CRISPR-Cas9システムを用いた RIP1 ノックアウトU937細胞株の作製

CRISPR関連のプロトコルがますます有用で利用しやすくなるにつれて、特定の実験条件下では依然として合併症や障害が発生する可能性があります。このプロトコールでは、CRISPR/Cas9を使用した受容体相互作用セリン/スレオニン-プロテインキナーゼ1(RIPK1/RIP1)ノックアウトヒト細胞株の作製を概説し、このプロセスで遭遇する可能性のある課題を強調しています。

このプロトコールは、ヒト単球U937細胞株のCRISPR/Cas9を使用して RIP1 遺伝子をノックアウトする手順を概説しています。この方法では、指定されたガイドRNAプラスミドとレンチウイルスパッケージングプラスミドを利用して、RIP1遺伝子ノックアウトを達成します。このプロトコールは、従来のCRISPR法の課題と改善に対処し、将来の細胞死研究のための複製を可能にします。得られた変異細胞は、機能的なRIP1タンパク質が役割を果たす細胞死の機構的変化を調べるために使用できます。生存率アッセイでは、ネクロプトーシス導入後のノックアウト細胞における細胞死の有意な減少が示されました。蛍光顕微鏡法では、同じ条件下でノックアウト細胞のミトコンドリア活性酸素種(ROS)が著しく減少していることが明らかになりました。これらの機能アッセイを組み合わせることで、RIP1タンパク質の損失が確認されます。U937ヒト単球での使用に最適化されたこの手順は、他の主要な細胞死調節因子を標的とするようにも適応させることができ、機能的で非致死的な変異体をもたらします。潜在的な落とし穴は、ミュータント生成中に発生する可能性のある課題についての洞察を提供するために、全体を通して対処されます。

CRISPR/Cas9遺伝子編集技術の利用は、その発見以来急速に進化しています^1,2,3。細胞株や細菌内の遺伝子をノックインまたはノックアウトする能力は、研究を進め、細胞内メカニズムを理解するために非常に貴重です1,2,3,4,5,6。CRISPR-Cas9システムは、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)などの従来の遺伝子編集法を改良し、遺伝子特異性のエンジニアリングを簡素化します。この手順には、目的の遺伝子ターゲットを見つけるために使用されるガイドRNA(gRNA)と、二本鎖^DNA切断3,4で目的のゲノム位置を変更するエンドヌクレアーゼであるCas9の2つの基本的なコンポーネントが含まれます。gRNAは、Cas9エンドヌクレアーゼがWatson-Crick塩基対形成を通じて目的の遺伝子配列で二本鎖切断を特定し、開始するためのガイドとして機能します。CRISPR/Cas9システムによるゲノム編集の全プロセスには、非相同末端結合(NHEJ)または相同^組換え3,7を通じてDNAのこれらの二本鎖切断を修復する細胞機構が含まれます。NHEJが起こり、ゲノムに突然変異が効果的に生じ、標的遺伝子の発現が失われる可能性の方が高い^3,4。

市販のソースでは、細菌の増殖と単離を通じて発現できるgRNAターゲットのライブラリを作成することができ、それにより、その使いやすさが大幅に向上しています。しかし、CRISPR/Cas9システムの主な制限は、gRNAとCas9複合体を標的細胞株に導入するのが難しいことです。これらの制限は、一般にトランスフェクションが難しい8と呼ばれる浮遊細胞株で^{発生します。}一般的なトランスフェクション法は、一般にCRISPR/Cas9システムを浮遊細胞に導入するのに効率的ではないため、レンチウイルストランスフェクションや形質導入などのウイルス導入法がこのタイプの細胞株により適しています^8,9。

このタイプのトランスフェクションには、gRNAとCas9エンドヌクレアーゼをコードするレンチウイルスベクターと、レンチウイルス粒子を製造できる細胞株にトランスフェクションするレンチウイルスパッケージングプラスミドが必要です。このプロセスで一般的に選択される細胞株は、トランスフェクションが容易で、gRNAとCas9 ^9,10の組み立てに非常に効率的に働くHEK293T細胞です。その後、これらの粒子はレンチウイルスとして上清に放出され、これを使用してgRNAとCas9を目的の浮遊細胞株(U937ヒト単球など)に形質導入することができます。そのため、ここで説明する手順は、確立された方法と比較して次の変更があります:(1)トランスフェクションが困難な細胞株の代替トランスフェクション方法;(2)CRISPRプラスミドDNAを濃縮したり、超遠心分離機を使用したりする必要はありません。(3)シングルセルクローニングの必要性を排除します。

この記事の直接的な焦点は、U937ヒト単球のRIP1遺伝子をノックアウトすることでした。炎症性の高い細胞死経路ネクロプトーシスの標準的な形態は、細胞死研究の極めて重要な標的として機能するRIP1によって制御されています。 11,12,13,14 RIP1が自己リン酸化によって活性化すると、受容体相互作用するセリン/スレオニン-プロテインキナーゼ3(RIPK3/RIP3)および混合系統キナーゼドメイン様(MLKL)シュードキナーゼの直接リン酸化と活性化をリクルートしてネクロソームを形成します。この形成に続いて、ネクロソームは細胞内を自由に移動して、ミトコンドリアなどのオルガネラと相互作用する^12,13。ミトコンドリアでは、RIP1は細胞代謝による正のフィードバックループを増強し、ミトコンドリアROSの産生に直接影響を与え、その結果、RIP1のさらなる自己リン酸化、ネクロソーム形成、およびネクロプトーシスの下流の実行が促進されます11,12,13,14。

現在の研究グループは、細胞死におけるRIP1の役割に焦点を当てていますが、RIP1を研究する他の理由には、炎症と感染におけるRIP1の役割が含まれます。TNF受容体などの死受容体によって活性化されると、RIP1はNF-κBシグナル伝達経路の活性化を促進し、免疫細胞の動員と炎症応答の増幅に不可欠な炎症誘発性サイトカイン、ケモカイン、およびその他の分子の転写を引き起こします¹⁵。NF-κBの活性化に加えて、RIPK1はMAPKシグナル伝達経路にも関与し、炎症をさらに増強することができます^15,16。感染への応答におけるその役割に関して、RIP1は、特にToll様受容体(TLR)などのパターン認識受容体(PRR)によって認識される病原体関連分子パターン(PAMP)に応答して、宿主の炎症反応の重要なメディエーターとして機能します¹⁷。さらに、敗血症では、RIP1はTNF受容体などの死受容体を介したシグナル伝達によって活性化され、炎症誘発性カスケードの開始につながります。RIPK1は、NF-κB経路およびMAPK経路の活性化を媒介し、敗血症¹⁸に特徴的な全身性炎症反応の主要なドライバーであるTNF-α、IL-1β、IL-6などの炎症誘発性サイトカインの産生を促進します。

この手順の概略図を 図 1 に示します。ガイドRNA(gRNA)と標的配列を表1に示します。試薬および使用した機器の詳細は、材料表に記載されています。

1. 大腸菌由来のCas9エンドヌクレアーゼとピューロマイシン耐性を含有するRIP1標的CRISPR gRNAレンチウイルス発現ベクターの採取

1. クオドラントストリーク大 腸菌 は、100 μg/mL アンピシリンを添加した LB 寒天プレート上に レンチウイルスベクター gRNA を抱いています。
2. プレートを37°Cで1〜2日間インキュベートし、プレートの最も希薄な領域に個々のコロニーが見えるようにします。
3. 滅菌ループのある単一のコロニーを選択し、各コロニーを100 μg/mLのアンピシリンを添加した5 mLのLBブロスを50 mLのコニカルチューブに個別に追加します。均質化を確実にするために、単一のコロニーを追加した後、完全に上下にピペットで移動するようにしてください。
4. 50 mLコニカルチューブのキャップをベントしてテープで留め、37°C、225 rpmのオービタルシェーカーで8時間インキュベートします。
5. 37°Cでの8時間インキュベーション中に、100 μg/mLのアンピシリンを添加した40 mLのLBブロスを、4本の別々の50 mLコニカルチューブのそれぞれに加えます。
6. 37°Cで8時間インキュベートした後、増殖したEを40μL取ります 。 大腸菌を培養し、4本の50 mLコニカルチューブすべてに加えます。
7. 50 mLコニカルチューブのキャップをベントしてテープで留め、37°C、225 rpmのオービタルシェーカーで12〜16時間インキュベートします。
8. このインキュベーションを37°Cで行い、すべてのチューブをスイングバケットローターで3220 x g で20分間スピンダウンし、増殖した 大腸菌 をペレット化します。
9. 上清を廃ビーカーにデカントし、4つのペレットすべてを100 μg/mLのアンピシリンを添加した10 mLのLBブロスに混ぜ合わせます。
10. 結合したペレットをスイングバケットローターで最高速度で20分間再び回転ダウンして、単一のペレットを取得します。
11. できるだけ多くの上清を廃棄物ビーカーに捨て、次のいずれかのオプションに進みます:(1)湿ったペレットを最大1か月間-80°で凍結します。(2)レンチウイルスベクタープラスミドの精製を進めます。
    注: オプション 1 を選択した場合、ここでプロトコルが一時停止される場合があります。

2. RIP1を標的とした精製CRISPR gRNAレンチウイルス発現ベクターによるHEK293T細胞へのトランスフェクション

1. 4.5 g/L D-グルコース、L-グルタミン、110 mg/L ピルビン酸ナトリウム、および10 %の熱不活化FBSを含むDMEMを含むDMEMを含む10 cmプレートに、3 × 10⁶ 〜5 × 10⁶ 細胞の濃度でHEK293T細胞を一晩播種します。
2. 翌日、プレートのコンフルエント度が約70%〜90%であることを確認してから、プロトコールを進めます。
3. プラスミド(実験用CRISPRプラスミド:pLP1:pLP2:pLP/VSVG)の比率が1:1:1:1の比率で、トランスフェクション試薬を3:1の割合(試薬3部:プラスミドDNA:プラスミド1部)で細胞のトランスフェクションをセットアップします。また、血清培地も減少しています。
   注:比率のpLP1:pLP2:pLP / VSVG部分はレンチウイルス包装混合物です。
   1. トランスフェクションをセットアップする前に、トランスフェクション試薬、還元血清培地、CRISPRプラスミドDNA、およびレンチウイルスパッケージングミックスを室温で平衡化します。
   2. トランスフェクション試薬75 μL、還元血清培地2500 μL、および全DNA25 μgを混合します(CRISPRプラスミドDNAの分光光度計分析に基づく計算と、レンチウイルスパッケージングミックスによる1:1:1:1の比率)。
   3. この混合物を室温で15〜30分間インキュベートします。この混合物の全容量をコンフルエントHEK293Tセルプレートに慎重にピペットで入れます(培地を交換する必要はありません)。
4. プレートを静かに渦巻かせて、トランスフェクションミックスとプレート培地が適切に均質化されるようにします。プレートを37°Cで48時間インキュベートします。

3. U937細胞または標的細胞のレンチウイルス形質導入

1. 37^°C での48時間インキュベーションが完了したら、培地をプロデューサー HEK293Tセルプレートから15 mLのコニカルチューブに移します。
2. 容量を800 x g で室温で5分間遠心分離し、残りのHEK293T細胞をペレット化します。ペレット化されたHEK293T細胞を乱さないように注意しながら、ウイルスを含む上清をすべて取り除き、別の15mLの円錐管に保管します。次に、ペレット含有チューブを除染し、適切なバイオハザード廃棄物容器に廃棄します。
   注:HIVベースのレンチウイルス上清は-80°Cで保存できます。ただし、これを行うと、最初の凍結/融解サイクル¹⁹後にウイルスの安定性が最大55%失われるリスクがあります。
3. 室温で400 x gの適切な容量を10分間遠心分離することにより、15 mLのコニカルチューブに2個×10個の⁶ U937細胞のペレットをカウントして取得し、上清をデカンタントして、細胞ペレットをチューブ内に残します。
4. U937細胞ペレットをすべてのウイルス含有上清で再懸濁し、チューブを290 x g で60分間遠心分離します。
5. 遠心分離後、ピペットを使用して、ウイルス含有上清がすでにチューブ内にあるペレットを再懸濁します。
6. チューブをエンドオーバーエンドローテーター(または同様の回転装置)に60分間置きます。
   1. このインキュベーション後、チューブを400 x g で室温で10分間遠心分離し、細胞をペレット化します。
   2. ウイルス含有上清と10%熱不活化FBSを添加した完全なRPMI-1640培地の両方を1:1の比率で混合した培地で細胞ペレットを再懸濁します。
7. 細胞混合物を10 cmの組織培養プレートに移し、37°Cで48時間インキュベートします。
8. このインキュベーション後、U937細胞を400 x g で10分間遠心分離し、上清を除去します。
   1. 10%熱不活化FBSと5 μg/mLのピューロマイシンを添加した完全なRPMI-1640培地でペレットを再懸濁し、細胞をT25フラスコに移します。
   2. 細胞を手つかずで37°Cで2〜3週間インキュベートし、細胞増殖の兆候がないか1〜2日ごとに確認するようにしてください。
      注:細胞がコンフルエントになり、最初の継代後に健康なターンオーバー時間を持つようになったら、完了したプロトコルの有効性についてテストできます。

4. ウェスタンブロット解析を用いた RIP1 CRISPR変異細胞の作製における完成プロトコールの有効性の検証

1. 野生型(WT)U937単球、ノンターゲティングコントロール(NTC)CRISPR細胞、およびRIP1 CRISPR変異体細胞11,12,13の細胞タンパク質ライセートを作製する。
2. これらのライセートをSDS-PAGEゲル上で分析し、ウェスタンブロット解析¹⁴に進みます。
   1. 最初にサンプルをハウスキーピングタンパク質に正規化します。
   2. 標準化後、RIP1タンパク質の発現レベルについてサンプルを分析し、 RIP1 CRISPR変異細胞株¹⁴の作製成功を適切に判断します。
3. ウェスタンブロット解析のコンフォメーションに従って、細胞を実験目的に使用することができます。

RIP1 CRISPR変異U937細胞のコンフルエント集団の作製に続いて、SDS-PAGEおよびウェスタンブロット分析を行った。ウェスタンブロット解析を使用して、RIP1タンパク質発現レベルの損失を評価することにより、RIP1 CRISPR変異細胞株の作製に成功しました。この決定は、WT U937単球とNTC細胞との比較結果に基づいて行われました。図2では、RIP1の発現は5 μg/mLのピューロマイシンRIP1 CRISPR変異体細胞では検出されませんでしたが、WT U937細胞とNTC細胞の両方で検出されました。この結果は、このプロトコルが生存可能なRIP1 CRISPR変異体を選択するための信頼性と効果的な方法であることを示しています。

RIP1 CRISPR変異体細胞におけるRIP1タンパク質発現の喪失が成功したことから、これがRIP1の機能的喪失にも等しいかどうかを判断しました。以前に確立された研究では、腫瘍壊死因子-α (TNF-α)、シクロヘキシミド、および汎カスパーゼ阻害剤 zVAD-fmk の組み合わせは、TCZ^11,14 と略されるネクロプトーシスの直接的な刺激です。図3に見られるように、TCZ処理によるネクロトーシスティック細胞死の誘導は、既知のRIP1阻害剤であるネクロスタチン-1s(nec-1s)による治療後に、WT U937単球とNTC細胞株の両方で元に戻ります。しかし、RIP1 CRISPR変異体細胞については、TCZ処理により、WT細胞やNTC細胞と比較して細胞死が有意に減少しました。その後のnec-1sによる治療は、RIP1 CRISPR変異細胞に効果を示さず、ネクロプトーシスおよびRIP1機能が存在しないことを示している。

これらの RIP1 CRISPR変異体細胞内のRIP1機能の喪失をさらに評価するために、DNA Hoecsht染色(青色蛍光)およびミトコンドリアスーパーオキシド染色(赤色蛍光)を用いて生細胞蛍光顕微鏡を実施した。これらの実験により、ネクロプトーシス中のミトコンドリアスーパーオキシド産生の以前に確立された増加がこれらの細胞で失われるかどうかを判断することができました。RIP1は、細胞代謝と直接相互作用し、ミトコンドリアのスーパーオキシド産生を有意に増加させることが知られています。この細胞内のスーパーオキシドの存在量は、RIP1の活性化とネクロプトーシスの下流の実行による正のフィードバックループを作り出します。 図4に見られるように、TCZによる処理では、WT U937単球とNTC細胞の両方でミトコンドリアのスーパーオキシド産生が豊富に見られましたが、 RIP1 CRISPR変異体細胞では見られませんでした。その後のnec-1による治療により、WT U937単球とNTC細胞の両方で赤色蛍光染色が有意に減少し、 RIP1 CRISPR変異体細胞に変化は観察されませんでした。

図1:CRISPR/Cas9プロトコルの概略モデル。 このプロトコル内で提供されるさまざまな手順を視覚的に表現し、理解しやすくします。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:ウェスタンブロット解析により、RIP1 CRISPR変異体細胞におけるRIP1タンパク質発現の喪失が確認されました。RIP1 CRISPR変異U937細胞における5 μg/mLピューロマイシン選択では、WT U937細胞およびNTC細胞と比較した場合、RIP1タンパク質の発現が失われました。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:細胞生存率アッセイは、RIP1 CRISPR変異細胞におけるRIP1の機能喪失を示しています。ネクロプトーティック細胞死は、TCZによる治療により誘導され、その後のnec-1sによる治療により解析されました。WT U937単球とNTC細胞はどちらも、nec-1sによる治療後に細胞死の有意な減少を示しました。RIP1 CRISPR変異細胞は、TCZで処理した場合、細胞死がはるかに少なく、その後nec-1で処理した場合も変化は示されませんでした。示されている結果は、3つの独立した実験からのものです。エラーバーは標準偏差を表します。Bonferroni の検定後 ***p による二元配置分散分析 < 0.001。ns = 統計的に有意ではありません。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:蛍光顕微鏡を用いたRIP1 CRISPR変異細胞におけるRIP1の下流機能解析。(A)ミトコンドリアのスーパーオキシド染色(赤色蛍光)の測定では、nec-1s処理後のWT U937単球とNTC細胞の両方でスーパーオキシド産生の減少が示されました。RIP1 CRISPR変異細胞は、TCZで処理した場合、ミトコンドリアスーパーオキシドの産生を示さず、その後nec-1で処理した場合も変化を示さなかった。スケールバー:100μm.(B)(A)で表される結果の平均蛍光強度定量化。示されている結果は、3つの独立した実験からのものです。エラーバーは標準偏差を表します。Bonferroni 事後検定による二元配置分散分析、***p < 0.001。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

表1:ガイドRNA(gRNA)と標的配列。

このプロトコルは、レンチウイルストランスフェクションとRIP1ノックアウトU937細胞株を作成するための形質導入の効率と信頼性の潜在的な落とし穴について詳細な指示と分析を提供することを目的としています。このトランスフェクションおよび形質導入の方法は、手間と時間がかかりますが、一般に、選択したgRNAおよびCas9エンドヌクレアーゼをトランスフェクションが困難な^{細胞株8,9,20}に組み込む効率的な方法であると考えられています。U937細胞やその他の免疫細胞のような単球と同様に、トランスフェクションは外来核酸を認識して応答する先天的なセンサーを持っているため、トランスフェクションを行うことは本質的に困難です。これは、外来核酸に応答して、核酸の破壊/超突然変異、転写抑制、および/または細胞死につながる可能性があります²¹。

この導入方法は、トランスフェクションが容易で広く受け入れられている接着性ヒト胚性腎臓細胞株であるHEK293T細胞であるレンチウイルス粒子を製造できる細胞株を使用してのみ可能です^9,10。この情報を使用して、この手順で最も重要な手順を概説し、注意して処理する必要があります。細胞の培養とモニタリングは最も重要です。この研究では、増殖が速く使いやすい浮遊ヒト単球であるgRNAおよびCas9の標的細胞株としてU937細胞を使用した²²。成長の早い細胞の多くがそうであるように、細胞が生い茂りすぎて期待通りの実験が行わなくなるのを防ぐためには、細胞の定期的な維持と継代が重要です。同じ概念が、このプロトコルのHEK293T細胞にも当てはまります。これらの細胞株が適切に維持され、プロトコルでの使用中に健康でコンフルエントな状態に保たれるようにすることは、効率的なレンチウイルス産生に不可欠です。この手順のもう1つの重要なステップは、適切な濃度のトランスフェクション試薬と、レンチウイルスパッケージングミックスに対するCRISPRプラスミドDNAの比率を使用することです。これらの数学的比率は、この分析法でいくつかの異なる濃度で経験的にテストされており、リストされた値はHEK293T細胞のトランスフェクションにとって重要です。

ほとんどの考案された方法と手順と同様に、確立された実用的な実験プロセスにはかなりの量のトラブルシューティングがあります。ここで他の受け入れられたプロトコルで決定された問題の1つは、U937細胞の短い形質導入ステップに続くピューロマイシンの即時の課題です。形質導入ステップは2個×10個の⁶ 個のU937細胞のみを利用するため、培地の半分が完全なRPMI-1640に10%の熱不活化FBSを添加した完全な48時間のインキュベーションにより、この RIP1 CRISPR変異細胞株の生成が促進されることが経験的に決定されました。介入せずに細胞に5μg/mLのピューロマイシンを連続的に投与すると、2〜3週間後には生きた健康なU937細胞が培養液に現れ始めました。このプロトコールは時間がかかるため、このトランスフェクションおよび形質導入ステップの複数回の反復には、いくつかの回復可能な培養があります。培養物がコンフルエントになると、SDS-PAGEおよびウェスタンブロッティング技術を通じてプロトコールの有効性を確認できます。 RIP1 CRISPR変異細胞株の単離と確認が成功した後でも、タンパク質ライセートベースのSDS-PAGEのルーチンモニタリングと、RIP1タンパク質発現の細胞損失に関するウェスタンブロット分析を行い、これらの細胞を実験に継続的に使用することが望ましいでしょう。

経験的トラブルシューティングのもう一つの理由は、免疫細胞株とのトランスフェクション試薬の使用に関する簡単な情報がないことです。企業から入手可能な情報とプロトコールの間では、このプロトコールで使用されるトランスフェクション試薬のDNAに対する濃度ベースの比率に関して矛盾する情報があります。それぞれ5:1から3:1の範囲を試みましたが、3:1が最大比率であると判断しました。そうしないと、HEK293T細胞でのトランスフェクションが効率的に完了しません。この選択に加えて、CRISPRプラスミドDNAの単一反復を低容量で行うだけでは、10 cmプレートのHEK293T細胞を完全にトランスフェクションするには不十分であると判断されました。プラスミド精製キットは、大腸菌から大量のCRISPRプラスミドDNAを採取し、すべてのトランスフェクション成分の量を増加させるため、形質導入後のU937細胞を回収するためのトランスフェクション効率が5倍向上しました。プロトコル内のこれらのコンポーネントにリストされているボリュームは、受け入れられたプロトコルからの1回の反復から5倍の増加を表しています。トランスフェクション試薬の比率とこれらの成分に使用された総量の変化により、CRISPRプラスミドDNAを濃縮したり、超遠心分離機を使用したりすることなく、プロトコルが考案されました。しかし、これらの材料が利用可能な場合、単離されたCRISPRプラスミドDNAは、確立された方法を使用して濃縮することができ、それにより、このプロトコル^23,24の他の成分の必要量を減少させることができる。

レンチウイルストランスフェクション法を使用する場合、CRISPR/Cas9遺伝子編集での使用には制限があります。最も顕著な制限は、このプロトコル^9,20の時間と労働要件です。この手順には、一時停止できるステップが2つだけ含まれていますが、トランスフェクションが困難な細胞株に最適化されています。U937単球のようなトランスフェクションが困難な細胞株の場合、プラスミドの化学的媒介導入を含む典型的なトランスフェクション法は、レンチビラールベースの導入ほど効果的ではない²⁵。

より広範な研究対象は、U937単球におけるアポトーシスからネクロプトーシスへの高血糖シフトに焦点を当てており、このプロセス中の機構的理解のためにRIP1の機能的ノックアウトが必要であることを強調しています。RIP1はネクロプトーシスの実行において重要なタンパク質であるため、細胞内でのそのすべての機能とタンパク質相互作用を理解することは不可欠です11,12,13,14。このプロトコルの将来の方向性には、これらの方法をアポトーシスからネクロプトーシスへの高血糖シフトに関するさらなる調査と実験に適用することが含まれます。このプロトコールは、CRISPR/Cas9システムを用いた様々なgRNA標的に対するレンチウイルストランスフェクションおよび浮遊細胞を用いた形質導入法に広く適用できると期待されており、U937細胞やRIP1の機能ノックアウトを超えて拡張されます。

何一つ。

この研究は、国立衛生研究所 (NIH) の国立心臓・肺・血液研究所 (NHLBI) から資金提供を受け、助成金番号 NIH 2R15-HL135675-02 から T.J.L に授与されました。