インビトロで破骨細胞再吸収を可視化および定量するためのシンプルなピットアッセイプロトコル

ここでは、リン酸カルシウムコーティング細胞培養プレートを用いた再吸収ピットアッセイのための簡単で効果的なアッセイ手順を提示する。

成熟破骨細胞は、酸および酵素の分泌を介して骨を分解することができる多核細胞である。それらは様々な疾患(例えば、骨粗鬆症および骨癌)において重要な役割を果たし、したがって重要な研究対象である。 インビトロで、それらの活性は、再吸収ピットの形成によって分析することができる。このプロトコールでは、容易に可視化および定量化できるリン酸カルシウム(CaP)コーティング細胞培養プレートを用いた簡易ピットアッセイ法について記載する。ヒト末梢血単核球由来の破骨細胞前駆体(PBMC)を、破骨細胞形成刺激の存在下でコーティングプレート上で培養した。9日間のインキュベーション後、破骨細胞を固定し、蛍光イメージングのために染色し、一方、CaPコーティングをカルセインによって対比染色した。再吸収領域を定量化するために、プレート上のCaPコーティングを5%_AgNO3 で染色し、明視野画像によって可視化した。再吸収ピット面積をImageJを用いて定量した。

破骨細胞(OC)は、造血幹細胞(HSC)に由来する組織特異的マクロファージであり、骨芽細胞¹とともに骨リモデリングにおいて極めて重要な役割を果たしている。骨を全身的または局所的に破壊する性ホルモン誘発性、免疫学的、および悪性骨障害は、閉経関連骨粗鬆症²、関節リウマチ³、歯周病⁴、骨髄腫骨疾患⁵、および骨溶解性骨転移⁶を含む過剰な破骨活動によるものである。対照的に、OC形成および機能の欠陥もまた、骨ペトロシス⁷を引き起こし得る。HSCは、マクロファージコロニー刺激因子(M-CSF、遺伝子記号ACP5)刺激下でOC前駆細胞に分化する。M−CSFおよびNF−κBリガンドの受容体アクチベーター(RANKL、遺伝子記号TNFSF11)の両方の存在下で、OC前駆細胞はさらに単核OCに分化し、続いて融合して多核OC8、^9、10になる。サイトカインM-CSFおよびRANKLはいずれも、カルシトニン受容体(CT)、核因子κBの受容体活性化剤(RANK)、プロトンポンプV-ATPase、塩化物チャネル7αサブユニット(CIC-7)、インテグリンβ3、酒石酸耐性酸性ホスファターゼ(TRAP、遺伝子記号ACP5)、リソソームシステインプロテアーゼカテプシンK(CTSK)、およびマトリックスメタロペプチダーゼ9(MMP9)などの破骨細胞形成マーカーの誘導に不可欠かつ十分である。活性化されたOCは、フリル状の境界^11、12を有するアクチンリングの形成を介して骨表面上にシーリングゾーンを形成する。シーリングゾーン内では、OCはプロトンポンプV-ATPase^12、13、MMP9¹⁴、およびCTSK ¹⁵を介してプロトンを分泌することによって再吸収を媒介し^、ラクナの形成につながる。

インビトロ実験の場合、OC前駆細胞は、マウスの大腿骨および脛骨16,17からの骨髄マクロファージの拡張、ならびに血液試料およびバフィーコート^18,19,20からのヒト末梢血単核球(PBMC)の単離によって、または不死化マウス単球細胞RAW 264.7 ^21,22の分化によって得ることができる。

本プロトコールにおいて、我々は、初代PBMCに由来するOCsを用いたCaPコーティング細胞培養プレートにおける破骨細胞再吸収アッセイを記載する。ここで用いたCaP被覆細胞培養プレート法は、Patntirapongら¹⁷ およびMaria et ^al.21によって以前に記載された方法から採用され、洗練されている。OC前駆体を得るために、PBMCsを密度勾配遠心分離によって単離し、先に記載したように²⁰に拡大する。

このプロトコルは、地元の倫理委員会(承認番号287/2020B02)によってレビューされ、承認されました。

リン酸カルシウム被覆細胞培養プレートの作製

1. カルシウム原液の調製(トリス緩衝液中で25 mM CaCl 2·2H2O、1.37 mM NaCl、15 mM MgCl₂·_6H2O)
   1. 1.0 M トリス緩衝液を調製し、1 M HCl を使用して pH を 7.4 に調整します。
   2. マグネチックスターラー上にガラスビーカーを設置し、100mLの1.0Mトリス緩衝液を加える。
   3. 0.368gのCaCl_2・2H2O、8.0gのNaCl、0.305gのMgCl₂・_6H2Oの計量を行い、トリス緩衝液に1つずつ溶解する。
   4. 1 M HClを使用してpHを7.4に調整し、室温で保存します。
2. リン酸塩原液の調製(11.H2O、トリス緩衝液中の_42mMNaHCO3)
   1. マグネチックスターラー上にガラスビーカーを設置し、100mLの1.0Mトリス緩衝液を加える。
   2. Na2 HPO₄· 0.158 gの重量を量る353 gの_NaHCO3と_H2Oをトリス緩衝液に1つずつ溶解させる。
   3. 1 M HClを使用してpHを7.4に調整し、室温で保存します。
3. 96ウェル細胞培養プレートの事前石灰化
   1. 15 mLの1.0 M Tris緩衝液、7.5 mLのカルシウムストック(ステップ1.1.4)溶液、および7.5 mLのリン酸ストック溶液(ステップ1.2.3)を混合することによって、30 mLの作業溶液を調製する。溶液を0.2μmフィルターでろ過します。
   2. 平底を有する96穴細胞培養プレートを作製した。300 μLのリン酸カルシウム溶液をピペット(ステップ1.3.1)を各ウェルに。プレートを蓋で覆い、プレートを37°Cで3日間インキュベートする。
4. リン酸カルシウム溶液(2.25 mM_Na2HPO4・2・2 mMH2O, 4 mM CaCl 2·2H 2 O, 0.14 M NaCl, 50 mM トリス塩基 (ddH ₂O)
   1. 磁気攪拌ビーズを備えたビーカー内の40mLの脱イオン水に2mLの1M HClを加え、0.016gの_Na2HPO4·H2O、0.0295gの_CaCl2・_2H2O、0.409gのNaCl、および0.303gのトリス塩基を1つずつ。
   2. 1 M HClを使用してpHを7.4に調整し、脱イオン水を加えて容量を50 mLに満たします。溶液を0.2μmフィルターでろ過します。
5. 96穴細胞培養プレートの石灰化
   1. 予め石灰化した96ウェル細胞培養プレートから予備石灰化溶液を吸引し、各ウェルに300μLのリン酸カルシウム溶液(ステップ1.4.2)を加える。プレートを蓋で覆い、37°Cで1日間インキュベートする。
   2. プレートを裏返して溶液を注ぎ、プレートをイオン交換水で3回徹底的に洗い流します。均一な表面を維持するために、ヘアドライヤーまたは圧縮_CO2 または_N2 ガスを使用してプレートを直ちに乾燥させる。
   3. コーティングされたプレートをクリーンベンチでUV照射で1時間滅菌する。コーティングされたプレートをすぐに使用するか、プレートをパラフィルムで密封して室温で保管してください。

2. ヒト末梢血からのPBMCの単離

1. 献血者から書面によるインフォームドコンセントを得た後、静脈から15mLの血液を採取する(倫理的投票:287/2020B02)。
2. 15mLの新鮮な血液を等量のPBSで希釈し、チューブを数回反転させるか、混合物をピペットに出し入れして混合する。
3. チューブあたり15mLの密度勾配溶液(例えば、Ficoll、 材料表)を含む50mLの円錐管を調製する。チューブを傾け、30 mLの希釈血液サンプルを15 mLの密度勾配溶液の上に慎重に層状にします(希釈血液サンプル:密度勾配溶液、1:0.5-1比)。
   注:サンプルを重ねるときは、密度勾配溶液を希釈血液サンプルと混合しないように注意してください。
4. ブレーキなしのスイングバケットローターで20°Cで20分間、810 x g で遠心分離機。
5. 単核球細胞層(リンパ球、単球、および血小板)を相間において邪魔されずに残したまま上層を吸引する。
6. 単核球細胞層を新しい50mL円錐管に慎重に移す。
7. チューブにPBSを充填し、混合し、遠心分離機を300 x g で20°Cで10分間使用します(この段階以降はブレーキを使用できます)。
8. 上澄み液を慎重に完全に取り除きます。細胞ペレットを50mLのPBSに再懸濁し、300 x g で20°Cで10分間遠心分離する。 上清を慎重に完全に取り除きます。
9. 血小板を除去するために、細胞ペレットを50mLのPBSに再懸濁し、200 x g で20°Cで10分間遠心分離する。 上清を慎重に完全に取り除きます。
10. 再懸濁細胞を細胞培養フラスコに移し、OC前駆細胞の増殖を行う。

3. OC前駆細胞の拡大

1. 20 ng/mL M-CSF を含む完全な α-MEM (FBS 10% FBS、1% Pen/Strep、1% アムホテリシン B) で PBMC を再懸濁します。PBMCを2.5 x 10⁵セル/^cm2の密度でシードする。通常、15〜20mLの淡血から単離された細胞は、1つの75cm2フラスコ(1.5〜2 x¹⁰⁷細胞)に播種することができる。
2. 付着した細胞が所望のコンフルエントに達するまで、3日ごとに20ng/mL M-CSFを含む新鮮な完全α-MEMを細胞に供給する。典型的な収量は、細胞が95%コンフルエントである場合、1.5-2 x¹⁰⁶ 細胞/フラスコである。通常、拡張期間は6日間続きます。
   注:前駆体の骨細胞形成能は、培養時間が長くなるにつれて低下する可能性があります。

4. CaPコーティングプレートにおける骨細胞形成の誘導

1. 細胞接着を容易にするために、CaP コーティングプレートを 50 μL の FBS と共に 37 °C のインキュベーター内で 1 時間インキュベートします。
2. OC前駆体を剥離するには、フラスコをPBSで2回洗浄し、死細胞または非接着細胞を除去した。75cm2フラスコあたり4mLのトリプシン(材料表)を30分間加える。
   1. 4 mL の完全α-MEM を加えて消化を止め、セルスクレーパーを使用して細胞を慎重に剥離し、細胞を 50 mL チューブに移します。
   2. ノイバウアーチャンバーまたは類似のものを用いて総細胞数を決定する。
3. 350 x gで7分間遠心分離することにより細胞をペレット化する。ペレットを20 ng/mL M-CSF および 20 ng/mL RANKL を含む十分な完全な α-MEM に再懸濁して、1 x¹⁰⁶ cells/mL の濃度を得る。
4. CaPコーティングされた96ウェルプレートおよびピペットからFBS溶液を吸引し、1ウェルあたり200μLの細胞懸濁液(2 x¹⁰⁵ 細胞/ウェル)を吸引する。
5. OC前駆体を所望の期間、または実験計画に関連する所望の試薬と共にインキュベートする。通常、多数の大型および多核OCが6日後および再吸収ピットが形成されているときに観察され得る。3 日ごとに 20 ng/mL M-CSF および 20 ng/mL RANKL を含む新鮮な完全 α-MEM 培地で細胞を供給します。
6. インキュベーションの最後に、PBSで細胞を2回洗浄し、4%パラホルムアルデヒドで10分間固定し、再びPBSで洗浄する。
7. 固定OCを蛍光染色に直接使用するか、4°Cで保存してください。

5. OCおよびCaPコーティングの蛍光染色

1. 固定した細胞を透過処理バッファー(PBS中の0.1% Triton)と共に5分間インキュベートする。
2. アクチンフィラメントをPBS中のAlexaFluor 546標識ファロイジン溶液100 μLで30分間染色し、染色溶液を吸引する。100 μLのヘキスト33342染色液(PBS中10 μg/mL)を10分間加え、核を染色する。DAPI を使用することもできます。
3. PBS中の10μMカルセイン100μLでCaPコーティングを10分間染色する。PBSで3回洗って画像を撮ります。
4. 蛍光イメージング後、同じプレートを用いて、フォン・コッサ染色により再吸収ピット面積を定量することができる。これを行うには、プレートを脱イオン水で2回洗ってください。

6. 全吸収ピット面積の定量化

1. フォンコッサ染色でCaPコーティングを染色するには、ウェル底部のコーティングが茶色になるまで、ウェルあたり50μLの脱イオン_水中で UV照射下で1時間インキュベートします。
2. プレートをイオン交換水で3回洗い、明視野画像を撮影します。1.25倍の対物レンズなど、倍率の小さい対物レンズを使用すると、井戸全体を1つの画像に収めることができます。これにより、その後の画像解析が容易になります。井戸の全領域を捕捉するための代替方法を適用することができる。
3. ImageJ でイメージファイルを開く: ファイル |オープン|画像|タイプ |8 ビット。[直線] を使用して、画像の右下隅にあるスケール ユニット を確認||の分析スケールを設定します。「既知の距離」ブランケットに長さを入力し、[ 長さの単位] に新しいスケール単位を入力して、[ グローバル] チェックボックスをオンにします。
4. 分析する測定パラメータのリスト: 分析|測定値を設定します。「測定値を設定」ウィンドウで、「面積」および「しきい値に制限」ボックスにチェック・マークを付けます。
5. ピットの面積を測定する: 画像||を調整するしきい値。「しきい値」ウィンドウで、「 暗い背景」 にチェック・ボックスをオンにして、「 自動」をクリックします。ピットの領域が赤に変わります。「しきい値」ウィンドウを閉じ、「 |の分析」を選択します。測定します。結果ファイルを保存する: ファイル|名前を付けて保存します。

7. OC数とサイズの定量化、および再吸収ピット面積の正規化

1. 破骨細胞の蛍光画像をImageJで開き、スケール単位を確認します(ステップ6.3参照)。
2. 分析する測定パラメータのリスト: 分析|測定値を設定します。「測定値の設定」ウィンドウで、「 面積 」ボックスにチェック・マークを付けます。
3. ROI マネージャとポリゴン選択を使用した OC の概要: |の分析ツールの|ROI マネージャー。ツールセットのポリゴン選択をクリックし、1つのOC(アクチンリングと≥3つの核を持つセル)の輪郭を描き、ROIマネージャウィンドウで [t]を追加 ]をクリックします。すべてのOCが含まれるまでアウトラインを繰り返します。
4. OC の数とサイズを測定: ROI マネージャーですべての項目を選択し、[ 測定] をクリックします。結果ファイルを保存する: ファイル|名前を付けて保存します (図3E)。
5. 蛍光画像のピット面積を測定する。手順7.3で画像と相関する塗膜の蛍光画像を開き、スケール単位を確認します(手順6.3を参照)。
   1. 分析する測定パラメータをリストします(ステップ6.4を参照)。 画像|の選択|を調整するしきい値。「しきい値」ウィンドウで、すべてのボックスのチェックを外し、「 自動」をクリックします。ピットの領域が赤に変わります。「 しきい値」 ウィンドウを閉じ、「 |の分析」を選択します。測定します。結果ファイルを保存します。
6. OC番号で正規化されたピット面積を計算します。

細胞培養プレートの底部へのリン酸カルシウムコーティングを、3日間の事前石灰化工程と1日間の石灰化工程とを含む2つのコーティング工程で行った。 図1に示すように、96穴プレートの底部に均一に分布したリン酸カルシウムが得られた。このコーティングは、洗浄工程を行った後に底部に非常によく付着した。

図1:96ウェル細胞培養プレート上のリン酸カルシウムコーティングの代表的な明視野画像。 コーティングは、3日間の事前石灰化工程と1日間の石灰化工程とを含む2つのコーティング工程で行った。スケール バーは 200 μm を表します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ヒトPBMCsに由来するOC前駆体をCaPコートプレート上で培養した。再吸収ピットおよび大きなOC(ブランク領域)は、培養の9日後にM−CFSおよびRANKLの存在下で形成された(図2A)。CaPコーティングのピットに位置する多核OCは、高レベルのTRAPを発現した(図2B)。

図2:CaPコーティング細胞培養プレート上での成熟後のOCsによるTRAP発現。 OC前駆体をCaPコーティングプレート上で、20 ng/mL M-CSF および 20 ng/mL RANKL の存在下で 9 日間培養した。(A)ブランク領域は再吸収ピットを表した。(B)再吸収ピット内にいくつかの多核TRAP陽性(紫色)OCが観察された。スケール バーは 200 μm を表します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

CaPコーティングプレート上のOCの成熟をさらに特徴付けるために、細胞をアクチン(赤色蛍光)について染色した。細胞核をヘキスト(青色)で染色し、カルセインを緑色でカルシウム可視化に使用した。再吸収ピットは、緑色のCaPコーティングの黒い領域として見えます(図3B)。機能性成熟OCsは、3つ以上の核および骨細胞形成再吸収に必須である特徴的なアクチン環を示した(図3A、C)。蛍光画像のピット面積は、ImageJの閾値化ツールを使用して測定することができます(図3D)。OCの数とサイズは、ImageJのROIマネージャとポリゴン選択ツールを使用して計算できます(図3E)。

図3:CaPコーティング上の成熟OCの形態 OC前駆体をCaPコーティングプレート上で、20 ng/mL M-CSF および 20 ng/mL RANKL の存在下で 9 日間培養した。(A)OCsは、ファロイジン−Alexa Fluor 546およびHoechst 33342によってアクチンおよび核について染色された。(b)CaP被膜をカルセインにより染色した。黒い領域は再吸収ピットを表します。(C) マージされた画像。(D)ImageJの閾値化ツールを用いたピット面積(赤色領域)の定量化(E) ImageJのROIマネージャとポリゴン選択ツールを使用して、OCのアウトラインとカウントを行います。スケール バーは 500 μm を表します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

CaP被覆細胞培養プレート上の再吸収ピットの定量のために、カルシウムを5%_AgNO3 (フォンコッサ染色)とのインキュベーションにより染色した。 図4Aに示すように、OC前駆体は、RANKLの非存在下では完全な機能性に達することができず、再吸収ピットを形成することができなかった。骨細胞形成ピットは、M−CSFおよびRANKLの両方の因子の存在下でのみ観察された(図4B)。再吸収ピット面積を、ImageJの閾値化ツールを用いて定量化した(図4C)。

図4:再吸収ピットの可視化と定量化 OC前駆体を、CaPコーティングされた96穴細胞培養プレート上で、RANKLの非存在下(A)およびM-CSFおよびRANKL(B)の両方の因子の存在下で培養した。(C)形成された再吸収ピットの数は、ImageJの閾値化ツールを使用して定量化した。スケール バーは 1,000 μm を表します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ここでは、PBMCsから インビトロで 誘導および拡張されたOCsを用いた破骨細胞再吸収アッセイのための簡単で信頼性の高い方法を説明する。使用されるCaPコーティング細胞培養プレートは、ラボで利用可能な材料を使用して簡単に調製および視覚化することができます。このプロトコールで採用された未選別PBMCに加えて、マウス単球細胞²¹ および骨髄マクロファージ細胞¹⁷ から生成されたOCも、ピットアッセイのために同様の合成基質上で培養されており、したがって、これらの細胞源は、対応する文献を参照してこのアプローチに移動することができる。

このプロトコルでは、高価な市販のアッセイプレートの代わりに、ラボ内で作製された単純なCaPコーティングを使用しました。骨スライスと象牙質スライスは、再吸収ピットアッセイのための2つの一般的で手頃な価格の再吸収可能な材料ですが、入手可能性と複雑な調製は大きな欠点です。簡単に調製できる合成基材として、CaPコーティングは2つの元の材料よりも便利で容易に入手可能です。このピットアッセイアプローチのもう1つの利点は、培養中に明視野顕微鏡下で細胞を視覚化できるのに対し、不透明な骨および象牙質スライス上で増殖する細胞は観察できないことである。

このCaPコーティング法は、異なる細胞培養プレートサイズに必要な実験ニーズに応じて柔軟に適合させることができる。

以前に報告された^17,21とは異なり、我々は室温ではなく37°Cでコーティング溶液でプレートをインキュベートし、体温で細胞培養プレート上でアパタイト核の自発的成長をもたらした。CaPコーティングプレートは、UV照射によって乾燥および滅菌された直後に実験に利用可能であり、以前に報告された方法と比較して時間を節約する^17,21。

コーティング溶液のろ過(ステップ1.3.1および1.4.2)は重要なステップであり、均一な粒径を取得し、溶液中の気泡および不純物によって引き起こされるコーティング内のコーティングされていないスポットを減少させるのに役立つ。プレートを直ちに乾燥させること(ステップ1.5.2)は、均一なCaPコーティングを作るのに役立つもう一つの重要なステップです。さもなければ、それは井戸の中央でより厚いコーティングを形成する傾向がある。

コーティングの厚さおよびリン酸カルシウム堆積物の密度は、ある範囲内のコーティング溶液の体積に依存することを指摘する価値がある。そのため、ウェル内の塗布液の体積を変えることで塗布厚を制御することができる。ただし、この培養プレート形式では総容量が小さいため、96 ウェル細胞培養プレートを使用する場合は、できるだけ多くの量のコーティング溶液を追加することをお勧めします。ウェルの内壁も両方のコーティングステップ中にCaPによってコーティングされるため、コーティングを損傷から保護するために、ピペットで底部または壁に触れないように注意が必要です。

我々の観察によると、PBMCから膨張したOC前駆体のほとんどは、問題なくCaPコーティングに付着することができる。しかし、細胞播種前にコーティングプレートをFBSで浸すと、既報²¹のように細胞接着効率が向上する。

細胞スクレーパーを使用してOC前駆体を穏やかに剥離することも(ステップ4.2)、OC前駆体の大部分がまだ接着性であり、機械的損傷を最小限に抑えることが細胞生存率にとって有利であるため、重要である。

この方法の限界は、OC前駆体の供給源として使用したバルクPBMCが高度に混合された細胞源であり、そのうちごく一部の細胞(CD14⁺細胞)のみが実際のOC前駆体であることです。骨細胞形成に影響を及ぼす可能性のある他の細胞(間質細胞およびリンパ球など)が単離されたPBMC中に存在するので、これは予測が困難な方法でアッセイ結果に影響を与える可能性があり、アッセイ解釈を混乱させる可能性がある。OCsの再吸収活性に対する成長因子、サイトカインまたはグルココルチコイドの直接的な影響をよりよく調査するために、OC前駆体精製の方法(例えば、蛍光活性化細胞選別(FACS)および磁気ビーズ精製²⁰特異的細胞表面^{マーカー23}、24^、25、26に基づく)が推奨される。

同じ領域の細胞と下層のピットの両方の明視野画像を得る際のCaP基質の制限は、TRAP染色とフォンコッサ染色の不適合性によって引き起こされ、ウェル全体の正規化された再吸収領域は利用できません。しかし、代わりに、蛍光イメージングを使用して再吸収面積と細胞数を視覚化し、正規化された再吸収データを得ることができます。これらのデータは、実験条件下での総吸収面積の増加が破骨細胞数単独によるものか、個々の細胞の再吸収能の増加によるものかについての重要な洞察を提供し得る。さらに、破骨細胞数、サイズ、核数、および再吸収能力の相対的効果の研究を可能にする。

要約すると、我々は、2段階リン酸カルシウムコーティングおよび一次ヒトPBMCに由来するOCを用いた再吸収ピットアッセイのための有用で簡単なプロトコールを説明する。このプロトコールは、破骨細胞再吸収に関連する研究のための in vitro 骨吸収モデルを確立するための容易な方法を提供し、骨障害疾患の治療の研究に適用することができる。

著者らは開示するものは何もありません。

この研究は、中国奨学金評議会[CSC No. 201808440394]によって部分的に資金提供されました。W.C.はCSCから資金提供を受けた。