliere le cellule per il distacco dal tessuto. Un microgrinder può essere utilizzato anche per preparare aghi smussati con una dimensione di apertura specifica e un angolo³⁶. Infine, potrebbero verificarsi danni alle cellule durante la rimozione. Le cellule gravemente danneggiate possono perdere la loro forma definita e apparire come piccoli frammenti o macchie fluorescenti amorfe nell'ago per iniezione. L'incapacità delle cellule di sopravvivere dopo il trapianto può anche essere un'indicazione di danno e può essere facilmente analizzata dall'assenza di cellule marcate in fluorescenza nell'ospite. La risoluzione dei problemi in caso di danni ripetuti alle celle potrebbe includere l'aumento della dimensione del foro dell'ago e la limitazione della quantità di aspirazione applicata per ridurre la forza di taglio. Un ago parzialmente ostruito può anche aumentare le forze di taglio, causando danni.

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Ringraziamo Cecilia Moens per la formazione nel trapianto di zebrafish; Marc Tye per l'eccellente cura dei pesci; ed Emma Carlson per il feedback sul manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione NIH NS121595 ad A.J.I.