無細胞自己誘導ワークフローを使用した24時間以内に細胞から無細胞タンパク質合成へ

この研究は、 大腸菌(E.coli )からの細胞抽出物の調製とそれに続く無細胞タンパク質合成(CFPS)反応を24時間未満で記載する。無細胞自己誘導(CFAI)プロトコルの説明は、研究者の監督を減らし、得られる細胞抽出物の量を増やすために行われた改善を詳述する。

無細胞タンパク質合成(CFPS)は、 インビトロで転写および翻訳機構を捕捉するバイオテクノロジープラットフォームとして成長してきました。数多くの開発により、CFPSプラットフォームは新規ユーザーにとってよりアクセスしやすくなり、アプリケーションの範囲が拡大しました。溶解物ベースのCFPSシステムの場合、細胞抽出物を様々な生物から生成することができ、その宿主のユニークな生化学を利用してタンパク質合成を増強することができる。過去20年以内に、 大腸菌 (E. coli) は、その手頃な価格と汎用性のためにCFPSをサポートするために最も広く使用されている生物の1つになりました。多くの重要な進歩にもかかわらず、 大腸菌 細胞抽出物調製のワークフローは、新規ユーザーがアプリケーションにCFPSを実装するための重要なボトルネックであり続けています。抽出準備ワークフローは時間がかかり、再現性のある結果を得るためには技術的な専門知識が必要です。これらの障壁を克服するために、私たちは以前、ユーザー入力と必要な技術的専門知識を減らす24時間無細胞自動誘導(CFAI)ワークフローの開発を報告しました。CFAIワークフローは、細胞抽出物を生成するために必要な労力と技術的スキルを最小限に抑えながら、得られる細胞抽出物の総量も増加させます。ここでは、アクセスを改善し、 大腸菌 ベースのCFPSの広範な実装をサポートするために、そのワークフローを段階的に説明します。

バイオテクノロジー用途のための無細胞タンパク質合成(CFPS)の使用は、過去数年間で大幅に増加しています^1,2,3。この開発は、CFPSで発生するプロセスと各コンポーネントの役割を理解するための努力の増加に一部起因する可能性があります^4,5。さらに、最適化されたセットアップと代替エネルギー源に起因するコスト削減により、無細胞技術は新規ユーザーの実装が容易になりました6,7,8,9。タンパク質合成に必要な転写および翻訳因子を実施するために、細胞抽出物は、無細胞反応¹⁰を駆動するためにしばしば使用される。最近公開されたユーザーガイドは、機能的な抽出を生成するための簡単なプロトコルを提供しており、新規ユーザーでも経験豊富なユーザーでも簡単に実装できます1,11,12,13,14。細胞抽出物は、通常、細胞培養物の溶解を通して得られ、これは、所望の特定の用途に応じて異なる生物を用いて増殖させることができる1^、15、16。

大腸菌(E. coli)は、機能性抽出物¹⁷を生産するために最も一般的に使用される宿主生物の1つとして急速になっている。BL21スター(DE3)株は、外膜(OmpTプロテアーゼ)および細胞質(ロンプロテアーゼ)からプロテアーゼを除去し、組換えタンパク質発現に最適な環境を提供するため好ましい。さらに、DE3は、lacUV5プロモーターの制御下でT7 RNAポリメラーゼ(T7 RNAP)の遺伝子を保持するλDE3を含む。スター成分は、mRNA^の切断を防止する変異RNaseE遺伝子を含む 4,14,18,19.lacUV5プロモーターの下で、イソプロピルチオガラクトピラノシド(IPTG)誘導は、T7 RNAP^20、21の発現を可能にする。これらの株は、細胞を増殖および収穫するために使用され、抽出物調製のための原料を与える。細胞溶解は、ビーズ叩解、フレンチプレス、均質化、超音波処理、および窒素キャビテーション1、^11、12、22を含む様々な方法を用いて行うことができる。

大腸菌を使用する場合、細菌の培養と収穫のプロセスはほとんどのプラットフォームで一貫していますが、数日と激しい研究者の監督が必要です1,11,13。このプロセスは、一般に、LBブロス中での一晩の種子培養から始まり、一晩の成長時に、翌日に2xYTPG(酵母、トリプトン、リン酸緩衝液、グルコース)のより大きな培養物に接種される。このより大きな培養物の成長は、光学密度(OD)2.5^14,20で、初期から中期の対数段階に達するまで監視^される。転写および翻訳の成分が、初期から中期の対数相において高度に活性であることが以前に実証されている^23,24ので^、一定の測定が必要である。このプロセスは再現性のある抽出物を生成することができますが、私たちの研究室は最近、研究者の監督を減らし、所定の1リットルの細胞培養に対する抽出物の総収量を増加させ、経験豊富ユーザーと新規ユーザーの両方のための大腸菌ベースの抽出物調製へのアクセスを改善する無細胞自動誘導(CFAI)培地を使用する新しい方法を開発しました(図1).ここでは、CFAIワークフローを実装するためのステップバイステップガイドを提供し、細胞のストリークプレートから24時間以内に完了したCFPS反応に移行します。

1. メディアの成長

1. 表1に記載したように960mLのCFAI培地を調製し、KOHを用いてpHを7.2に調整した。
2. 培養培地を2.5 Lバッフルフラスコに移し、121°Cで30分間オートクレーブした。
3. 表1に記載したように40mLの糖液を調製する。溶液をフィルター滅菌して、別のオートクレーブ処理されたガラス容器に入れます。
   注:糖液は、さらに使用するまで30°Cのインキュベーターに保存することができます。
4. オートクレーブ処理後、メディアを40°C未満まで完全に冷却します。
5. CFAI培地の接種前に、糖溶液をCFAI培地に直接加える。
6. 培地を接種するには、以前に縞模様の 大腸菌 BL21スター(DE3)プレートからコロニーのループフルをスワイプし、培地に直接挿入します。ループをメディアに渦巻きますが、容器の側面には触れないでください。ストリークプレートが新鮮で、生細胞があることを確認します。
7. 接種培地を入れたフラスコを200rpmで振とうしながら30°Cのインキュベーターに入れる。文化が一晩で成長するのを許してください。細胞を夕方に接種した場合、培養物は、翌朝10の600nm(_OD600)で測定されたおおよその光学濃度に達する。接種および収穫時間は、必要に応じて調整することができる。

2. 細胞採取

1. S30バッファを事前に準備し、冷たく保ちます。表2に従ってS30緩衝液を調製し、最終pHが 8.2になるまでにする。
   注:S30バッファーは、細胞回収の数日前に調製することができます。これを行った場合は、ジチオスレイトールなしで調製し、4°Cで保存する。 使用直前にジチオスレイトールを加えます。
2. この時点から、すべての溶液と材料を氷の上に保管してください。1 L の培地を 1 L 遠心分離機ボトルに移し、5,000 x g で 4 ~ 10 °C で 10 分間遠心分離します。デカントし、上清を処分する。滅菌ヘラを用いて、ペレットを予め冷却し、予め秤量した50mL円錐管に移す。
3. 30〜40mLの冷たいS30緩衝液で1回洗浄し、氷上の休息期間で30秒間バーストでボルテックス を介して ペレットを再懸濁する。
   注: ペレットの量が多いため、セルペレットを 2 本の 50 mL 円錐形チューブに分割すると、洗浄工程に役立ちます。セルをより小さなアリコートに格納することで、ダウンストリーム処理に柔軟性も提供されます。
4. 細胞再懸濁液を5000 x g で4〜10°Cで10分間遠心分離する。
5. 上澄み液を処分し、きれいな組織を使用して50mL円錐管の内壁から余分なものを拭き取り、ペレット自体に触れないようにします。ペレットを液体窒素中で秤量し、急速凍結する。さらに使用するまで-80°Cで保存してください。
   注:ペレットは、ユーザーが抽出物調製プロトコルを続行する予定の場合、フラッシュ凍結を必要としない場合があります。

3. エキス調製

1. 凍結ペレットを細胞ペレット1gごとに1mLのS30緩衝液と組み合わせ、氷上で約30〜60分間融解させる。融解したペレットを30秒のバーストでボルテックスで再懸濁し、氷上で休息する。目に見える細胞の塊が残らなくなるまで渦。
   注:より小さな凝集塊は、ピペットを使用して混合することによって再懸濁することができる。
2. 1.4 mLの細胞再懸濁液のアリコートを細胞溶解のために1.5 mLマイクロフュージチューブに移す。氷浴に囲まれたサイクルあたりの休息の59秒で45秒の3つのバーストのための20 kHzと50%の振幅の周波数で各チューブを超音波処理します。サイクル間のチューブを反転し、すぐに最後の超音波処理サイクルの後に1 Mジチオスレイトールの4.5 μLを追加します。
   注:超音波処理から放出される熱のために、超音波処理されていないときにすべてのアリコートが氷上に保たれていることを確認することは非常に重要です。氷浴は、超音波処理プロセス全体を通して涼しく保つために常に補充または十分に大きくする必要があります。
3. 各チューブを18,000 x g および4°Cで10分間遠心分離する。上清とアリコートを600 μLアリコートの1.5 mLマイクロフュージチューブに取り出す。アリコートをフラッシュフリーズし、さらに使用するまで-80°Cで保存する。上清のみをピペットにするには注意が必要です。

4. 無細胞タンパク質合成

1. 前の工程からの抽出物の1つのアリコートを解凍し、1.5mLマイクロフュージチューブで15μLの無細胞タンパク質合成反応を4連で実行した。
2. 240 ng の DNA (最終濃度 16 μg/mL)、2.20 μL の A 液、2.10 μL の B液、5.0 μL の抽出液、およびさまざまな量の分子級水を組み合わせて各反応を調製し、反応液を 15 μL に充填します。この反応は、より高い体積にスケーリングすることができる。比率については 、表 3 を参照してください。
   1. 表4に従って溶液AおよびBを調製する。各溶液は、100 μL〜1 mLのバッチで調製し、小分けし、さらに使用するまで-80°Cで保存することができる。
      注:DNA量は、目的のタンパク質によって異なる可能性がある。この場合、使用したプラスミドpJL1-sfGFPは、16 μg/mL、つまり597 μMでの動作が最適化されています。
3. 反応を37°Cで少なくとも4時間実行させる。

レポータータンパク質、スーパーフォルダグリーン蛍光タンパク質(sfGFP)の定量

1. 半面積96ウェル黒色ポリスチレンプレートを用いて、各無細胞タンパク質合成反応産物2 μLをpH 7.2で48 μLの0.05 M HEPES緩衝液と組み合わせます。各反応管の3~4回の反復が推奨されます。
2. 励起波長485nm、発光波長528nmのsfGFPの蛍光強度を定量する。
3. 相対蛍光単位をsfGFPの体積収量(μg/mL)に変換するには、精製pJL1-sfGFPを用いて標準曲線を確立します。

CFAI培地を調製するとき、グルコースは、培地中の主要なエネルギー基質としてのラクトースおよびグリセロールの増加と交換された。さらに、CFAI培地の緩衝能も増加した。これらの具体的な成分を 表1に示す。

次いで、細胞をCFAI培地中でOD₆₀₀ of 10および標準2.5の両方に増殖させ、抽出物量が異なるにもかかわらず抽出物品質との一貫性を示した。5OD600 CFAI培地を、種培養物からLBブロスに接種した後、37°C、200rpmで増殖させ、一方、_OD600 10培養物をプレートから直接植菌した。 次いで、CFAI培地の各バッチをモニターし、それぞれのOD₆₀₀で収穫した。OD_600が10になるまでの増殖は、2.5 OD600への成長から得られた2.10 mLの抽出物に対して_9.60 mLの抽出物を産生したので、より高い量の細胞ペレットおよび得られた抽出物全体の増加をもたらした(図2)。総タンパク質濃度のさらなる分析は、各抽出物中の全体的なタンパク質に有意差を示さなかった(表5)。異なるレベルの光学密度に増殖させたにもかかわらず、両方のバッチの抽出物は、sfGFPを用いた無細胞反応において同様の結果を示した(図3)。これは、増加した緩衝能の組み合わせ、ラクトースおよびグリセロールを主な炭素源として使用し、T7RNAP誘導のためにIPTGの代わりにラクトースを実装することが、抽出物増殖を10未満の_OD600に安定化させるのに役立つことを示唆している。

表1:CFAIコンポーネント CFAI培地および糖溶液用の成分をそれぞれの量で含む。培地は、滅菌した各成分および糖液フィルターの添加を通して撹拌されるべきである。各溶液は、接種前に別々の滅菌容器に添加されるべきである。

表 2: S30 バッファ コンポーネント: S30緩衝液用の成分を、それぞれの量と共に滅菌50mL円錐管に添加した。

表3:CFPS反応比:溶液A、溶液B、および抽出物に対する相対容量百分率。DNA容量は、特定のプラスミドの濃度に応じて変化し得、使用されるユーザーの特定のプラスミドに対して最適化する必要があるかもしれない。

表 4: ソリューション A および B のコンポーネント溶液AおよびBの成分のストック濃度を、それぞれ1.5mLマイクロフュージチューブにそれぞれの量と共に添加した。

表5:総抽出物タンパク質収率。 異なる細胞抽出物増殖の総タンパク質の分析。総タンパク質濃度は、ブラッドフォードアッセイを用いて決定した。各濃度は、1:40希釈を用いて3連から決定した。

図1:CFAIとセルからCFPSへの典型的なワークフローの比較:(A)CFAIワークフロー(左、赤)と(B)以前に確立された方法(緑、右)を使用したセルからCFPSへの全体的なタイムラインの比較。この比較は、CFAIワークフローを使用してCFPSを実行する際の研究者の監視とタイムラインの削減を示しています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:CFAIペレットサイズの比較 異なる_OD600での細胞回収後のCFAI培地ペレットの比較。OD₆₀₀ of 2.5に成長した培地は2.23 gの細胞ペレットを生成し(左)、OD₆₀₀ 10に成長した培地は9.49 gの細胞ペレットを生成した(右)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:CFPS反応収率に対する成長の影響(A)2.5OD_{600と10OD600}への成長間のCFPS反応収率の比較_、および(B)各CFPS反応の画像がそれぞれの収率を上回った。無細胞反応を1.5mLマイクロフュージチューブ中で行い、蛍光をsfGFP濃度に相関させるために標準曲線を用いて37°Cで24時間のインキュベーション後に定量した。「陰性」とは、鋳型DNAが添加されなかった陰性対照反応のセットに対応する。従来の2xYTPG培地(陽性対照)およびCFAI抽出物は、高いCFPS収率によって実証されたのと同様の品質を有する。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

細胞増殖中の2つの重要な行動、すなわちT7 RNAPの誘導と特定の_OD600での細胞の採取には、研究者の監督が伝統的に必要です。CFAIは、高品質の細胞抽出物を調製するために必要な研究者の時間と技術トレーニングを減らすために、これらの要件の両方をなくします。T7 RNAPの自己誘導は、グルコースを培地中の第一糖としてラクトースで置換することによって達成され、増殖を積極的に監視し、次いで細胞増殖中の正確な時点でIPTGで誘導する以前の必要性を排除する。特定のOD₆₀₀で収穫するために細胞培養物を積極的に監視する必要性もなくなり、研究者を細胞培養から切り離すことができます。これは、非伝統的な時期に収穫された高品質の抽出物の生産を実証した最近の研究にも追加されます 13,25,26.新しい培地製剤は、緩衝能と炭素源を改善し、細胞培養が静止期に近づく中でも活性エネルギー代謝をサポートします。高_OD600培養物から堅牢な細胞抽出物を得る能力により、研究者は都合の良いときに培養物を採取することができます²⁷。私たちが好んでお勧めするワークフローは、夕方に培養物を接種し、翌朝収穫に戻ることです。

より高い_OD600で細胞を回収すると、抽出物調製のために有意に大量の細胞が得られる。経験豊富な研究者にとって、OD₆₀₀ of 2.5で回収した場合でも、細胞ペレットは2xYTPG培地で増殖した細胞と比較して色がはるかに濃いことは注目に値します。また、細胞ペレット全体が一度に処理されている場合、超音波処理を介して溶解を行うときに細胞ペレットごとに得られる大量の再懸濁液には時間がかかることに注意することも重要です。したがって、このプロセス中にすべてのアリコートを冷たく保つことが重要です^11,13,14。成長あたりの抽出物量の増加は、それに比例してコストを削減し、バイオ製造アプリケーションをサポートします。実証された改善により、CFAIワークフローは、無細胞技術の新規および経験豊富なユーザーが再現可能で機能的な大腸菌抽出物を製造するためのより簡単なプロトコルを提供します。

提供されるCFAIメディアの利点にもかかわらず、この方法には制限があります。主な課題は、ワークフローの初期段階の性質です。メタボロミクス分析は、CFAI OD_{600 10}抽出物および反応生成物の違いを2xYTPGと比較して明らかにしたが、特定の用途に対するこれらの違いの影響は特徴付けられていない²⁷。さらに、このワークフローは、BL21大腸菌ベースの溶解物のために開発されました。培地再製剤が、大腸菌^28、29のゲノム的に再コードされた株など、他の大腸菌株からの堅牢な抽出物調製物を支持するかどうかは不明である。 CFAIアプローチは、他の細菌生物からの抽出物を生成するために利用され得る可能性があるが、チャイニーズハムスター卵巣またはウサギ網状赤血球などの真核生物のための抽出物調製を支持する可能性は低い。しかし、これらには独自の確立された方法^{30,31があります}。CFAIワークフローのシンプルさは、障壁を減らし、CFPSがサポートする幅広いアプリケーションに対するその有用性を特徴付け、評価するために無細胞コミュニティにインセンティブを与えると期待しています。

著者らは、競合する金銭的利益相反はないと宣言している。

著者らは、技術サポートのためにJennifer VanderKelen博士とAndrea Laubscherに感謝したいと思います。著者はまた、有益な議論のためにニコール・グレゴリオ、マックス・レヴァイン、アリッサ・マリン、ビョンチョル・ソ、オーガスト・ブルックウェル、エリザベス(リジー)ヴォイヴォダ、ローガン・バリントン、ジリアン・カスマンに感謝したいと思います。著者らはまた、Bill and Linda Frost Fund、Center for Applications in BiotechnologyのChevron Biotechnology Applied Research Endowment Grant、Cal Poly Research、Scholarly、およびNational Science Foundation(NSF-1708919)からの資金援助を認めている。

An erratum was issued for: From Cells to Cell-Free Protein Synthesis within 24 Hours using Cell-Free Autoinduction Workflow. The Authors section was updated.

The Authors section was updated from:

Philip E.J. Smith1,2, Taylor Slouka1,2, Javin P. Oza1,2
1Department of Chemistry and Biochemistry, California Polytechnic State University
2Center for Application in Biotechnology, California Polytechnic State University

to:

Philip E.J. Smith1,2, Taylor Slouka1,2, Mona Dabbas 1,2, Javin P. Oza1,2
1Department of Chemistry and Biochemistry, California Polytechnic State University
2Center for Application in Biotechnology, California Polytechnic State University