使用无细胞自动诱导工作流程在24小时内从细胞到无细胞蛋白质合成

这项工作描述了从 大肠杆菌（E. coli） 制备细胞提取物，然后在24小时内进行无细胞蛋白质合成（CFPS）反应。无细胞自诱导（CFAI）方案的解释详细介绍了为减少研究人员的监督和增加获得的细胞提取物数量而进行的改进。

无细胞蛋白质合成（CFPS）已经发展成为一个 在体外捕获转录和翻译机制的生物技术平台。许多发展使新用户更容易访问CFPS平台，并扩大了应用范围。对于基于裂解物的CFPS系统，可以从各种生物体中产生细胞提取物，利用该宿主的独特生物化学来增强蛋白质合成。在过去的20年中， 大肠杆菌 （E. coli） 由于其可负担性和多功能性而成为支持CFPS的最广泛使用的生物体之一。尽管取得了许多关键进展， 但大肠杆菌 细胞提取物制备的工作流程仍然是新用户为其应用实施CFPS的关键瓶颈。提取物制备工作流程非常耗时，需要技术专业知识才能获得可重复的结果。为了克服这些障碍，我们之前报道了24小时无细胞自动诱导（CFAI）工作流程的开发，该工作流程减少了用户输入和所需的技术专业知识。CFAI工作流程最大限度地减少了生成细胞提取物所需的劳动力和技术技能，同时还增加了获得的细胞提取物的总量。在这里，我们以循序渐进的方式描述该工作流程，以改善可及性并支持基于 大肠杆菌 的CFPS的广泛实施。

在过去几年中，将无细胞蛋白质合成（CFPS）用于生物技术应用的用途大幅增长^1，2，3。这一发展可部分归因于在了解CFPS中发生的过程以及每个组成部分的作用方面所做的努力^，4，5。此外，优化设置和替代能源带来的成本降低使无电池技术更容易为新用户实施^{6，7，8，9}。为了实现蛋白质合成所必需的转录和翻译因子，细胞提取物通常用于驱动无细胞反应¹⁰。最近发布的用户指南提供了用于生产功能提取的简单协议，使新用户和有经验的用户更容易实现^{1，11，12，13，14}。细胞提取物通常通过裂解细胞培养物获得，其可以根据所需的特定用途使用不同的生物体1^，15，16进行生长。

大肠杆菌（E. coli）已迅速成为生产功能性提取物最常用的宿主生物之一¹⁷.BL21 Star（DE3）菌株是优选的，因为它从外膜（OmpT蛋白酶）和细胞质（Lon蛋白酶）中去除蛋白酶，为重组蛋白表达提供了最佳环境。此外，DE3含有λDE3，在lacUV5启动子的控制下携带T7 RNA聚合酶（T7 RNAP）的基因;恒星成分含有突变的RNaseE基因，可防止mRNA^{4，14，18，19}的分裂。在lacUV5启动子下，异丙基硫代乳糖吡喃糖苷（IPTG）诱导允许表达T7 RNAP^20，21。这些菌株用于生长和收获细胞，为提取物制备提供原料。可以使用多种方法进行细胞裂解，包括珠粒打浆，法压，均质化，超声处理和氮气空化^{1，11，12，22}。

使用大肠杆菌时，细菌培养和收获的过程在大多数平台上都是一致的，但需要多天和研究人员的严格监督^1，11，13。该过程通常从在LB肉汤中过夜培养种子开始，然后在过夜生长后接种到更大的2xYTPG（酵母，色蛋白，磷酸盐缓冲液，葡萄糖）培养物中。监测这种较大培养物的生长，直到它以2.5¹⁴，²⁰的光密度（OD）达到早期至中期对数阶段。需要恒定的测量，因为转录和翻译的成分先前已被证明在对数前期^23，24中具有高活性。虽然该过程可以创建可重复的提取物，但我们实验室最近开发了一种使用无细胞自诱导（CFAI）培养基的新方法，该方法减少了研究人员的监督，提高了给定升细胞培养物的提取物总产量，并改善了有经验的用户和新用户对基于大肠杆菌的提取物制备的获取（图1).在这里，我们提供了实施CFAI工作流程的分步指南，在24小时内从条纹板细胞到完成的CFPS反应。

1. 媒体增长

1. 如 表1 所述制备960 mLCFAI培养基，并使用KOH将pH调节至7.2。
2. 将培养基转移到2.5L挡板烧瓶和高压灭菌器中，在121°C下30分钟。
3. 如 表1所述制备40mL糖溶液。将溶液过滤灭菌到单独的高压灭菌玻璃容器中。
   注意:糖溶液可以储存在30°C的培养箱中，直到进一步使用。
4. 高压灭菌后让培养基完全冷却至40°C以下。
5. 在接种CFAI培养基之前，将糖溶液直接加入CFAI培养基中。
6. 要接种培养基，请从先前有条纹的大 肠杆菌 BL21 Star（DE3）板上滑动一圈菌落，然后直接插入培养基中。将环旋转到介质中，但避免接触容器的侧面。确保条纹板是新鲜的，具有活细胞。
7. 将装有接种培养基的烧瓶置于30°C培养箱中，同时以200rpm振荡。让培养物在一夜之间生长。如果在晚上接种细胞，培养物将在第二天早上达到10的近似光密度，在600nm（OD₆₀₀）处测量。接种和收获时间可根据需要进行调整。

2. 细胞收获

1. 提前准备S30缓冲液并保持低温。根据 表2制备S30缓冲液，最终pH值为8.2。
   注意:S30缓冲液可以在细胞收获前几天制备。如果这样做，请在没有二硫舒醇的情况下制备并储存在4°C。 使用前添加二硫菌素。
2. 从现在开始，将所有溶液和材料保持在冰上。将1L培养基转移到1L离心瓶中，并在4-10°C之间以5，000 ×g 离心10分钟。倾析并处理上清液。使用无菌刮刀，将沉淀转移到预冷且先前称重的50mL锥形管中。
3. 用30-40 mL冷S30缓冲液洗涤一次，方法是在30秒内 通过 涡旋重悬沉淀，并在冰上休息。
   注意:由于沉淀量较大，将细胞沉淀分成两个50 mL锥形管对洗涤步骤有帮助。将细胞储存在较小的等分试样中也为下游加工提供了灵活性。
4. 在4-10°C之间以5000 ×g 离心细胞重悬10分钟。
5. 处理上清液并使用干净的组织从50 mL锥形管的内壁擦拭任何多余的，避免接触沉淀本身。称量并快速冷冻沉淀在液氮中。储存在-80°C直至进一步使用。
   注意:如果用户计划继续使用提取物制备方案，则沉淀可能不需要快速冷冻。

3. 提取物制备

1. 将冷冻的沉淀与每1g细胞沉淀的1mL S30缓冲液混合，并在冰上解冻约30-60分钟。通过涡旋重悬解冻的颗粒，在冰上休息30秒。涡旋，直到没有可见的细胞团块剩余。
   注意:较小的团块可以通过使用移液器混合来重悬。
2. 将1.4 mL细胞重悬的等分试样转移到1.5 mL微量离心管中进行细胞裂解。以20 kHz的频率和50%的振幅对每个管进行超声处理，进行三次45秒的脉冲，每个周期休息59秒，周围环绕着冰浴。在循环之间倒置管子，并在最后一个超声处理循环后立即加入4.5μL 1M二硫噻嗪醇。
   注意:由于超声处理释放的热量，确保所有等分试样在未超声处理时保持在冰上非常重要。冰浴应不断补充或足够大，以在整个超声处理过程中保持凉爽。
3. 将每个管在18，000 ×g 和4°C下离心10分钟。将上清液和等分试样取回600μL等分试样中的1.5mL微量离心管中。快速冷冻等分试样并储存在-80°C直至进一步使用。应注意仅移液上清液。

4. 无细胞蛋白质合成

1. 从上一步解冻一等分试样的提取物，在1.5 mL微量离心管中以四倍份进行15μL无细胞蛋白质合成反应。
2. 通过将240ng DNA（16μg/ mL终浓度），2.20μL溶液A，2.10μL溶液B，5.0μL提取物和不同体积的分子级水结合以将反应填充到15μL来制备每个反应。该反应可以扩展到更高的体积。比率见 表3 。
   1. 根据 表4制备溶液A和B。每种溶液可以分批制备100μL至1mL，等分试样，并在-80°C下储存直到进一步使用。
      注意:DNA量可能因感兴趣的蛋白质而异。在这种情况下，所使用的质粒pJL1-sfGFP已经过优化，可在16μg/ mL或597μM下执行。
3. 让反应在37°C下运行至少4小时。

5. 报告蛋白、超文件夹绿色荧光蛋白（sfGFP）的定量

1. 使用半面积96孔黑色聚苯乙烯板，将2μL每个无细胞蛋白质合成反应产物与48μL0.05M HEPES缓冲液在pH 7.2下组合。建议每个反应管重复三到四次。
2. 量化sfGFP的荧光强度，激发波长为485 nm，发射波长为528 nm。
3. 为了将相对荧光单位转换为sfGFP的体积产率（μg / mL），请使用纯化的pJL1-sfGFP建立标准曲线。

在制备CFAI培养基时，葡萄糖被交换为乳糖和甘油的增加，作为培养基中的主要能量底物。此外，CFAI介质的缓冲能力也得到了提高。这些特定组件如 表1所示。

然后将细胞在CFAI培养基中生长至OD₆₀₀ /10和标准2.5，以显示与提取物质量的一致性，尽管提取量不同。2.5 OD 600 CFAI培养基是在37°C，_200rpm 的LB肉汤中接种后生长的，而OD₆₀₀ 10培养物直接从板中接种。 然后对每批CFAI培养基进行监测，并在各自的OD₆₀₀处收获。生长至OD₆₀₀ 的10导致获得的细胞沉淀和总提取物的量增加，因为它产生了9.60 mL提取物，而从生长到2.5 OD₆₀₀ 中获得的2.10 mL提取物（图2）。对总蛋白浓度的进一步分析表明，每种提取物中总蛋白没有显着差异（表5）。尽管它们被生长到不同的光密度水平，但两批提取物在使用sfGFP的无细胞反应中表现出相似的结果（图3）。这表明，增加缓冲能力，使用乳糖和甘油作为主要碳源以及实施乳糖代替IPTG进行T7RNAP诱导的组合有助于将提取物生长稳定到10以下的任何OD₆₀₀ 。

表 1:CFAI 组件。 CFAI培养基和糖溶液的组分及其各自的量。应在整个搅拌过程中搅拌各组分的加入和糖溶液过滤杀菌。在接种之前，应将每种溶液添加到单独的无菌容器中。

表 2:S30 缓冲区组件: 将S30缓冲液的组分及其各自的量加入到无菌的50mL锥形管中。

表3:CFPS反应比:溶液A，溶液B和提取物的相对体积百分比。DNA体积可以根据特定质粒的浓度而变化，并且可能需要针对所使用的用户的特定质粒进行优化。

表 4:解决方案 A 和 B 组件。将溶液A和B组分的储备浓度与各自的量一起加入到1.5 mL微量离心管中。

表5:总提取物蛋白产量。 分析不同细胞提取物生长的总蛋白。使用布拉德福德测定法测定总蛋白质浓度。使用1:40稀释液从一式三份中测定每种浓度。

图1:从细胞到CFPS的CFAI和典型工作流程 的比较:使用（A）CFAI工作流程（左，红色）与（B）先前建立的方法（绿色，右）比较从细胞到CFPS的整体时间线。比较表明，在使用CFAI工作流程执行CFPS时，研究人员的监督和时间表减少了。 请点击此处查看此图的大图。

图2:CFAI颗粒尺寸比较。 在不同OD₆₀₀下细胞收获后CFAI培养基沉淀的比较。生长到OD₆₀₀ 为2.5的培养基产生2.23g细胞沉淀（左），生长至OD₆₀₀ 的培养基产生9.49g细胞沉淀（右）。 请点击此处查看此图的大图。

图3:生长对CFPS反应产量的影响。（A）生长至2.5 OD_{600和10 OD 600}之间的CFPS反应产率比较_，每个CFPS反应的图像高于其各自的产量。在1.5mL微量离心管中进行无细胞反应，并在37°C下孵育24小时后定量，使用标准曲线将荧光与sfGFP浓度相关联。"阴性"对应于一组阴性对照反应，其中没有添加模板DNA。传统的2xYTPG培养基（阳性对照）和CFAI提取物具有相似的质量，通过其高CFPS产量来证明。请点击此处查看此图的大图。

传统上，研究人员的监督对于细胞生长过程中的两个关键动作是必需的:诱导T7 RNAP和在特定的OD₆₀₀下收获细胞。CFAI避免了这两个要求，以减少研究人员准备高质量细胞提取物所需的时间和技术培训。T7 RNAP的自动诱导是通过用乳糖代替葡萄糖作为培养基中的原糖来实现的，从而避免了以前主动监测生长的需求，然后在细胞生长过程中的精确点用IPTG诱导。还消除了主动监测细胞培养物以特定OD₆₀₀收获的需求，从而摆脱了研究人员对细胞培养物的束缚。这增加了最近的工作，这些工作也证明了在非传统时期收获的优质提取物^{的生产13，25，26}。新培养基配方提高了缓冲能力和碳源，即使在细胞培养接近固定期时也能支持活性能量代谢。从高OD₆₀₀ 培养物中获得稳健的细胞提取物的能力使研究人员能够在方便的时候收获培养物²⁷。我们更喜欢并推荐的工作流程是在晚上接种培养物，第二天早上返回收获。

在较高的OD₆₀₀ 下收获细胞也会导致用于提取物制备的细胞数量显着增加。对于有经验的研究人员来说，值得注意的是，与在2xYTPG培养基中生长的细胞相比，细胞沉淀的颜色要深得多，即使以2.5的OD₆₀₀ 收获也是如此。同样重要的是要注意，如果同时处理整个细胞沉淀，则在通过超声处理进行裂解时，每个细胞沉淀获得的大量重悬将需要一些时间。因此，重要的是在这个过程中保持所有等分试样^11，13，14的冷。每次生长的提取物量的增加按比例降低了成本，并支持生物制造应用。随着所演示的改进，CFAI工作流程为无细胞技术的新用户和有经验的用户提供了一种更简单的方案，以生产可重复的功能性 大肠杆菌 提取物。

尽管提供的CFAI介质具有优势，但这种方法存在局限性。主要挑战是工作流的新生性质。虽然代谢组学分析已经揭示了CFAI OD₆₀₀ 10提取物以及与2xYTPG相比的反应产物的差异，但这些差异对特定应用的影响仍未表征²⁷。此外，该工作流程已针对基于BL21 大肠杆菌的裂解物而开发。目前尚不清楚培养基重新配制是否支持来自其他 大肠杆菌 菌株的强健提取物制备，例如 大肠杆菌^28，29的基因组重编码菌株。CFAI方法可用于从其他细菌生物体中产生提取物，但它不太可能支持真核生物（如中国仓鼠卵巢或兔网织红细胞）的提取物制备;然而，这些有自己建立的方法^30，31。我们预计CFAI工作流程的简单性将减少障碍，并激励无细胞社区表征和评估其在CFPS支持的广泛应用中的效用。

作者声明，他们没有相互竞争的财务利益冲突。

作者要感谢Jennifer VanderKelen博士和Andrea Laubscher博士的技术支持。作者还要感谢Nicole Gregorio，Max Levine，Alissa Mullin，Byungcheol So，August Brookwell，Elizabeth （Lizzy） Vojvoda，Logan Burrington和Jillian Kasman的有益讨论。作者还感谢比尔和琳达·弗罗斯特基金，生物技术应用中心的雪佛龙生物技术应用研究捐赠基金，加州理工学院研究，学术和国家科学基金会（NSF-1708919）的资金支持。

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Philip E.J. Smith1,2, Taylor Slouka1,2, Javin P. Oza1,2
1Department of Chemistry and Biochemistry, California Polytechnic State University
2Center for Application in Biotechnology, California Polytechnic State University

to:

Philip E.J. Smith1,2, Taylor Slouka1,2, Mona Dabbas 1,2, Javin P. Oza1,2
1Department of Chemistry and Biochemistry, California Polytechnic State University
2Center for Application in Biotechnology, California Polytechnic State University