Generierung einer RIP1-Knockout-U937-Zelllinie mit dem CRISPR-Cas9-System

Da CRISPR-bezogene Protokolle immer nützlicher und zugänglicher werden, können unter bestimmten experimentellen Bedingungen immer noch Komplikationen und Hindernisse auftreten. Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung einer Rezeptor-interagierenden Serin/Threonin-Proteinkinase 1 (RIPK1/RIP1) Knockout-Zelllinie unter Verwendung von CRISPR/Cas9 und hebt mögliche Herausforderungen hervor, die während dieses Prozesses auftreten.

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Ausschaltung des RIP1-Gens mittels CRISPR/Cas9 in der humanen Monozyten-Zelllinie U937. Die Methode verwendet designierte Guide-RNA-Plasmide und lentivirale Verpackungsplasmide, um einen RIP1-Gen-Knockout zu erreichen. Das Protokoll befasst sich mit Herausforderungen und Verbesserungen traditioneller CRISPR-Methoden und ermöglicht deren Replikation für zukünftige Zelltodstudien. Die so entstandenen mutierten Zellen können verwendet werden, um mechanistische Veränderungen des Zelltods zu untersuchen, bei denen sonst funktionelle RIP1-Proteine eine Rolle spielen würden. Viabilitätsassays zeigten eine signifikante Verringerung des Zelltods in Knockout-Zellen nach Nekroptose-Induktion. Die Fluoreszenzmikroskopie zeigte unter gleichen Bedingungen eine deutliche Abnahme der mitochondrialen reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) in Knockout-Zellen. Zusammen bestätigen diese funktionellen Assays den Verlust des RIP1-Proteins. Dieses Verfahren ist für die Verwendung mit humanen U937-Monozyten optimiert und kann auch so angepasst werden, dass es auf andere wichtige Zelltodregulatoren abzielt, wodurch funktionelle, nicht-letale Mutanten entstehen. Potenzielle Fallstricke werden durchgehend angesprochen, um Einblicke in die Herausforderungen zu geben, die bei der Mutantengenerierung auftreten können.

Der Einsatz der CRISPR/Cas9-Gen-Editing-Technologie hat sich seit ihrer Entdeckung rasant weiterentwickelt ^1,2,3. Die Fähigkeit, Gene in Zelllinien oder Bakterien einzu- oder auszuknocken, ist von unschätzbarem Wert für die Förderung der Forschung und das Verständnis intrazellulärer Mechanismen 1,2,3,4,5,6. Das CRISPR-Cas9-System verbessert frühere Gen-Editing-Methoden, wie z. B. die Transkriptionsaktivator-ähnliche Effektornuklease (TALEN), indem es die Entwicklung der Genspezifität vereinfacht. Dieses Verfahren umfasst zwei grundlegende Komponenten: die Guide-RNA (gRNA), die zur Lokalisierung des beabsichtigten Genziels verwendet wird, und Cas9, eine Endonuklease, die die vorgesehene Genomposition mit einem doppelsträngigen DNA-Bruch modifiziert ^3,4. Die gRNA dient als Leitfaden für die Cas9-Endonuklease, um den Doppelstrangbruch an der beabsichtigten genetischen Sequenz durch Watson-Crick-Basenpaarung zu lokalisieren und zu initiieren. Der gesamte Prozess der Genom-Editierung durch das CRISPR/Cas9-System umfasst die zelluläre Maschinerie, die diese doppelsträngigen Brüche in der DNA durch nicht-homologe Endverbindung (NHEJ) oder homologe Rekombination repariert ^3,7. Es ist wahrscheinlicher, dass NHEJ auftritt und effektiv eine Mutation im Genom erzeugt, die zu einem Expressionsverlust für das Zielgen ^3,4 führt.

Kommerzielle Quellen waren in der Lage, Bibliotheken von gRNA-Zielen zu erstellen, die durch Bakterienwachstum und -isolierung exprimiert werden können, was ihre Benutzerfreundlichkeit erheblich verbessert. Die Haupteinschränkung des CRISPR/Cas9-Systems ist jedoch die Schwierigkeit, die gRNA und den Cas9-Komplex in die Zielzelllinien zu bringen. Diese Einschränkungen treten bei Suspensionszelllinien auf, da sie allgemein als schwer zu transfizieren⁸ bezeichnet werden. Typische Transfektionsmethoden sind in der Regel nicht effizient bei der Verabreichung des CRISPR/Cas9-Systems in Suspensionszellen, weshalb virale Verabreichungsmethoden wie die lentivirale Transfektion und Transduktion für diese Art von Zelllinie besser geeignet sind ^8,9.

Diese Art der Transfektion erfordert einen lentiviralen Vektor, der für die gRNA und die Cas9-Endonuklease kodiert, zusammen mit hinzugefügten lentiviralen Verpackungsplasmiden, die in eine Zelllinie transfiziert werden, die in der Lage ist, lentivirale Partikel herzustellen. Eine typischerweise gewählte Zelllinie für diesen Prozess sind HEK293T Zellen, da sie leichter zu transfizieren sind und sehr effizient beim Assemblieren von gRNA und Cas9^{arbeiten 9,10}. Diese Partikel werden dann als Lentiviren in den Überstand freigesetzt, mit dem die gRNA und Cas9 in die vorgesehene Suspensionszelllinie, wie z. B. U937 menschliche Monozyten, transduziert werden können. Daher weist das hier beschriebene Verfahren im Vergleich zu etablierten Methoden die folgenden Änderungen auf: (1) Alternative Transfektionsmethode für schwer zu transfizierende Zelllinien; (2) Es ist nicht erforderlich, CRISPR-Plasmid-DNA zu konzentrieren oder Ultrazentrifuge zu verwenden; und (3) Es macht die Klonierung einzelner Zellen überflüssig.

Der direkte Fokus dieses Artikels lag auf dem Knockout des RIP1-Gens in menschlichen U937-Monozyten. Die kanonische Form des hochinflammatorischen Zelltodwegs Nekroptose wird durch RIP1 kontrolliert, das als zentrales Ziel für Zelltodstudien dient. 11,12,13,14 Wenn RIP1 durch Autophosphorylierung aktiv wird, rekrutiert es die direkte Phosphorylierung und Aktivierung der Rezeptor-interagierenden Serin/Threonin-Proteinkinase 3 (RIPK3/RIP3) und der gemischten Kinase-Domänen-ähnlichen (MLKL) Pseudokinase, um das Nekrosom zu bilden. Nach dieser Bildung kann sich das Nekrosom frei in der Zelle bewegen, um mit Organellen wie den Mitochondrien zu interagieren ^12,13. In den Mitochondrien potenziert RIP1 eine positive Rückkopplungsschleife mit dem Zellstoffwechsel, die sich direkt auf die Produktion von mitochondrialen ROS auswirkt, was wiederum die weitere Autophosphorylierung von RIP1, die Bildung von Nekrosomen und die nachgeschaltete Ausführung der Nekroptose^fördert 11,12,13,14.

Während der Fokus der aktuellen Forschungsgruppe auf der Rolle von RIP1 beim Zelltod liegt, sind andere Gründe, RIP1 zu untersuchen, seine Rolle bei Entzündungen und Infektionen. Nach der Aktivierung durch Todesrezeptoren wie TNF-Rezeptoren fördert RIP1 die Aktivierung des NF-κB-Signalwegs, der die Transkription von proinflammatorischen Zytokinen, Chemokinen und anderen Molekülen auslöst, die für die Rekrutierung von Immunzellen und die Verstärkung der Entzündungsreaktion essentiell sind¹⁵. Neben der NF-κB-Aktivierung kann RIPK1 auch MAPK-Signalwege aktivieren, was die Entzündung weiter verstärkt^15,16. In Bezug auf seine Rolle bei der Reaktion auf eine Infektion fungiert RIP1 als zentraler Mediator der Entzündungsreaktion des Wirts, insbesondere als Reaktion auf pathogen-assoziierte molekulare Muster (PAMPs), die von Mustererkennungsrezeptoren (PRRs) wie Toll-like-Rezeptoren (TLRs)¹⁷ erkannt werden. Darüber hinaus wird RIP1 während der Sepsis durch Signalübertragung über Todesrezeptoren wie den TNF-Rezeptor aktiviert, was zur Initiierung von proinflammatorischen Kaskaden führt. RIPK1 vermittelt die Aktivierung des NF-κB- und des MAPK-Signalwegs und fördert die Produktion von proinflammatorischen Zytokinen wie TNF-α, IL-1β und IL-6, die Schlüsselfaktoren für die systemische Entzündungsreaktion sind, die für Sepsis^{charakteristisch ist 18}.

Eine schematische Darstellung des Verfahrens ist in Abbildung 1 dargestellt. Die Leit-RNA (gRNA) und die Zielsequenz sind in Tabelle 1 angegeben. Einzelheiten zu den verwendeten Reagenzien und den verwendeten Geräten sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Ernte eines RIP1-targetingden CRISPR gRNA lentiviralen Expressionsvektors, der Cas9-Endonuklease und Puromycin-Resistenz aus Escherichia coli enthält

1. Quadrantenstreifen-E. coli, die lentivirale Vektor-gRNAauf LB-Agarplatten beherbergen, ergänzt mit 100 μg/ml Ampicillin.
2. Inkubieren Sie die Platten bei 37°C für 1-2 Tage, bis einzelne Kolonien im am stärksten verdünnten Bereich der Platte sichtbar sind.
3. Wählen Sie eine einzelne Kolonie mit einer sterilen Schleife aus und geben Sie jede Kolonie einzeln zu 5 ml LB-Bouillon, ergänzt mit 100 μg/ml Ampicillin, in ein konisches 50-ml-Röhrchen. Stellen Sie sicher, dass Sie nach dem Hinzufügen der einzelnen Kolonie gründlich auf und ab pipettieren, um eine Homogenisierung zu gewährleisten.
4. Entlüften und kleben Sie die Kappe des konischen 50-ml-Röhrchens ab und inkubieren Sie es 8 Stunden lang bei 37 °C und 225 U/min in einem Orbitalschüttler.
5. Während der 8-stündigen Inkubation bei 37 °C werden 40 ml LB-Bouillon, ergänzt mit 100 μg/ml Ampicillin, in jedes der vier separaten konischen 50-ml-Röhrchen gegeben.
6. Nach der 8-stündigen Inkubation bei 37°C werden 40 μl gezüchtetes E entnommen.coli-Kultur und geben Sie es in alle vier konischen 50-ml-Röhrchen.
7. Entlüften und kleben Sie die Kappen der konischen 50-ml-Röhrchen ab und inkubieren Sie sie in einem Orbitalschüttler bei 37 °C und 225 U/min für 12-16 Stunden.
8. Nach dieser Inkubation bei 37°C werden alle Röhrchen bei 3220 x g in einem schwingenden Schaufelrotor für 20 Minuten heruntergeschleudert, um die gezüchteten E. coli-Bakterien zu pelletieren.
9. Überstände in ein Abfallbecherglas umfüllen, dann alle vier Pellets in 10 ml LB-Bouillon mit 100 μg/ml Ampicillin mischen.
10. Schleudern Sie die kombinierten Pellets erneut mit maximaler Drehzahl in einem schwingenden Schaufelrotor für 20 Minuten, um ein einzelnes Pellet zu erhalten.
11. Entsorgen Sie so viel Überstände wie möglich in das Abfallbecherglas und fahren Sie mit einer der folgenden Optionen fort: (1) Nasses Granulat bei -80° bis zu 1 Monat einfrieren. (2) Fahren Sie mit der Reinigung des lentiviralen Vektorplasmids fort.
    HINWEIS: Wenn Option 1 gewählt wird, kann das Protokoll hier pausiert werden.

2. Transfektion von HEK293T Zellen mit aufgereinigtem lentiviralem CRISPR-gRNA-Expressionsvektor, der auf RIP1 abzielt

1. Zellen HEK293T über Nacht in einer Konzentration von 3 × 10⁶ bis 5 × 10⁶ Zellen in eine 10 cm dicke Platte säen, die DMEM mit 4,5 g/l D-Glucose, L-Glutamin, 110 mg/l Natriumpyruvat und 10 % hitzeinaktiviertem FBS enthält.
2. Stellen Sie am nächsten Tag sicher, dass die Platten eine Konfluenz von etwa 70 % bis 90 % aufweisen, und fahren Sie dann mit dem Protokoll fort.
3. Richten Sie die Transfektion der Zellen mit einem Verhältnis von 1:1:1:1 von Plasmiden (experimentelles CRISPR-Plasmid: pLP1: pLP2: pLP/VSVG) unter Verwendung des Transfektionsreagenzes im Verhältnis 3:1 (3 Teile Reagenz: 1 Teil Plasmid-DNA) zusammen mit reduziertem Serummedium ein.
   HINWEIS: Der pLP1: pLP2: pLP/VSVG-Anteil des Verhältnisses ist eine lentivirale Verpackungsmischung.
   1. Das Transfektionsreagenz, das reduzierte Serummedium, die CRISPR-Plasmid-DNA und die lentivirale Verpackungsmischung vor dem Aufbau der Transfektion auf Raumtemperatur äquilibrieren.
   2. Mischen Sie 75 μl des Transfektionsreagenzes, 2500 μl reduziertes Serummedium und 25 μg Gesamt-DNA (Berechnung basierend auf der Spektrophotometeranalyse für CRISPR-Plasmid-DNA und einem Verhältnis von 1:1:1:1 mit lentiviraler Verpackungsmischung).
   3. Lassen Sie diese Mischung 15-30 min bei Raumtemperatur inkubieren. Pipettieren Sie vorsichtig das gesamte Volumen dieser Mischung auf die konfluente HEK293T Zellplatte direkt in das Medium (kein Medienwechsel erforderlich).
4. Schwenken Sie die Platte vorsichtig, um eine ausreichende Homogenisierung der Transfektionsmischung und des Plattenmediums zu gewährleisten. Die Platte bei 37 °C 48 h inkubieren.

3. Lentivirale Transduktion von U937-Zellen oder Zielzellen

1. Sobald die 48-stündige Inkubation bei 37 ^°C abgeschlossen ist, überführen Sie das Medium vom Produzenten HEK293T der Zellplatte in ein konisches 15-ml-Röhrchen.
2. Das Volumen wird bei 800 x g 5 Minuten lang bei Raumtemperatur zentrifugiert, um die verbleibenden HEK293T Zellen zu pelletieren. Entfernen Sie alle virushaltigen Überstände, achten Sie darauf, die pelletierten HEK293T Zellen nicht zu stören, und bewahren Sie sie in einem separaten konischen 15-ml-Röhrchen auf. Dekontaminieren Sie dann das pellethaltige Rohr und entsorgen Sie es in den entsprechenden Behälter für biologisch gefährliche Abfälle.
   HINWEIS: HIV-basierte Lentivirus-Überstände können bei -80 °C gelagert werden; Dies birgt jedoch das Risiko eines Verlusts der Virusstabilität von bis zu 55 % nach dem ersten Frost-/Auftauzyklus¹⁹.
3. Ein Pellet von 2 × 10⁶ U937-Zellen wird in einem konischen 15-ml-Röhrchen gezählt und erhalten, indem ein geeignetes Volumen bei 400 x g für 10 min bei Raumtemperatur zentrifugiert und der Überstand dekantiert wird, wobei das Küvettenpellet im Röhrchen verbleibt.
4. Resuspendieren Sie das U937-Zellpellet mit dem gesamten virushaltigen Überstand und zentrifugieren Sie das Röhrchen dann bei 290 x g für 60 min.
5. Nach der Zentrifugation wird das Pellet mit einer Pipette wieder suspendiert, wobei sich der virushaltige Überstand bereits im Röhrchen befindet.
6. Legen Sie das Rohr für 60 Minuten auf einen End-over-End-Rotator (oder eine ähnliche rotierende Vorrichtung).
   1. Nach dieser Inkubation zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 400 x g für 10 min bei Raumtemperatur, um die Zellen zu pelletieren.
   2. Resuspendieren Sie das Zellpellet mit einer Medienmischung im Verhältnis 1:1 aus virushaltigen Überständen und vollständigem RPMI-1640-Medium, das mit 10 % hitzeinaktiviertem FBS ergänzt wird.
7. Die Zellmischung auf eine 10 cm große Gewebekulturplatte umfüllen und 48 h bei 37°C inkubieren.
8. Nach dieser Inkubation werden die U937-Zellen 10 Minuten lang bei 400 x g zentrifugiert und der Überstand entfernt.
   1. Resuspendieren Sie das Pellet mit vollständigem RPMI-1640-Medium, das mit 10 % hitzeinaktiviertem FBS und 5 μg/ml Puromycin ergänzt ist, und überführen Sie die Zellen in einen T25-Kolben.
   2. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C 2-3 Wochen lang unberührt und stellen Sie sicher, dass sie alle 1-2 Tage auf Anzeichen von Zellwachstum überprüft werden.
      HINWEIS: Sobald die Zellen konfluent werden und nach einer ersten Passage eine gesunde Umsatzzeit haben, können sie auf die Wirksamkeit des abgeschlossenen Protokolls getestet werden.

4. Prüfung der Wirksamkeit des abgeschlossenen Protokolls bei der Herstellung von RIP1-CRISPR-Mutantenzellen mittels Western-Blot-Analyse

1. Erzeugung zellulärer Proteinlysate von Wildtyp-(WT) U937-Monozyten, Non-Targeting-Kontroll-CRISPR-Zellen (NTC) und den RIP1-CRISPR-Mutantenzellen 11,12,13.
2. Führen Sie diese Lysate auf einem SDS-PAGE-Gel durch und fahren Sie mit der Western-Blot-Analyse^{fort 14}.
   1. Normalisieren Sie die Proben zuerst auf ein Haushaltsprotein.
   2. Nach der Normalisierung sind die Proben auf RIP1-Proteinexpressionsniveaus zu analysieren, um den Erfolg der Erzeugung einer RIP1-CRISPR-Mutantenzelllinie angemessen zu bestimmen¹⁴.
3. Nach der Konformation der Western-Blot-Analyse können die Zellen für Experimentierzwecke verwendet werden.

Nach der Produktion einer konfluenten Population von RIP1-CRISPR-mutierten U937-Zellen wurden SDS-PAGE- und Western-Blot-Analysen durchgeführt. Die Western-Blot-Analyse wurde verwendet, um die erfolgreiche Bildung einer RIP1-CRISPR-Mutantenzelllinie zu bestimmen, indem der Verlust der RIP1-Proteinexpressionsniveaus bewertet wurde. Diese Bestimmung erfolgte auf der Grundlage des Vergleichsergebnisses von WT U937-Monozyten und NTC-Zellen. In Abbildung 2 wurde die Expression von RIP1 für die 5 μg/ml Puromycin RIP1 CRISPR-Mutantenzellen nicht nachgewiesen, sondern sowohl für die WT U937- als auch für die NTC-Zellen. Dieses Ergebnis zeigt, dass dieses Protokoll eine zuverlässige und effektive Methode zur Selektion einer lebensfähigen RIP1-CRISPR-Mutante ist.

Mit dem erfolgreichen Verlust der RIP1-Proteinexpression in den RIP1-CRISPR-Mutantenzellen konnten wir dann feststellen, ob dies auch mit einem funktionellen Verlust von RIP1 einhergeht. In zuvor etablierten Studien ist eine Kombination aus Tumornekrosefaktor-alpha (TNF-α), Cycloheximid und Pan-Caspase-Inhibitor zVAD-fmk ein direkter Stimulus der Nekroptose, der als TCZ^11,14 abgekürzt wird. Wie in Abbildung 3 zu sehen ist, ist die Induktion des nekrotischen Zelltods bei der TCZ-Behandlung nach der Behandlung mit dem bekannten RIP1-Inhibitor Necrostatin-1s (nec-1s) sowohl in den WT U937-Monozyten als auch in der NTC-Zelllinie rückgängig gemacht. Bei den RIP1-CRISPR-mutierten Zellen führte die TCZ-Behandlung jedoch zu einem signifikanten Verlust des Zelltods im Vergleich zu WT- und NTC-Zellen. Die anschließende Behandlung mit nec-1s hatte keine Auswirkungen auf RIP1-CRISPR-mutierte Zellen, was auf das Fehlen von Nekroptose und RIP1-Funktion hinweist.

Um den Verlust von RIP1-Funktionen in diesen RIP1-CRISPR-Mutanten weiter zu untersuchen, wurde eine Lebendzell-Fluoreszenzmikroskopie mit einer DNA-Hoecsht-Färbung (blaue Fluoreszenz) und einer mitochondrialen Superoxid-Färbung (rote Fluoreszenz) durchgeführt. Diese Experimente ermöglichten es uns festzustellen, ob die zuvor festgestellte Erhöhung der mitochondrialen Superoxidproduktion während der Nekroptose in diesen Zellen verloren geht. Es ist bekannt, dass RIP1 direkt mit dem Zellstoffwechsel interagiert und die mitochondriale Superoxidproduktion signifikant erhöht. Diese Fülle an Superoxid in der Zelle erzeugt wiederum eine positive Rückkopplungsschleife mit der Aktivierung von RIP1 und der nachgeschalteten Ausführung der Nekroptose. Wie in Abbildung 4 zu sehen ist, zeigte die Behandlung mit TCZ eine Fülle von mitochondrialen Superoxidproduktionen sowohl in den WT U937-Monozyten als auch in den NTC-Zellen, nicht jedoch in den RIP1-CRISPR-Mutantenzellen. Die anschließende Behandlung mit nec-1s führte zu einer signifikanten Abnahme der roten Fluoreszenzfärbung sowohl bei den WT U937-Monozyten als auch bei den NTC-Zellen, wobei bei den RIP1-CRISPR-Mutantenzellen keine Veränderung beobachtet wurde.

Abbildung 1: Schematisches Modell des CRISPR/Cas9-Protokolls. Visuelle Darstellung der verschiedenen Schritte, die in diesem Protokoll bereitgestellt werden, um das Verständnis zu erleichtern. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Western-Blot-Analyse bestätigt Verlust der RIP1-Proteinexpression in RIP1-CRISPR-mutierten Zellen. Die Expression des RIP1-Proteins ging bei einer 5 μg/ml-Puromycin-Selektion in RIP1-CRISPR-mutierten U937-Zellen im Vergleich zu WT U937-Zellen und NTC-Zellen verloren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Der Zellviabilitätsassay zeigt den Funktionsverlust von RIP1 in RIP1-CRISPR-mutierten Zellen. Der nekrotische Zelltod wurde durch die Behandlung mit TCZ induziert und durch die anschließende Behandlung mit nec-1s analysiert. Sowohl WT U937-Monozyten als auch NTC-Zellen zeigten nach der Behandlung mit nec-1s eine signifikante Abnahme des Zelltods. Die RIP1-CRISPR-mutierten Zellen zeigten einen deutlich geringeren Zelltod, wenn sie mit TCZ behandelt wurden, und zeigten keine Veränderungen, wenn sie anschließend mit nec-1s behandelt wurden. Die gezeigten Ergebnisse stammen aus 3 unabhängigen Experimenten. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung dar. Zwei-Wege-ANOVA mit Bonferroni-Nachtest ***p < 0,001. ns = nicht statistisch signifikant. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Nachgelagerte funktionelle Analyse von RIP1 in RIP1 CRISPR-Mutantenzellen mittels Fluoreszenzmikroskopie. (A) Die Messung der mitochondrialen Superoxid-Färbung (rote Fluoreszenz) zeigte eine Abnahme der Superoxidproduktion sowohl in WT U937-Monozyten als auch in NTC-Zellen nach nec-1s-Behandlung. Die RIP1-CRISPR-mutierten Zellen zeigten keine Produktion von mitochondrialem Superoxid, wenn sie mit TCZ behandelt wurden, und zeigten keine Veränderung, wenn sie anschließend mit nec-1s behandelt wurden. Maßstabsbalken: 100 μm. (B) Quantifizierung der mittleren Fluoreszenzintensität der in (A) dargestellten Ergebnisse. Die gezeigten Ergebnisse stammen aus 3 unabhängigen Experimenten. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung dar. Zwei-Wege-ANOVA mit Bonferroni nach dem Test, ***p < 0,001. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Tabelle 1: Guide-RNA (gRNA) und Zielsequenz.

Dieses Protokoll zielt darauf ab, eine detaillierte Anleitung und Analyse potenzieller Fallstricke in der Effizienz und Zuverlässigkeit der lentiviralen Transfektion und Transduktion zur Schaffung einer RIP1-Knockout-U937-Zelllinie bereitzustellen. Obwohl diese Methode der Transfektion und Transduktion arbeits- und zeitintensiv ist, wird sie im Allgemeinen als effiziente Methode angesehen, um die ausgewählte gRNA und Cas9-Endonuklease in schwer zu transfizierende Zelllinien einzubauen ^8,9,20. Wie bei Monozyten wie U937-Zellen und anderen Immunzellen gibt es eine inhärente Schwierigkeit bei der Durchführung der Transfektion, da sie angeborene Sensoren beherbergen, die fremde Nukleinsäuren erkennen und darauf reagieren. Dies kann zur Zerstörung/Hypermutation von Nukleinsäuren, zur transkriptionellen Repression und/oder zum Zelltod als Reaktion auf die fremden Nukleinsäuren führen²¹.

Diese Verabreichungsmethode ist nur unter Verwendung einer Zelllinie möglich, die in der Lage ist, lentivirale Partikel herzustellen, HEK293T Zellen, bei denen es sich um eine adhärente humane embryonale Nierenzelllinie handelt, die weithin als leicht zu transfizieren akzeptiert wird ^9,10. Mit diesen Informationen werden die kritischsten Schritte in diesem Verfahren skizziert, die mit Vorsicht behandelt werden müssen. Die Zellkultivierung und das Monitoring sind von größter Bedeutung. In dieser Studie wurden U937-Zellen als Zielzelllinie für die gRNA und Cas9 verwendet, bei denen es sich um schnell wachsende und einfach zu verwendende Suspensions-Monozyten^{handelt 22}. Wie bei den meisten schnell wachsenden Zellen ist die regelmäßige Pflege und Passage der Zellen wichtig, um zu verhindern, dass sie überwuchern und im Experimentieren nicht die erwartete Leistung erbringen. Das gleiche Konzept gilt für HEK293T Zellen in diesem Protokoll. Die Sicherstellung, dass diese Zelllinien während ihrer Verwendung im Protokoll ordnungsgemäß gepflegt und in einem gesunden, konfluenten Zustand gehalten werden, ist für eine effiziente lentivirale Produktion unerlässlich. Ein weiterer kritischer Schritt in diesem Verfahren ist die Verwendung der geeigneten Konzentrationen des Transfektionsreagenzes und des Verhältnisses von CRISPR-Plasmid-DNA zu lentiviraler Verpackungsmischung. Diese mathematischen Proportionen wurden mit dieser Methode empirisch unter verschiedenen Konzentrationen getestet, und die aufgeführten Werte sind entscheidend für die Transfektion HEK293T Zellen.

Wie bei den meisten entwickelten Methoden und Verfahren gibt es eine ganze Reihe von Fehlerbehebungen, die in den etablierten funktionierenden Experimentierprozess einfließen. Ein Problem, das hier mit anderen akzeptierten Protokollen festgestellt wurde, ist die unmittelbare Herausforderung von Puromycin nach einem kürzeren Transduktionsschritt für die U937-Zellen. Da für den Transduktionsschritt nur 2 × 10⁶ U937-Zellen verwendet werden, wurden volle 48 Stunden Inkubation mit der Hälfte des Mediums RPMI-1640, ergänzt mit 10% hitzeinaktiviertem FBS, empirisch bestimmt, um die Generierung dieser RIP1-CRISPR-Mutantenzelllinie zu erleichtern. Wenn die Zellen ohne Intervention kontinuierlich mit 5 μg/ml Puromycin provoziert wurden, erschienen nach 2-3 Wochen lebende und gesunde U937-Zellen in der Kultur. Da dieses Protokoll zeitintensiv ist, haben mehrere Iterationen dieses Transfektions- und Transduktionsschritts mehrere mögliche wiederherstellbare Kulturen. Sobald die Kulturen zusammenfließen, kann man die Wirksamkeit des Protokolls durch SDS-PAGE und westliche Blotting-Techniken überprüfen. Selbst nach erfolgreicher Isolierung und Bestätigung einer RIP1-CRISPR-mutierten Zelllinie wäre es gut beraten, eine routinemäßige Überwachung der Proteinlysat-basierten SDS-PAGE und eine Western-Blot-Analyse auf zellulären Verlust der RIP1-Proteinexpression durchzuführen, um diese Zellen kontinuierlich in Experimenten zu verwenden.

Ein weiterer Grund für die empirische Fehlersuche ist der Mangel an einfachen Informationen für die Verwendung von Transfektionsreagenzien mit Immunzelllinien. Zwischen den verfügbaren Informationen von Unternehmen und Protokollen gibt es widersprüchliche Informationen über ein konzentrationsbasiertes Verhältnis des in diesem Protokoll verwendeten Transfektionsreagenzes zur DNA. Bei dem Versuch von Bereichen von 5:1 bis 3:1 wurde festgestellt, dass 3:1 das maximal zu verwendende Verhältnis ist, da sonst die Transfektion mit den HEK293T Zellen nicht effizient abgeschlossen wird. Zusammen mit dieser Wahl wurde festgestellt, dass eine singuläre Iteration der CRISPR-Plasmid-DNA in niedrigeren Volumina nicht ausreichte, um eine 10-cm-Platte mit HEK293T Zellen vollständig zu transfizieren. Da das Plasmidaufreinigungskit ein großes Volumen an CRISPR-Plasmid-DNA aus E. coli liefert, wodurch das Volumen aller Transfektionskomponenten erhöht wird, ergab das 5-fache eine verbesserte Transfektionseffizienz bei der Rückgewinnung der U937-Zellen nach der Transduktion. Die Volumes, die für diese Komponenten im Protokoll aufgeführt sind, stellen eine 5-fache Steigerung gegenüber einer einzelnen Iteration von akzeptierten Protokollen dar. Zwischen diesen Änderungen des Transfektionsreagenzverhältnisses und des für diese Komponenten verwendeten Gesamtvolumens wurde das Protokoll entwickelt, ohne dass die CRISPR-Plasmid-DNA konzentriert werden musste oder die Verwendung einer Ultrazentrifuge erforderlich war. Wenn diese Materialien jedoch verfügbar sind, kann die isolierte CRISPR-Plasmid-DNA mit etablierten Methoden konzentriert werden, wodurch die erforderlichen Volumina anderer Komponenten dieses Protokolls verringert^{werden 23,24}.

Bei der Anwendung lentiviraler Transfektionsmethoden sind Einschränkungen bei der Verwendung bei der CRISPR/Cas9-Geneditierung festzustellen. Die bemerkenswerteste Einschränkung ist der Zeit- und Arbeitsaufwand für dieses Protokoll ^9,20. Das Verfahren umfasst nur zwei Schritte, in denen es pausiert werden kann, ist aber für schwer zu transfizierende Zelllinien optimiert. Bei schwer zu transfizierenden Zelllinien wie U937-Monozyten sind typische Transfektionsmethoden, einschließlich der chemisch vermittelten Einführung von Plasmiden, nicht so effektiv wie die lentivirale Verabreichung²⁵.

Das breitere Forschungsinteresse konzentriert sich auf die hyperglykämische Verschiebung von Apoptose zu Nekroptose in U937-Monozyten, wobei die Notwendigkeit eines funktionellen Knockouts von RIP1 für das mechanistische Verständnis während dieses Prozesses betont wird. Da RIP1 ein kritisches Protein bei der Durchführung von Nekroptose ist, ist es wichtig, alle seine Funktionen und Proteininteraktionen innerhalb der Zelle zu verstehen 11,12,13,14. Zukünftige Richtungen dieses Protokolls beinhalten die Anwendung dieser Methoden auf weitere Untersuchungen und Experimente bezüglich der hyperglykämischen Verschiebung von Apoptose zu Nekroptose. Es wird erwartet, dass dieses Protokoll breit anwendbar ist für lentivirale Transfektions- und Transduktionsmethoden mit Suspensionszellen für verschiedene gRNA-Ziele unter Verwendung des CRISPR/Cas9-Systems, das über U937-Zellen und den funktionellen Knockout von RIP1 hinausgeht.

Nichts.

Diese Forschung wurde vom National Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI) der National Institutes of Health (NIH) unter der Fördernummer NIH 2R15-HL135675-02 an T.J.L. finanziert.