JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Erratum Notice
  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Erratum
  • Reprints and Permissions

Erratum Notice

Important: There has been an erratum issued for this article. Read More ...

Summary

هنا ، نقدم إجراء فحص بسيط وفعال لاختبارات حفرة الارتشاف باستخدام ألواح زراعة الخلايا المغلفة بفوسفات الكالسيوم.

Abstract

الخلايا العظمية الناضجة هي خلايا متعددة النوى يمكنها تحلل العظام من خلال إفراز الأحماض والإنزيمات. وهي تلعب دورا حاسما في الأمراض المختلفة (مثل هشاشة العظام وسرطان العظام) وبالتالي فهي أشياء مهمة للبحث. في المختبر ، يمكن تحليل نشاطهم عن طريق تشكيل حفر ارتشاف. في هذا البروتوكول ، نصف طريقة بسيطة لفحص الحفرة باستخدام ألواح زراعة الخلايا المطلية بفوسفات الكالسيوم (CaP) ، والتي يمكن تصورها وتحديدها كميا بسهولة. تم استزراع سلائف Osteoclast المشتقة من خلايا الدم أحادية النواة الطرفية البشرية (PBMCs) على الألواح المطلية في وجود محفزات عظمية المنشأ. بعد 9 أيام من الحضانة ، تم تثبيت الخلايا الآكلة العظمية وتلوينها للتصوير الفلوري بينما تم تلطيخ طلاء CaP بواسطة الكالسيين. لتحديد حجم المنطقة التي تم امتصاصها ، تم تلطيخ طلاء CaP على الألواح بنسبة 5٪ AgNO3 وتم تصوره بواسطة التصوير الساطع. تم قياس مساحة حفرة الارتشاف كميا باستخدام ImageJ.

Introduction

الخلايا العظمية (OCs) هي بلاعم خاصة بالأنسجة مشتقة من الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs) ، وتلعب دورا محوريا في إعادة تشكيل العظام مع الخلايا العظمية1. ترجع اضطرابات العظام الخبيثة والمناعية والخبيثة التي تدمر العظام بشكل منهجي أو محلي إلى النشاط العظمي الزائد ، بما في ذلك هشاشة العظام المرتبطة بانقطاع الطمث2 ، والتهاب المفاصل الروماتويدي3 ، وأمراض اللثة4 ، ومرض العظام النقوي5 ، وورم العظام العظمي6. في المقابل ، يمكن أن تسبب العيوب في تكوين OC ووظيفته أيضا هشاشة العظام7. تخضع HSCs للتمايز إلى أسلاف OC تحت تحفيز عامل تحفيز مستعمرة البلاعم (M-CSF ، رمز الجين ACP5). في وجود كل من M-CSF ومنشط مستقبلات رباط NF-κB (RANKL ، رمز الجين TNFSF11) ، يفرق أسلاف OC بشكل أكبر في OCs أحادية النواة ثم يندمجون لاحقا ليصبحوا OCs متعددة النوى 8,9,10. كل من السيتوكينات M-CSF و RANKL لا غنى عنهما وكافيان لتحريض علامات العظم مثل مستقبلات الكالسيتونين (CT) ، منشط مستقبلات العامل النووي κ B (RANK) ، مضخة البروتون V-ATPase ، الوحدة الفرعية لقناة الكلوريد 7 ألفا (CIC-7) ، integrin β3 ، فوسفاتيز حمض التطرطرات المقاوم للطرطرات (TRAP ، رمز الجين ACP5) ، كاسيبسين البروتياز البروتيني الليزوسومي K (CTSK) ، ومصفوفة metallopeptidase 9 (MMP9). تشكل OCs المنشطة منطقة مانعة للتسرب على سطح العظام من خلال تكوين حلقة أكتين ذات حدود كشكش11,12. داخل منطقة الختم ، تتوسط OCs في الارتشاف من خلال إفراز البروتونات عبر مضخة البروتون V-ATPase12,13 و MMP9 14 و CTSK15 ، مما يؤدي إلى تكوين الثغرات.

بالنسبة للتجارب المخبرية ، يمكن الحصول على أسلاف OC عن طريق توسيع البلاعم في نخاع العظم من عظم الفخذ والساق 16,17 ، وكذلك عن طريق عزل خلايا الدم أحادية النواة الطرفية البشرية (PBMCs) من عينات الدم والمعاطف الباهتة18,19,20 ، أو عن طريق تمايز الخلايا الوحيدة المخلدة في الفئران RAW 264.7 21,22.

في هذا البروتوكول ، نصف اختبار ارتشاف العظام في لوحات زراعة الخلايا المطلية ب CaP باستخدام OCs المشتقة من PBMCs الأولية. تم اعتماد طريقة لوحات زراعة الخلايا المطلية CaP المستخدمة هنا وصقلها من الطريقة التي وصفها سابقا Patntirapong et al.17 و Maria et al.21. للحصول على سلائف OC ، يتم عزل PBMCs بواسطة الطرد المركزي المتدرج للكثافة وتوسيعها كما هو موضح سابقا20.

Protocol

تمت مراجعة البروتوكول والموافقة عليه من قبل لجنة الأخلاقيات المحلية (رقم الموافقة 287/2020B02).

1. إعداد لوحات زراعة الخلايا المغلفة بفوسفات الكالسيوم

  1. تحضير محلول مخزون الكالسيوم (25 mM CaCl 2·2H2O, 1.37 mM NaCl, 15 mM MgCl 2·6H 2 O in Tris buffer)
    1. قم بإعداد مخزن مؤقت 1.0 M Tris واضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.4 باستخدام 1 M HCl.
    2. قم بإعداد كوب زجاجي على مقلب مغناطيسي وأضف 100 مل من المخزن المؤقت 1.0 M Tris.
    3. يزن 0.368 جم من CaCl 2·2H 2O ، و 8.0 جم من كلوريد الصوديوم ، و 0.305 جم من MgCl 2·6H2 O ويذوب في مخزن Tris العازل واحدا تلو الآخر.
    4. اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.4 باستخدام 1 M HCl. يخزن في درجة حرارة الغرفة.
  2. تحضير محلول مخزون الفوسفات (11.1 mM Na2HPO4· H2O، 42 mM NaHCO3 في المخزن المؤقت Tris)
    1. قم بإعداد كوب زجاجي على مقلب مغناطيسي وأضف 100 مل من المخزن المؤقت 1.0 M Tris.
    2. يزن 0.158 جم من Na2HPO4· H2O و 0.353 g من NaHCO3 ويذوب في المخزن المؤقت Tris واحدا تلو الآخر.
    3. اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.4 باستخدام 1 M HCl. يخزن في درجة حرارة الغرفة.
  3. ما قبل تكلس لوحات زراعة الخلايا 96 بئرا
    1. قم بإعداد 30 مل من محلول العمل عن طريق خلط 15 مل من المخزن المؤقت Tris 1.0 M ، و 7.5 مل من محلول مخزون الكالسيوم (الخطوة 1.1.4) ، و 7.5 مل من محلول مخزون الفوسفات (الخطوة 1.2.3). قم بتصفية الحل باستخدام مرشح 0.2 ميكرومتر.
    2. قم بإعداد لوحة زراعة خلايا من 96 بئرا ذات قاع مسطح. ماصة 300 ميكرولتر من محلول فوسفات الكالسيوم (الخطوة 1.3.1) لكل بئر. قم بتغطية اللوحة بغطاء واحتضن اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 3 أيام.
  4. تحضير محلول فوسفات الكالسيوم (2.25 mM Na2HPO4· H2O، 4 mM CaCl 2·2H 2 O، 0.14 M NaCl، 50 mM Tris base in ddH 2O)
    1. أضف 2 مل من 1 M HCl إلى 40 مل من الماء منزوع الأيونات في كوب مع حبة تحريك مغناطيسية وقم بإذابة 0.016 جم من Na2HPO4· H2O، 0.0295 g من CaCl2·2H2O، 0.409 g من كلوريد الصوديوم، و 0.303 g من قاعدة Tris واحدة تلو الأخرى.
    2. اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.4 باستخدام 1 M HCl. أضف الماء منزوع الأيونات لملء الحجم إلى 50 مل. قم بتصفية الحل باستخدام مرشح 0.2 ميكرومتر.
  5. تكلس لوحات زراعة الخلايا 96 بئرا
    1. استنشق محلول ما قبل التكلس من ألواح زراعة الخلايا المكونة من 96 بئرا المتكلسة مسبقا وأضف 300 ميكرولتر من محلول فوسفات الكالسيوم (الخطوة 1.4.2) إلى كل بئر. تغطية لوحات مع غطاء وحضانة في 37 درجة مئوية لمدة 1 يوم.
    2. اقلب الطبق لصب المحلول واغسل الطبق ثلاث مرات بالماء منزوع الأيونات جيدا. جفف اللوحة على الفور باستخدام مجفف شعر أو غاز CO 2 أو N2 مضغوط للحفاظ على سطح موحد.
    3. تعقيم اللوحة المطلية بالأشعة فوق البنفسجية في مقعد نظيف لمدة 1 ساعة. استخدم اللوحة المطلية على الفور أو أغلق اللوحة باستخدام parafilm وخزنها في درجة حرارة الغرفة.

2. عزل PBMCs عن الدم المحيطي البشري

  1. سحب 15 مل من الدم من الوريد بعد الحصول على موافقة خطية مستنيرة من المتبرع بالدم (التصويت الأخلاقي: 287/2020B02).
  2. تمييع 15 مل من الدم الطازج مع حجم متساو من PBS وتخلط عن طريق عكس الأنبوب عدة مرات أو عن طريق سحب الخليط داخل وخارج ماصة.
  3. قم بإعداد أنبوب مخروطي سعة 50 مل يحتوي على 15 مل من محلول تدرج الكثافة (على سبيل المثال ، Ficoll ، جدول المواد) لكل أنبوب. قم بإمالة الأنبوب وقم بطبقة 30 مل من عينة الدم المخففة بعناية على محلول تدرج الكثافة 15 مل (عينة الدم المخففة: محلول تدرج الكثافة ، نسبة 1: 0.5-1).
    ملاحظة: عند تراكب العينة، انتبه إلى عدم خلط محلول تدرج الكثافة مع عينة الدم المخففة.
  4. جهاز طرد مركزي بسرعة 810 × جم لمدة 20 دقيقة عند 20 درجة مئوية في دوار دلو متأرجح بدون فرامل.
  5. شفط الطبقة العليا تاركا طبقة الخلايا أحادية النواة (الخلايا الليمفاوية والخلايا الوحيدة والصفيحات) دون عائق في الطور البيني.
  6. انقل طبقة الخلايا أحادية النواة بعناية إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 50 مل.
  7. املأ الأنبوب ب PBS ، واخلطه ، وأجهزة الطرد المركزي عند 300 × g لمدة 10 دقائق عند 20 درجة مئوية (يمكن استخدام الفرامل من هذه المرحلة فصاعدا).
  8. قم بإزالة supernatant بعناية تماما. أعد تعليق حبيبات الخلايا في 50 مل من PBS وأجهزة الطرد المركزي عند 300 × g لمدة 10 دقائق عند 20 درجة مئوية. قم بإزالة supernatant بعناية تماما.
  9. لإزالة الصفائح الدموية ، أعد تعليق حبيبات الخلية في 50 مل من PBS وأجهزة الطرد المركزي عند 200 × g لمدة 10 دقائق عند 20 درجة مئوية. قم بإزالة supernatant بعناية تماما.
  10. نقل الخلايا المعاد تعليقها إلى قوارير زراعة الخلايا لتوسيع أسلاف OC.

3. توسيع أسلاف OC

  1. إعادة تعليق PBMCs بالكامل α-MEM (10٪ FBS ، 1٪ Pen / Strep ، 1٪ amphotericin B) التي تحتوي على 20 نانوغرام / مل M-CSF. بذور PBMCs بكثافة 2.5 × 105 خلايا / سم2. عادة ، يمكن زرع الخلايا المعزولة من 15-20 مل من الدم الطازج في قارورة واحدة 75 سم 2 (1.5-2 × 107 خلايا).
  2. قم بتغذية الخلايا ب α-MEM كاملة طازجة تحتوي على 20 نانوغرام / مل M-CSF كل ثلاثة أيام حتى تصل الخلايا المرفقة إلى التقاء المطلوب. الغلة النموذجية هي 1.5-2 × 106 خلايا / قارورة عندما تكون الخلايا ملتقية بنسبة 95٪. عادة ، تستمر فترة التوسع 6 أيام.
    ملاحظة: يمكن أن تنخفض الإمكانات العظمية المنشأ للسلائف مع طول وقت الزراعة.

4. تحريض تكوين العظم في الألواح المغلفة CaP

  1. لتسهيل التصاق الخلايا، احتضن الألواح المطلية بتقنية CaP ب 50 ميكرولتر من FBS لمدة 1 ساعة في حاضنة 37 درجة مئوية.
  2. لفصل سلائف OC ، اغسل القارورة باستخدام PBS مرتين لإزالة الخلايا الميتة أو غير الملتصقة. أضف 4 مل من التربسين (جدول المواد) لكل قارورة 75 سم2 ، لمدة 30 دقيقة.
    1. أضف 4 مل من α-MEM الكامل لوقف الهضم ، وافصل الخلايا بعناية باستخدام مكشطة الخلايا وانقل الخلايا إلى أنبوب 50 مل.
    2. حدد إجمالي عدد الخلايا باستخدام غرفة نيوباور أو ما شابه ذلك.
  3. قم بتكوير الخلايا عن طريق الطرد المركزي لمدة 7 دقائق عند 350 × جم. أعد تعليق الكريات في α-MEM كاملة كافية تحتوي على 20 نانوغرام / مل M-CSF و 20 نانوغرام / مل RANKL للحصول على تركيز 1 × 106 خلايا / مل.
  4. استنشاق محلول FBS من لوحة CaP المطلية ب 96 بئرا وماصة 200 ميكرولتر من تعليق الخلايا لكل بئر (2 × 105 خلايا / بئر).
  5. احتضان سلائف OC للفترة الزمنية المطلوبة أو مع الكواشف المطلوبة ذات الصلة بالتصميم التجريبي. عادة ، يمكن ملاحظة أعداد كبيرة من OCs الكبيرة والمتعددة النوى بعد 6 أيام وعندما تتشكل حفر الارتشاف. تغذية الخلايا مع وسط α-MEM كامل طازج يحتوي على 20 نانوغرام / مل M-CSF و 20 نانوغرام / مل RANKL كل ثلاثة أيام.
  6. في نهاية الحضانة ، اغسل الخلايا باستخدام PBS مرتين ، وقم بإصلاحه بنسبة 4٪ paraformaldehyde لمدة 10 دقائق ، واغسله باستخدام PBS مرة أخرى.
  7. استخدم OCs الثابتة مباشرة لتلطيخ التألق أو تخزينها عند 4 درجات مئوية.

5. تلطيخ التألق من OCs وطلاء CaP

  1. احتضن الخلايا الثابتة باستخدام مخزن مؤقت للنفاذية (0.1٪ Triton في PBS) لمدة 5 دقائق.
  2. بقع خيوط الأكتين مع 100 ميكرولتر من محلول الفيلويدين المسمى AlexaFluor 546 في PBS لمدة 30 دقيقة وشفط محلول التلطيخ. أضف 100 ميكرولتر من محلول تلطيخ Hoechst 33342 (10 ميكروغرام / مل في PBS) لمدة 10 دقائق لتلطيخ النوى. يمكن أيضا استخدام DAPI.
  3. طلاء CaP اللعين مع 100 ميكرولتر من 10 ميكرومتر كالسيين في PBS لمدة 10 دقائق. اغسل ثلاث مرات باستخدام PBS والتقط الصور.
  4. بعد التصوير الفلوري ، يمكن استخدام نفس اللوحات لتحديد مساحة حفرة الارتشاف بواسطة تلطيخ فون كوسا. للقيام بذلك ، اغسل الألواح بالماء منزوع الأيونات مرتين.

6. القياس الكمي لإجمالي مساحة حفرة الارتشاف

  1. لتلطيخ طلاء CaP مع تلطيخ فون كوسا ، احتضان مع 50 ميكرولتر من 5٪ AgNO3 في الماء منزوع الأيونات لكل بئر تحت الأشعة فوق البنفسجية لمدة 1 ساعة ، حتى يتحول الطلاء الموجود في قاع الآبار إلى اللون البني.
  2. اغسل اللوحة ثلاث مرات بالماء منزوع الأيونات والتقط صورا ساطعة. يمكن استخدام هدف قليل التكبير ، مثل هدف 1.25x ، لالتقاط البئر بالكامل في صورة واحدة. هذا يسهل تحليل الصور اللاحقة. يمكن تطبيق طرق بديلة لالتقاط كامل مساحة البئر.
  3. فتح ملف صورة باستخدام ImageJ: | الملفات فتح | صورة | النوع | 8 بت. تحقق من وحدة المقياس في الزاوية السفلية اليسرى من الصورة باستخدام الخط المستقيم | تحليل | تعيين المقياس. أدخل الطول في بطانية "المسافة المعروفة"، وأدخل وحدة مقياس جديدة في وحدة الطول، وحدد المربع عالمي.
  4. قائمة معلمات القياس المراد تحليلها: تحليل | تعيين القياسات. في النافذة تعيين القياسات، حدد المربعين المساحة والحد إلى العتبة.
  5. قياس مساحة الحفر: الصورة | ضبط | العتبة. في نافذة العتبة، حدد خانة الاختيار خلفية داكنة وانقر فوق تلقائي. تتحول مساحة الحفر إلى اللون الأحمر. أغلق نافذة العتبة وحدد تحليل | القياس. حفظ ملف النتيجة: ملف | حفظ باسم.

7. تحديد كمية عدد OC وحجمه ، ومنطقة حفرة الارتشاف العادية

  1. افتح صورة فلورية لخلايا الخلايا الآكلة للعظم باستخدام ImageJ وتحقق من وحدة المقياس (انظر الخطوة 6.3).
  2. قائمة معلمات القياس المراد تحليلها: تحليل | تعيين القياسات. في النافذة تعيين القياسات، حدد المربع منطقة .
  3. حدد OCs باستخدام مدير عائد الاستثمار وتحديدات المضلع: قم بتحليل | أدوات | مدير العائد على الاستثمار. انقر فوق تحديدات المضلع في مجموعة الأدوات، وحدد OC واحدا (الخلايا ذات حلقة الأكتين ≥ ثلاث نواة) وانقر فوق إضافة [t] في نافذة إدارة عائد الاستثمار. كرر الخطوط العريضة حتى يتم تضمين جميع OCs.
  4. قياس عدد وحجم OCs: حدد جميع العناصر في مدير عائد الاستثمار وانقر على قياس. حفظ ملف النتيجة: | الملفات حفظ باسم (الشكل 3E).
  5. قياس منطقة حفرة الصور الفلورية. افتح الصورة الفلورية للطلاء المرتبط بالصورة في الخطوة 7.3 وتحقق من وحدة المقياس (انظر الخطوة 6.3).
    1. قائمة معلمات القياس المراد تحليلها (انظر الخطوة 6.4). حدد | الصورة ضبط | العتبة. في نافذة العتبة، ألغ تحديد كافة المربعات وانقر فوق تلقائي. تتحول مساحة الحفر إلى اللون الأحمر. أغلق نافذة العتبة وحدد تحليل | القياس. احفظ ملف النتيجة.
  6. حساب مساحة الحفرة العادية برقم OC.

النتائج

تم تنفيذ طلاء فوسفات الكالسيوم في الجزء السفلي من ألواح زراعة الخلايا في خطوتين للطلاء تتضمنان تكلس مسبق لمدة 3 أيام وخطوة تكلس لمدة 1 يوم. كما هو موضح في الشكل 1 ، تم الحصول على فوسفات الكالسيوم الموزع بشكل موحد في الجزء السفلي من لوحات البئر 96. التزم الطلاء جيدا بالقاع بعد خطوات الغسيل المنجزة.

figure-results-425
الشكل 1: صورة برايت فيلد تمثيلية لطلاء فوسفات الكالسيوم على لوحات زراعة الخلايا المكونة من 96 بئرا. تم تنفيذ الطلاء في خطوتين للطلاء تتضمنان خطوة ما قبل التكلس لمدة 3 أيام وخطوة تكلس لمدة 1 يوم. يمثل شريط المقياس 200 ميكرومتر .

تم استزراع سلائف OC المشتقة من PBMCs البشرية على الألواح المطلية CaP. تم تشكيل حفر الارتشاف و OCs الكبيرة (منطقة فارغة) في وجود M-CFS و RANKL بعد 9 أيام من الثقافة (الشكل 2A). عبرت OCs متعددة النوى الموجودة في حفر طلاء CaP عن مستويات عالية من TRAP (الشكل 2B).

figure-results-1298
الشكل 2: تعبير TRAP بواسطة OCs بعد النضج على ألواح زراعة الخلايا المطلية ب CaP. وزرعت سلائف OC على صفائح مغلفة ب CaP في وجود 20 نانوغرام/مل M-CSF و 20 نانوغرام/مل رانكل لمدة 9 أيام. (أ) تمثل المساحة الفارغة حفر الارتشاف. (ب) لوحظت عدة حالات متعددة النوى إيجابية TRAP (أرجوانية) داخل حفر الارتشاف. يمثل شريط المقياس 200 ميكرومتر .

لزيادة توصيف نضج OCs على الألواح المطلية ب CaP ، تم تلطيخ الخلايا بالأكتين (التألق الأحمر). كانت نوى الخلايا ملطخة ب Hoechst (أزرق) وتم استخدام الكالسين لتصور الكالسيوم باللون الأخضر. تظهر حفر الارتشاف كمناطق سوداء في طلاء CaP الأخضر (الشكل 3B). أظهرت OCs الناضجة الوظيفية ثلاث نوى أو أكثر وحلقة الأكتين المميزة التي تعد ضرورية للارتشاف العظمي المنشأ (الشكل 3A ، C). يمكن قياس مساحة حفرة الصور الفلورية باستخدام أداة العتبة الخاصة ب ImageJ (الشكل 3D). يمكن حساب عدد وحجم OCs باستخدام أداة اختيار مدير عائد الاستثمار والمضلع في ImageJ (الشكل 3E).

figure-results-2670
الشكل 3: مورفولوجيا OCs الناضجة على طلاء CaP. وزرعت سلائف OC على صفائح مطلية ب CaP لمدة 9 أيام بحضور 20 نانوغرام/مل M-CSF و 20 نانوغرام/مل من نوع RANKL. (أ) تم تلطيخ OCs للأكتين والنوى بواسطة phalloidin-Alexa Fluor 546 و Hoechst 33342. (ب) كان طلاء CaP ملطخا بالكالسيوم. تمثل المناطق السوداء حفر ارتشاف. (ج) الصورة المدمجة. (د) التحديد الكمي لمساحة الحفرة (المنطقة الحمراء) باستخدام أداة العتبة ImageJ. (ه) OC تحديد والعد باستخدام مدير عائد الاستثمار وأداة اختيار المضلع من ImageJ. يمثل شريط المقياس 500 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

لتحديد كمي لحفر الارتشاف على ألواح زراعة الخلايا المطلية ب CaP ، تم تلطيخ الكالسيوم بالحضانة بنسبة 5٪ AgNO3 (تلطيخ فون كوسا). وكما هو مبين في الشكل 4 ألف، لم تصل سلائف OC إلى وظائفها الكاملة في غياب RANKL ولم تكن قادرة على تشكيل حفر ارتشاف. لوحظت حفر عظمية الشكل فقط في وجود كلا العاملين M-CSF و RANKL (الشكل 4B). تم تحديد مساحة حفرة الارتشاف كميا باستخدام أداة العتبة ImageJ (الشكل 4C).

figure-results-4127
الشكل 4: تصور وقياس كمي لحفر الارتشاف. تم استزراع سلائف OC على ألواح زراعة الخلايا المغلفة ب 96 بئرا في CaP في غياب RANKL (A) وفي وجود كل من العوامل M-CSF و RANKL (B). (ج) تم تحديد أعداد حفر الارتشاف المشكلة كميا باستخدام أداة العتبة ImageJ. يمثل شريط المقياس 1000 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

هنا نصف طريقة بسيطة وموثوقة لفحص ارتشاف العظام باستخدام OCs المشتقة والموسعة في المختبر من PBMCs. يمكن تحضير لوحات زراعة الخلايا المغلفة ب CaP المستخدمة بسهولة وتصورها باستخدام المواد المتاحة في المختبر. بالإضافة إلى PBMCs غير المصنفة المعتمدة في هذا البروتوكول ، تم أيضا استزراع OCs المتولدة من الخلايا أحادية الخلايا الفئران21 وخلايا البلاعم في نخاع العظم17 على ركائز اصطناعية مماثلة لفحص الحفرة ، وبالتالي يمكن نقل مصادر الخلايا هذه إلى هذا النهج في إشارة إلى الأدبيات المقابلة.

بالنسبة لهذا البروتوكول ، استخدمنا طلاء CaP بسيط في المختبر بدلا من لوحات الفحص باهظة الثمن المتاحة تجاريا. على الرغم من أن شرائح العظام والعاج هما مادتان شائعتان وبأسعار معقولة قابلتان للامتصاص لفحص حفرة الارتشاف ، إلا أن التوافر والتحضير المعقد هما عيوبان رئيسيتان. كركيزة اصطناعية سهلة التحضير ، يعد طلاء CaP أكثر ملاءمة ومتاحا بسهولة من المادتين الأصليتين. ميزة أخرى لنهج فحص الحفرة هذا هي أنه يمكن تصور الخلايا تحت مجهر حقل ساطع أثناء الزراعة ، في حين لا يمكن ملاحظة الخلايا التي تنمو على شرائح العظام والعاج غير الشفافة.

يمكن تكييف طريقة طلاء CaP هذه بمرونة وفقا للاحتياجات التجريبية المطلوبة لأحجام لوحات زراعة الخلايا المختلفة.

على عكس 17,21 التي تم الإبلاغ عنها سابقا ، فإننا نحتضن الألواح بمحلول طلاء عند37 درجة مئوية بدلا من درجة حرارة الغرفة ، مما يؤدي إلى النمو التلقائي لنوى الأباتيت على ألواح زراعة الخلايا في درجة حرارة الجسم. تتوفر الألواح المطلية ب CaP للتجارب مباشرة بعد تجفيفها وتعقيمها بواسطة الأشعة فوق البنفسجية ، مما يوفر الوقت مقارنة بالطرق المذكورة سابقا 17,21.

يعد ترشيح محلول الطلاء (الخطوة 1.3.1 و 1.4.2) خطوة حاسمة ، مما يساعد على الحصول على حجم جسيمات موحد وتقليل البقع غير المطلية داخل الطلاء الناجم عن فقاعات الهواء والشوائب في المحلول. يعد تجفيف اللوحة على الفور (الخطوة 1.5.2) خطوة حاسمة أخرى ، مما يساعد على إنشاء طلاء CaP موحد. خلاف ذلك ، فهي عرضة لتشكيل طلاء أكثر سمكا في منتصف البئر.

تجدر الإشارة إلى أن سمك الطلاء وكثافة رواسب فوسفات الكالسيوم يعتمدان على حجم محلول الطلاء ضمن نطاق معين. لذلك ، من الممكن التحكم في سمك الطلاء عن طريق تغيير حجم محلول الطلاء في البئر. ومع ذلك ، يقترح إضافة أكبر قدر ممكن من حجم محلول الطلاء عند استخدام لوحة زراعة الخلايا المكونة من 96 بئرا بسبب الحجم الإجمالي الصغير لتنسيق لوحة الثقافة هذا. يتم طلاء الجدار الداخلي للبئر أيضا بواسطة CaP خلال خطوتي الطلاء ، لذلك يجب توخي الحذر لعدم لمس الجزء السفلي ولا الجدار مع الماصة من أجل حماية الطلاء من التلف.

وفقا لملاحظتنا ، فإن معظم سلائف OC الموسعة من PBMCs قادرة على الالتصاق بطلاء CaP دون أي مشاكل. ومع ذلك ، فإن نقع اللوحة المطلية ب FBS قبل بذر الخلايا يحسن كفاءة التصاق الخلايا ، كما ذكر سابقا21.

فصل سلائف OC بلطف باستخدام مكشطة الخلية (الخطوة 4.2) مهم أيضا لأن معظم سلائف OC كانت لا تزال ملتصقة ، وتقليل الإصابة الميكانيكية إلى الحد الأدنى مفيد لبقاء الخلية.

أحد القيود المفروضة على هذه الطريقة هو أن PBMCs السائبة التي استخدمناها كمصدر لسلائف OC هي مصدر خلوي مختلط للغاية ، حيث أن جزءا صغيرا فقط من الخلايا (خلايا CD14 +) هي سلائف OC الفعلية. نظرا لأن الخلايا الأخرى القادرة على التأثير على تكوين العظم (مثل الخلايا اللحمية والخلايا الليمفاوية) موجودة بين PBMCs المعزولة ، فقد يؤثر ذلك على نتائج الفحص بطرق قد يكون من الصعب التنبؤ بها ، وقد يربك تفسير المقايسة. للتحقيق بشكل أفضل في الآثار المباشرة لعوامل النمو أو السيتوكينات أو القشرانيات السكرية على النشاط الارتشافي ل OCs ، يوصى بطرق تنقية سلائف OC (على سبيل المثال ، فرز الخلايا المنشطة بالفلور (FACS) وتنقية الخرز المغناطيسي 20 استنادا إلى علامات سطح الخلية المحددة 23،24،25،26).

إن قيود الركيزة CaP في الحصول على صور ساطعة لكل من الخلايا والحفر الأساسية لنفس المنطقة ناتجة عن عدم توافق تلطيخ TRAP و Von Kossa ، بحيث لا تتوفر منطقة ارتشاف طبيعية للبئر بأكمله. ولكن بدلا من ذلك ، يمكن استخدام التصوير الفلوري لتصور منطقة الارتشاف ورقم الخلية للحصول على بيانات ارتشاف طبيعية. قد توفر هذه البيانات نظرة ثاقبة مهمة حول ما إذا كانت الزيادة في إجمالي مساحة الارتشاف في ظل الظروف التجريبية ترجع إلى زيادة عدد الخلايا العظمية وحدها أو زيادة قدرة الارتشاف للخلايا الفردية. بالإضافة إلى ذلك ، فإنه يسمح بدراسة الآثار النسبية لعدد osteoclast والحجم وعدد النواة وقدرة الارتشاف.

باختصار ، نصف بروتوكولا مفيدا وبسيطا لفحص حفرة الارتشاف باستخدام طلاء فوسفات الكالسيوم المكون من خطوتين و OCs المشتقة من PBMCs البشرية الأولية. يوفر هذا البروتوكول طريقة سهلة لإنشاء نموذج ارتشاف العظام في المختبر للدراسات المتعلقة بارتشاف العظام ، ويمكن تطبيقه لدراسة علاجات أمراض اضطرابات العظام.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

تم تمويل هذا العمل جزئيا من قبل مجلس المنح الدراسية الصيني [CSC No. 201808440394]. تم تمويل W.C. من قبل CSC.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
AgNO3SERVA Electrophoresis GmbH35110Silver nitrate
a-MEMGibco32561-029MEM alpha, GlutaMAX, no nucleosides
amphotericin BBiochrom03-028-1BAmphotericin B Solution
CaCl2Sigma-Aldrich21097-50GCalcium chloride Dihydrate
CalceinSigma-AldrichC0875Calcein
FBSSigma-AldrichF7524fetal bovine serum
FicollCytiva17144002Ficoll Paque Plus
Fixation bufferBiolegend420801Paraformaldehyde
HClMerk1.09057.1000Hydrochloric acid
Hoechst 33342PromokinePK-CA707-40046Hoechst 33342
M-CSFPeproTech300-25Recombinant Human M-CSF
MgCl2Sigma-Aldrich7791-18-6Magnesium chloride
Na2HPO4AppliChem GmbHA2943,0250di- Sodium hydrogen phosphate anhydrous
NaClMerkS7653-250GSodium chloride
NaHCO3MerkK15322429Bicarbonate of Soda
PBSLonza17-512FDulbecco's Phosphate Buffered Saline (1X), DBPS without Calcium and Magnesium
Pen-StrepLonzaDE17-602EPenicillin-Streptomycin Mixture
Phalloidin-Alexa Fluor 546InvitrogenA22283Alexa Fluor 546 Phalloidin
RANKLPeproTech310-01Recombinant Human sRANK Ligand (E.coli derived)
TrisSigma-Aldrich93362Tris(hydroxymethyl)aminomethan
Triton X-100Sigma-AldrichT8787Alkyl Phenyl Polyethylene Glycol
TrypLE ExpressGibco12605010Recombinant cell-dissociation enzymes

References

  1. Jacome-Galarza, C. E., et al. Developmental origin, functional maintenance and genetic rescue of osteoclasts. Nature. 568 (7753), 541-545 (2019).
  2. Moller, A. M. J., et al. Aging and menopause reprogram osteoclast precursors for aggressive bone resorption. Bone Research. 8 (1), 1-11 (2020).
  3. Yokota, K., et al. Characterization and function of tumor necrosis factor and interleukin-6-induced osteoclasts in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheumatology. 73 (7), 1145-1154 (2021).
  4. Teng, Y. T., et al. Functional human T-cell immunity and osteoprotegerin ligand control alveolar bone destruction in periodontal infection. Journal of Clinical Investigation. 106 (6), 59-67 (2000).
  5. Terpos, E., et al. Soluble receptor activator of nuclear factor kappaB ligand-osteoprotegerin ratio predicts survival in multiple myeloma: proposal for a novel prognostic index. Blood. 102 (3), 1064-1069 (2003).
  6. Morony, S., et al. Osteoprotegerin inhibits osteolysis and decreases skeletal tumor burden in syngeneic and nude mouse models of experimental bone metastasis. Cancer Research. 61 (11), 4432-4436 (2001).
  7. Sobacchi, C., Schulz, A., Coxon, F. P., Villa, A., Helfrich, M. H. Osteopetrosis: genetics, treatment and new insights into osteoclast function. Nature Reviews Endocrinology. 9 (9), 522-536 (2013).
  8. Amarasekara, D. S., et al. Regulation of osteoclast differentiation by cytokine networks. Immune Network. 18 (1), 8 (2018).
  9. Kim, J. M., Lin, C., Stavre, Z., Greenblatt, M. B., Shim, J. H. Osteoblast-osteoclast communication and bone homeostasis. Cells. 9 (9), (2020).
  10. Teitelbaum, S. L. Bone resorption by osteoclasts. Science. 289 (5484), 1504-1508 (2000).
  11. Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. Osteoclast differentiation and activation. Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).
  12. Baron, R., Neff, L., Louvard, D., Courtoy, P. J. Cell-mediated extracellular acidification and bone resorption: evidence for a low pH in resorbing lacunae and localization of a 100-kD lysosomal membrane protein at the osteoclast ruffled border. Journal of Cell Biology. 101 (6), 2210-2222 (1985).
  13. Blair, H. C., Teitelbaum, S. L., Ghiselli, R., Gluck, S. Osteoclastic bone resorption by a polarized vacuolar proton pump. Science. 245 (4920), 855-857 (1989).
  14. Zhu, L., et al. Osteoclast-mediated bone resorption is controlled by a compensatory network of secreted and membrane-tethered metalloproteinases. Science Translational Medicine. 12 (529), 6143 (2020).
  15. Gowen, M., et al. Cathepsin K knockout mice develop osteopetrosis due to a deficit in matrix degradation but not demineralization. The Journal of Bone and Mineral Research. 14 (10), 1654-1663 (1999).
  16. Abu-Amer, Y. IL-4 abrogates osteoclastogenesis through STAT6-dependent inhibition of NF-kappaB. Journal of Clinical Investigation. 107 (11), 1375-1385 (2001).
  17. Patntirapong, S., Habibovic, P., Hauschka, P. V. Effects of soluble cobalt and cobalt incorporated into calcium phosphate layers on osteoclast differentiation and activation. Biomaterials. 30 (4), 548-555 (2009).
  18. Sorensen, M. G., et al. Characterization of osteoclasts derived from CD14+ monocytes isolated from peripheral blood. The Journal of Bone and Mineral Metabolism. 25 (1), 36-45 (2007).
  19. Kumar, A., et al. Synergistic effect of biphasic calcium phosphate and platelet-rich fibrin attenuate markers for inflammation and osteoclast differentiation by suppressing NF-kappaB/MAPK signaling pathway in chronic periodontitis. Molecules. 26 (21), 6578 (2021).
  20. Henriksen, K., Karsdal, M. A., Taylor, A., Tosh, D., Coxon, F. P. Generation of human osteoclasts from peripheral blood. Methods in Molecular Biology. 816, 159-175 (2012).
  21. Maria, S. M., et al. Reproducible quantification of osteoclastic activity: characterization of a biomimetic calcium phosphate assay. Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 102 (5), 903-912 (2014).
  22. Kong, L., Smith, W., Hao, D. Overview of RAW264.7 for osteoclastogensis study: Phenotype and stimuli. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (5), 3077-3087 (2019).
  23. Li, P., et al. Systemic tumor necrosis factor alpha mediates an increase in peripheral CD11bhigh osteoclast precursors in tumor necrosis factor alpha-transgenic mice. Arthritis & Rheumatology. 50 (1), 265-276 (2004).
  24. Arai, F., et al. Commitment and differentiation of osteoclast precursor cells by the sequential expression of c-Fms and receptor activator of nuclear factor kappaB (RANK) receptors. Journal of Experimental Medicine. 190 (12), 1741-1754 (1999).
  25. Xing, L., et al. NF-kappaB p50 and p52 expression is not required for RANK-expressing osteoclast progenitor formation but is essential for RANK- and cytokine-mediated osteoclastogenesis. The Journal of Bone and Mineral Research. 17 (7), 1200-1210 (2002).
  26. Miyamoto, T., et al. Bifurcation of osteoclasts and dendritic cells from common progenitors. Blood. 98 (8), 2544-2554 (2001).

Erratum


Formal Correction: Erratum: A Simple Pit Assay Protocol to Visualize and Quantify Osteoclastic Resorption In Vitro
Posted by JoVE Editors on 6/10/2024. Citeable Link.

This corrects the article 10.3791/64016

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

184

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved