Un semplice protocollo di analisi dei pozzi per visualizzare e quantificare il riassorbimento osteoclastico in vitro

Qui, presentiamo una procedura di analisi semplice ed efficace per i saggi di riassorbimento della fossa utilizzando piastre di coltura cellulare rivestite di fosfato di calcio.

Gli osteoclasti maturi sono cellule multinucleate che possono degradare l'osso attraverso la secrezione di acidi ed enzimi. Svolgono un ruolo cruciale in varie malattie (ad esempio, l'osteoporosi e il cancro alle ossa) e sono quindi importanti oggetti di ricerca. In vitro, la loro attività può essere analizzata dalla formazione di pozzi di riassorbimento. In questo protocollo, descriviamo un semplice metodo di analisi dei pozzi che utilizza piastre di coltura cellulare rivestite di fosfato di calcio (CaP), che possono essere facilmente visualizzate e quantificate. I precursori degli osteoclasti derivati da cellule mononucleate del sangue periferico umano (PBMC) sono stati coltivati sulle piastre rivestite in presenza di stimoli osteoclastogeni. Dopo 9 giorni di incubazione, gli osteoclasti sono stati fissati e colorati per l'imaging a fluorescenza mentre il rivestimento CaP è stato controcolorato dalla calceina. Per quantificare l'area riassorbita, il rivestimento CaP sulle piastre è stato colorato con AgNO_{3 al} 5% e visualizzato mediante imaging a campo luminoso. L'area della fossa di riassorbimento è stata quantificata utilizzando ImageJ.

Gli osteoclasti (OC) sono macrofagi tessuto-specifici derivati da cellule staminali ematopoietiche (HSC), che svolgono un ruolo fondamentale nel rimodellamento osseo insieme agli osteoblasti¹. I disturbi ossei indotti da ormoni sessuali, immunologici e maligni che distruggono l'osso a livello sistemico o locale sono dovuti all'eccessiva attività osteoclastica, tra cui l'osteoporosi correlata alla menopausa², l'artrite reumatoide³, la malattia parodontale⁴, la malattia ossea del mieloma⁵ e le metastasi ossee osteolitiche⁶. Al contrario, i difetti nella formazione e nella funzione dell'OC possono anche causare osteopetrosi⁷. Le HSC subiscono la differenziazione in progenitori OC sotto stimolazione del fattore stimolante le colonie di macrofagi (M-CSF, simbolo genico ACP5). In presenza sia di M-CSF che di attivatore recettoriale del ligando NF-κB (RANKL, simbolo genico TNFSF11), i progenitori OC si differenziano ulteriormente in OC mononucleati e successivamente si fondono per diventare OC multinucleati ^8,9,10. Entrambe le citochine M-CSF e RANKL sono indispensabili e sufficienti per l'induzione di marcatori osteoclastici come il recettore della calcitonina (CT), l'attivatore del recettore del fattore nucleare κ B (RANK), la pompa protonica V-ATPasi, la subunità alfa del canale del cloruro 7 (CIC-7), l'integrina β3, la fosfatasi acida resistente al tartrato (TRAP, simbolo genico ACP5), la cisteina lisosomiale proteasi catepsina K (CTSK) e la metallopeptidasi 9 della matrice (MMP9). Gli OC attivati formano una zona di tenuta sulla superficie ossea attraverso la formazione di un anello di actina con un bordo arruffato^11,12. All'interno della zona di tenuta, gli OC mediano il riassorbimento attraverso la secrezione di protoni tramite la pompa protonica V-ATPasi ^12,13, MMP9¹⁴ e CTSK¹⁵, portando alla formazione di lacune.

Per esperimenti in vitro, i progenitori oc possono essere ottenuti mediante espansione di macrofagi del midollo osseo dal femore e dalla tibia^16,17 dei topi, nonché mediante isolamento di cellule mononucleate del sangue periferico umano (PBMC) da campioni di sangue e buffy coat ^18,19,20, o mediante differenziazione delle cellule monocitiche murine immortalizzate RAW 264.7 ^21,22.

Nel presente protocollo, descriviamo un saggio di riassorbimento osteoclastico in piastre di coltura cellulare rivestite di CaP utilizzando OC derivati da PBMC primari. Il metodo delle piastre di coltura cellulare rivestite di CaP qui utilizzato è adottato e perfezionato dal metodo descritto in precedenza da Patntirapong et ^al.17 e Maria et ^al.21. Per ottenere precursori OC, i PBMC vengono isolati mediante centrifugazione a gradiente di densità ed espansi come descritto in precedenza²⁰.

Il protocollo è stato rivisto e approvato dal comitato etico locale (numero di approvazione 287/2020B02).

1. Preparazione di piastre di coltura cellulare rivestite di fosfato di calcio

1. Preparazione di soluzione madre di calcio (25 mM CaCl₂·_{2H 2}O, 1,37 mM NaCl, 15 mM MgCl₂·6H₂O in tampone Tris)
   1. Preparare il tampone Tris da 1,0 M e regolare il pH a 7,4 utilizzando 1 M HCl.
   2. Impostare un becher di vetro su un agitatore magnetico e aggiungere 100 ml di tampone Tris da 1,0 M.
   3. Pesare 0,368 g di CaCl₂·2H₂O, 8,0 g di NaCl e 0,305 g di MgCl₂·6H₂O e sciogliere nel tampone Tris uno per uno.
   4. Regolare il pH a 7,4 utilizzando 1 M HCl. Conservare a temperatura ambiente.
2. Preparazione della soluzione madre di fosfato (11,1 mM Na₂HPO₄· H₂O, 42 mM NaHCO₃ in tampone Tris)
   1. Impostare un becher di vetro su un agitatore magnetico e aggiungere 100 ml di tampone Tris da 1,0 M.
   2. Pesare 0,158 g di Na₂HPO₄· H₂O e 0,353 g di NaHCO₃ e si dissolvono nel tampone Tris uno per uno.
   3. Regolare il pH a 7,4 utilizzando 1 M HCl. Conservare a temperatura ambiente.
3. Precalcificazione di piastre di coltura cellulare a 96 pozzetti
   1. Preparare 30 mL di soluzione di lavoro mescolando 15 mL di tampone Tris da 1,0 M, 7,5 mL di soluzione di calcio (fase 1.1.4) e 7,5 mL di soluzione madre di fosfato (fase 1.2.3). Filtrare la soluzione con un filtro da 0,2 μm.
   2. Preparare una piastra di coltura cellulare a 96 pozzetti con fondo piatto. Pipettare 300 μL di soluzione di fosfato di calcio (fase 1.3.1.) a ciascun pozzetto. Coprire la piastra con un coperchio e incubare la piastra a 37 °C per 3 giorni.
4. Preparazione della soluzione di fosfato di calcio (2,25 mM Na₂HPO₄· H₂O, 4 mM CaCl₂·2H₂O, 0,14 M NaCl, 50 mM Tris base in ddH₂O)
   1. Aggiungere 2 mL di 1 M HCl a 40 mL di acqua deionizzata in un becher con un tallone magnetico e sciogliere 0,016 g di Na₂HPO₄· H₂O, 0,0295 g di CaCl₂·2H₂O, 0,409 g di NaCl e 0,303 g di base Tris uno per uno.
   2. Regolare il pH a 7,4 utilizzando 1 M HCl. Aggiungere acqua deionizzata per riempire il volume a 50 mL. Filtrare la soluzione con un filtro da 0,2 μm.
5. Calcificazione di piastre di coltura cellulare a 96 pozzetti
   1. Aspirare la soluzione di precalcificazione dalle piastre di coltura cellulare precalcificate a 96 pozzetti e aggiungere 300 μL di soluzione di fosfato di calcio (fase 1.4.2) a ciascun pozzetto. Coprire le piastre con un coperchio e incubare a 37 °C per 1 giorno.
   2. Capovolgere la piastra per versare la soluzione e lavare accuratamente la piastra tre volte con acqua deionizzata. Asciugare immediatamente la piastra utilizzando un asciugacapelli o gas CO₂ o N₂ compresso per mantenere una superficie uniforme.
   3. Sterilizzare la piastra rivestita con radiazioni UV in un banco pulito per 1 ora. Utilizzare immediatamente la piastra rivestita o sigillare la piastra con parafilm e conservarla a temperatura ambiente.

2. Isolamento delle PBMC dal sangue periferico umano

1. Prelevare 15 ml di sangue dalla vena dopo aver ottenuto il consenso informato scritto dal donatore di sangue (voto etico: 287/2020B02).
2. Diluire 15 ml di sangue fresco con un volume uguale di PBS e mescolare invertendo il tubo più volte o aspirando la miscela dentro e fuori da una pipetta.
3. Preparare un tubo conico da 50 mL contenente 15 mL di soluzione di gradiente di densità (ad esempio, Ficoll, Table of Materials) per tubo. Inclinare il tubo e stratificare accuratamente 30 mL di campione di sangue diluito sui 15 mL di soluzione di gradiente di densità (campione di sangue diluito: soluzione di gradiente di densità, rapporto 1:0,5-1).
   NOTA: Quando si sovrappone il campione, prestare attenzione a non mescolare la soluzione di gradiente di densità con il campione di sangue diluito.
4. Centrifuga a 810 x g per 20 minuti a 20 °C in un rotore a benna oscillante senza freno.
5. Aspirare lo strato superiore lasciando indisturbato lo strato cellulare mononucleato (linfociti, monociti e trombociti) all'interfase.
6. Trasferire con cura lo strato cellulare mononucleare in un nuovo tubo conico da 50 ml.
7. Riempire il tubo con PBS, mescolare e centrifugare a 300 x g per 10 minuti a 20 °C (il freno può essere utilizzato da questa fase in poi).
8. Rimuovere con attenzione il surnatante completamente. Risospesare il pellet cellulare in 50 mL di PBS e centrifugare a 300 x g per 10 min a 20 °C. Rimuovere con attenzione il surnatante completamente.
9. Per la rimozione delle piastrine, risospesare il pellet cellulare in 50 ml di PBS e centrifugare a 200 x g per 10 minuti a 20 °C. Rimuovere con attenzione il surnatante completamente.
10. Trasferire le cellule risospese ai palloni di coltura cellulare per l'espansione dei progenitori OC.

3. Espansione dei progenitori oc

1. PBMC risospesi in α-MEM completo (10% FBS, 1% Pen/Strep, 1% amfotericina B) contenenti 20 ng/mL M-CSF. PBMC di semi ad una densità di 2,5 x 10⁵ celle/cm². Di solito, le cellule isolate da 15-20 ml di sangue fresco possono essere seminate in un pallone da 75 cm² (1,5-2 x 10⁷ cellule).
2. Nutrire le cellule con α-MEM fresco completo contenente 20 ng/mL M-CSF ogni tre giorni fino a quando le cellule attaccate raggiungono la confluenza desiderata. Le rese tipiche sono 1,5-2 x 10⁶ celle / pallone quando le cellule sono confluenti al 95%. Di solito, il periodo di espansione dura 6 giorni.
   NOTA: Il potenziale osteoclastogenico dei precursori può diminuire con un tempo di coltivazione prolungato.

4. Induzione dell'osteoclastogenesi in piastre rivestite di CaP

1. Per facilitare l'adesione cellulare, incubare le piastre rivestite in CaP con 50 μL di FBS per 1 ora in un incubatore a 37 °C.
2. Per staccare i precursori OC, lavare due volte il pallone con PBS per rimuovere le cellule morte o non aderenti. Aggiungere 4 mL di tripsina (Tabella dei materiali) per 75 cm² di pallone, per 30 min.
   1. Aggiungere 4 mL di α-MEM completo per fermare la digestione, staccare accuratamente le cellule usando un raschietto cellulare e trasferire le cellule in un tubo da 50 ml.
   2. Determinare il numero totale di cellule utilizzando una camera neubauer o simile.
3. Pellet le celle per centrifugazione per 7 min a 350 x g. Sospendere il pellet in un α-MEM completo sufficiente contenente 20 ng/mL M-CSF e 20 ng/mL RANKL per ottenere una concentrazione di 1 x 10⁶ celle/mL.
4. Aspirare la soluzione FBS dalla piastra a 96 pozzetti rivestita in CaP e dalla pipetta da 200 μL di sospensione cellulare per pozzetto (2 x 10⁵ celle/pozzetto).
5. Incubare i precursori OC per il periodo di tempo desiderato o con i reagenti desiderati rilevanti per il disegno sperimentale. Di solito, un numero elevato di OC di grandi dimensioni e multinucleati può essere osservato dopo 6 giorni e quando si stanno formando pozzi di riassorbimento. Alimentare le cellule con mezzo α-MEM fresco completo contenente 20 ng/mL M-CSF e 20 ng/mL RANKL ogni tre giorni.
6. Alla fine dell'incubazione, lavare le cellule con PBS due volte, fissare con paraformaldeide al 4% per 10 minuti e lavare nuovamente con PBS.
7. Utilizzare direttamente gli OC fissi per la colorazione a fluorescenza o conservare a 4 °C.

5. Colorazione fluorescente di OC e rivestimento CaP

1. Incubare le cellule fisse con tampone di permeabilizzazione (0,1% Triton in PBS) per 5 min.
2. Colorare i filamenti di actina con 100 μL di soluzione di falloidina marcata AlexaFluor 546 in PBS per 30 minuti e aspirare la soluzione colorante. Aggiungere 100 μL di soluzione colorante Hoechst 33342 (10 μg/mL in PBS) per 10 minuti per colorare i nuclei. È possibile utilizzare anche DAPI.
3. Rivestimento Stain CaP con 100 μL di calceina da 10 μM in PBS per 10 min. Lavare tre volte con PBS e scattare immagini.
4. Dopo l'imaging a fluorescenza, le stesse piastre possono essere utilizzate per quantificare l'area della fossa di riassorbimento mediante colorazione di Von Kossa. Per fare ciò, lavare i piatti con acqua deionizzata due volte.

6. Quantificazione dell'area totale della fossa di riassorbimento

1. Per macchiare il rivestimento CaP con colorazione Von Kossa, incubare con 50 μL di AgNO_{3 al} 5% in acqua deionizzata per pozzo sotto radiazione UV per 1 ora, fino a quando il rivestimento sul fondo dei pozzetti è diventato marrone.
2. Lavare la piastra tre volte con acqua deionizzata e scattare immagini in campo luminoso. Un obiettivo con poco ingrandimento, come un obiettivo 1,25x, può essere utilizzato per catturare l'intero pozzo in un'unica immagine. Ciò facilita la successiva analisi delle immagini. È possibile applicare metodi alternativi per catturare l'intera area del pozzo.
3. Aprire un file di immagine con ImageJ: File | Apri | | immagine Tipo | 8 bit. Verificare l'unità di scala nell'angolo in basso a destra dell'immagine utilizzando Retta | Analizza | Imposta scala. Immettere la lunghezza nella coperta "distanza nota", immettere la nuova unità di scala in Unità di lunghezza e selezionare la casella Globale.
4. Elenco dei parametri di misura da analizzare: Analizza | Imposta misure. Nella finestra Imposta misure, selezionare le caselle Area e Limita alla soglia.
5. Misurare l'area delle fosse: immagine | Regolare | Soglia. Nella finestra Soglia selezionare Sfondo scuro e fare clic su Automatico. L'area delle fosse diventa rossa. Chiudere la finestra Soglia e selezionare Analizza | Misura. Salvare il file dei risultati: File | Salva con nome.

7. Quantificazione del numero e della dimensione dell'OC e area della fossa di riassorbimento normalizzata

1. Aprire un'immagine di fluorescenza degli osteoclasti con ImageJ e verificare l'unità di scala (vedere il passaggio 6.3).
2. Elenco dei parametri di misura da analizzare: Analizza | Imposta misure. Nella finestra Imposta misure, selezionare la casella Area .
3. Delineare i circuiti integrati utilizzando le selezioni di ROI Manager e Poligono: analizzare | Strumenti | ROI Manager. Fare clic su Selezioni poligonali nel set di strumenti, delineare un OC (celle con anello di actina e ≥ tre nuclei) e fare clic su Aggiungi [t] nella finestra roi Manager. Ripetere la struttura fino a includere tutti i circuiti integrati.
4. Misura il numero e le dimensioni dei oc: seleziona tutti gli elementi in ROI Manager e fai clic su Misura. Salvare il file dei risultati: file | Salva con nome (Figura 3E).
5. Misurare l'area della fossa delle immagini di fluorescenza. Aprire l'immagine fluorescente del rivestimento correlata con l'immagine nel passaggio 7.3 e verificare l'unità di scala (vedere il passaggio 6.3).
   1. Elencare i parametri di misura da analizzare (cfr. punto 6.4). Seleziona immagine | Regolare | Soglia. Nella finestra Soglia, deselezionare tutte le caselle e fare clic su Auto. L'area dei box diventa rossa. Chiudere la finestra Soglia e selezionare Analizza | Misura. Salvare il file dei risultati.
6. Calcola l'area normalizzata della fossa in base al numero OC.

Il rivestimento di fosfato di calcio sul fondo delle piastre di coltura cellulare è stato eseguito in due fasi di rivestimento comprendenti una precalcificazione di 3 giorni e una fase di calcificazione di 1 giorno. Come mostrato nella Figura 1, il fosfato di calcio uniformemente distribuito è stato ottenuto sul fondo delle piastre a 96 pozzetti. Il rivestimento ha aderito molto bene al fondo dopo le fasi di lavaggio eseguite.

Figura 1: Immagine rappresentativa in campo luminoso del rivestimento di fosfato di calcio su piastre di coltura cellulare a 96 pozzetti. Il rivestimento è stato effettuato in due fasi di rivestimento comprendenti una fase di precalcificazione di 3 giorni e una fase di calcificazione di 1 giorno. La barra della scala rappresenta 200 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

I precursori oc derivati da PBMC umani sono stati coltivati sulle piastre rivestite di CaP. Pozzi di riassorbimento e grandi OC (area vuota) si sono formati in presenza di M-CFS e RANKL dopo 9 giorni di coltura (Figura 2A). Gli OC multinucleati situati nelle fosse del rivestimento CaP hanno espresso alti livelli di TRAP (Figura 2B).

Figura 2: Espressione trap da parte degli OC dopo la maturazione sulle piastre di coltura cellulare rivestite di CaP. I precursori oc sono stati coltivati sulle piastre rivestite di CaP in presenza di 20 ng/mL M-CSF e 20 ng/mL RANKL per 9 giorni. (A) Area vuota rappresentata da pozzi di riassorbimento. (B) All'interno delle fosse di riassorbimento sono stati osservati diversi OC TRAP-positivi (viola) multinucleati. La barra della scala rappresenta 200 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Per caratterizzare ulteriormente la maturazione degli OC sulle piastre rivestite di CaP, le cellule sono state colorate per l'actina (fluorescenza rossa). I nuclei cellulari sono stati colorati con Hoechst (blu) e la calceina è stata utilizzata per la visualizzazione del calcio in verde. Le fosse di riassorbimento sono visibili come aree nere nel rivestimento CaP verde (Figura 3B). Gli OC maturi funzionali hanno mostrato tre o più nuclei e il caratteristico anello di actina che è essenziale per il riassorbimento osteoclastogenico (Figura 3A,C). L'area della fossa delle immagini di fluorescenza può essere misurata utilizzando lo strumento di soglia di ImageJ (Figura 3D). Il numero e la dimensione dei oc possono essere calcolati utilizzando lo strumento di selezione ROI Manager e Polygon di ImageJ (Figura 3E).

Figura 3: Morfologia degli OC maturi sul rivestimento CaP. I precursori dell'OC sono stati coltivati sulle piastre rivestite di CaP per 9 giorni in presenza di 20 ng/mL M-CSF e 20 ng/mL RANKL. (A) Gli OC sono stati colorati per actina e nuclei da phalloidin-Alexa Fluor 546 e Hoechst 33342. (B) Il rivestimento CaP è stato macchiato da calceina. Le aree nere rappresentano pozzi di riassorbimento. (C) Immagine unita. (D) Quantificazione dell'area della fossa (area rossa) utilizzando lo strumento di soglia di ImageJ. (E) Delineazione e conteggio OC utilizzando lo strumento di selezione ROI Manager e Polygon di ImageJ. La barra della scala rappresenta 500 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Per la quantificazione delle fosse di riassorbimento sulle piastre di coltura cellulare rivestite di CaP, il calcio è stato colorato mediante incubazione con il 5% di AgNO₃ (colorazione von Kossa). Come mostrato nella Figura 4A, i precursori OC non hanno raggiunto la piena funzionalità in assenza di RANKL e non sono stati in grado di formare pozzi di riassorbimento. Le fosse osteoclastogeniche sono state osservate solo in presenza di entrambi i fattori M-CSF e RANKL (Figura 4B). L'area della fossa di riassorbimento è stata quantificata con lo strumento di soglia di ImageJ (Figura 4C).

Figura 4: Visualizzazione e quantificazione delle fosse di riassorbimento. I precursori dell'OC sono stati coltivati sulle piastre di coltura cellulare a 96 pozzetti rivestite di CaP in assenza di RANKL (A) e in presenza di entrambi i fattori M-CSF e RANKL (B). (C) Il numero di pozzi di riassorbimento formati è stato quantificato utilizzando lo strumento di soglia di ImageJ. La barra della scala rappresenta 1.000 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Qui descriviamo un metodo semplice e affidabile per un test di riassorbimento osteoclastico utilizzando OC derivati ed espansi in vitro da PBMC. Le piastre di coltura cellulare rivestite in CaP utilizzate possono essere facilmente preparate e visualizzate utilizzando materiali disponibili in laboratorio. Oltre alle PBMC non selezionate adottate in questo protocollo, anche le OC generate da cellule monocitiche murine²¹ e cellule macrofagiche del midollo osseo¹⁷ sono state coltivate su substrati sintetici simili per il test dei pozzi, quindi queste fonti cellulari possono essere spostate su questo approccio facendo riferimento alla letteratura corrispondente.

Per questo protocollo, abbiamo utilizzato un semplice rivestimento CaP fabbricato in laboratorio invece di costose piastre di analisi disponibili in commercio. Sebbene le fette di osso e dentina siano due materiali riassorbibili comuni e convenienti per il test della fossa di riassorbimento, la disponibilità e la preparazione complicata sono i principali inconvenienti. Come substrato sintetico facilmente preparato, il rivestimento CaP è più conveniente e facilmente disponibile rispetto ai due materiali originali. Un altro vantaggio di questo approccio al test dei pozzi è che le cellule possono essere visualizzate al microscopio a campo luminoso durante la coltura, mentre le cellule che crescono su ossa opache e fette di dentina non possono essere osservate.

Questo metodo di rivestimento CaP può essere adattato in modo flessibile in base alle esigenze sperimentali richieste alle diverse dimensioni delle piastre di coltura cellulare.

A differenza di quanto riportato in precedenza^17,21, incubamo le piastre con soluzione di rivestimento a 37 °C anziché a temperatura ambiente, con conseguente crescita spontanea di nuclei di apatite su piastre di coltura cellulare a temperatura corporea. Le piastre rivestite in CaP sono disponibili per esperimenti immediatamente dopo essere state essiccate e sterilizzate dalle radiazioni UV, il che consente di risparmiare tempo rispetto ai metodi precedentemente riportati^17,21.

La filtrazione della soluzione di rivestimento (Fase 1.3.1 e 1.4.2) è una fase cruciale, che aiuta a ottenere una dimensione uniforme delle particelle e ridurre le macchie non rivestite all'interno del rivestimento causate da bolle d'aria e impurità nella soluzione. Asciugare immediatamente la piastra (passaggio 1.5.2) è un altro passaggio critico, che aiuta a rendere uniforme il rivestimento CaP. Altrimenti, è incline a formare un rivestimento più spesso nel mezzo del pozzo.

Vale la pena sottolineare che lo spessore del rivestimento e la densità dei depositi di fosfato di calcio dipendono dal volume della soluzione di rivestimento entro un certo intervallo. Pertanto, è possibile controllare lo spessore del rivestimento modificando il volume della soluzione di rivestimento nel pozzo. Tuttavia, si consiglia di aggiungere il maggior volume possibile di soluzione di rivestimento quando viene utilizzata la piastra di coltura cellulare a 96 pozzetti a causa del piccolo volume totale per questo formato di piastra di coltura. Anche la parete interna del pozzo è rivestita da CaP durante entrambe le fasi di rivestimento, pertanto è necessaria cautela nel non toccare il fondo né la parete con la pipetta per proteggere il rivestimento da eventuali danni.

Secondo la nostra osservazione, la maggior parte dei precursori OC espansi dai PBMC sono in grado di attaccarsi al rivestimento CaP senza problemi. Tuttavia, immergere la piastra rivestita con FBS prima della semina cellulare migliora l'efficienza di adesione cellulare, come precedentemente riportato²¹.

Staccare delicatamente i precursori OC usando un raschietto cellulare (passaggio 4.2) è anche importante perché la maggior parte dei precursori OC erano ancora aderenti e ridurre al minimo la lesione meccanica è favorevole per la vitalità cellulare.

Una limitazione di questo metodo è che i PBMC di massa che abbiamo usato come fonte di precursori OC sono una fonte cellulare altamente mista, di cui solo una piccola frazione di cellule (cellule CD14 ⁺) sono veri e propri precursori OC. Poiché altre cellule in grado di influenzare l'osteoclastogenesi (come le cellule stromali e i linfociti) sono presenti tra le PBMC isolate, ciò può influire sui risultati del test in modi che possono essere difficili da prevedere e potrebbe confondere l'interpretazione del test. Per studiare meglio gli effetti diretti dei fattori di crescita, delle citochine o dei glucocorticoidi sull'attività di riassorbimento degli OC, si raccomandano metodi di purificazione dei precursori OC (ad esempio, selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS) e purificazione delle perline magnetiche²⁰ sulla base di specifici marcatori della superficie cellulare ^23,24,25,26).

I limiti del substrato CaP nell'ottenere immagini in campo luminoso di entrambe le cellule e delle fosse sottostanti per la stessa area sono causati dall'incompatibilità della colorazione TRAP e Von Kossa, in modo che l'area di riassorbimento normalizzata dell'intero pozzo non sia disponibile. Ma invece, l'imaging a fluorescenza può essere utilizzato per visualizzare l'area di riassorbimento e il numero di cellule per ottenere dati di riassorbimento normalizzati. Questi dati possono fornire informazioni importanti sul fatto che l'aumento dell'area di riassorbimento totale in condizioni sperimentali sia dovuto all'aumento del numero di osteoclasti da solo o all'aumento della capacità di riassorbimento delle singole cellule. Inoltre, consente lo studio degli effetti relativi del numero di osteoclasti, delle dimensioni, del numero di nuclei e della capacità di riassorbimento.

In sintesi, descriviamo un protocollo utile e semplice per un test di riassorbimento che utilizza un rivestimento in fosfato di calcio in due fasi e OC derivati da PBMC umani primari. Questo protocollo fornisce un metodo semplice per stabilire un modello di riassorbimento osseo in vitro per studi relativi al riassorbimento osteoclastico e potrebbe essere applicato per studiare trattamenti per le malattie dei disturbi ossei.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo lavoro è stato parzialmente finanziato dal China Scholarship Council [CSC No. 201808440394]. W.C. è stato finanziato dal CSC.