トランス・大腿部アクセスを用いたヒトサイズの冠動脈ステントのラット腹部大動脈への移植

このプロトコルは、トランス・フィスモラル・アクセスを用いて^、apoE-/- バックグラウンドを有するラットの腹部大動脈へのヒト冠動脈ステントの移植を記述する。他の動物モデルと比較して、マウスモデルは高い効率、再現性、取扱いおよびハウジングの容易さ、および分子マーカーの広い利用可能性の利点を運ぶ。

経皮的冠動脈介入(PCI)は、冠状動脈ステントの展開と相まって、冠動脈疾患の介入治療におけるゴールドスタンダードを表す。インステント・レステノーシス(ISR)は、ステント内の新内皮組織の過剰増殖によって決定され、ステントの長期的な成功を制限する。様々な動物モデルが、ブタ冠動脈およびウサギの腸骨動脈モデルが最も頻繁に使用されている、ステント内修復(ISR)の基礎となる病態生理学的プロセスを解明するために使用されてきた。Ming モデルは、高スループット、取り扱いとハウジングの容易さ、再現性、および分子マーカーの幅広い可用性の利点を提供します。アポリポプロテインE欠損^(apoE-/-) マウスモデルは、心血管疾患の研究に広く使用されています。しかし、ステントは、機械的および(潜在的に)生物学的特性の重要な変化を伴うマウスに移植されるように小型化する必要があります。apoE^-/- ラットの使用は、アポエ^-/- ラットとしてこれらの欠点を克服できると同時に、アテロゲン性表現型を提供しながら、ヒトサイズの冠状動脈ステントの評価を可能にする。これにより、ステント注入後のISRを調査するための優れた信頼性の高いモデルになります。ここでは、例えば、市販のヒト冠状動脈ステントを^apoE-/- バックグラウンドを有するラットの腹部大動脈へのトランスポンテーションを、トランス・フェモラル・アクセスを用いて詳細に説明する。

経皮的冠動脈介入(PCI)は、冠状動脈ステントの展開と相まって、冠動脈疾患¹の介入治療におけるゴールドスタンダードを表す。しかし、ステントの長期的な成功は、ステント内の新内組織の過剰増殖によって決定されるステント内レステノーシス(ISR)の発生によって制限され得る^2,3。ISRは、冠状動脈バイパスまたは再PCIのいずれかで再介入を必要とするかもしれない。ISRの研究には様々な動物モデルが提案されており、それぞれが長所と短絡を特徴とする。最も一般的に使用されるブタ冠動脈およびウサギの腸動脈モデルの主な欠点は、ステント移植後のヒトと著しく類似した病変を発症する^4、5であり、特に長期的な研究における物流上の困難、ならびに取り扱いや機器の制限を引き起こす大きな動物および住宅コストである。さらに、豚やウサギの細胞タンパク質に対する抗体の入手は限られています。一方、マウスモデルは、高スループットと再現性の大きな利点だけでなく、取り扱い、ハウジング、したがってコスト効率の容易さを提供します。さらに、より多くの抗体が利用可能である。しかし、アポリポタンパク質E欠損(apoE-/--)マウスはアテローム性動脈硬化症^6、7、8の研究に広く使用されてきたが、ステントをマウスに移植するために小型化しなければならないため、ISRの研究には不向きであり、ステントの機械的特性を変化させる可能性がある。さらに、マウスの大動脈壁は、若いマウスでは50μm、古いマウスでは85μmの間で^{測定され、}ステントは2気圧の低い圧力レベルを使用して展開する必要があり、ステント¹⁰のマラッピングにつながる可能性がある。しかしながら、ラットは、市販のヒト冠状ステントの移植を可能にし、大動脈ステント移植後に大きな動物と同様の血管治癒過程を示す、最初にLangeveldららによって^{報告された。}この技術はもともと、血流の一時的な中断を達成するために大動脈の物理的な収縮を必要とする経腹的なアクセスを必要としました。潜在的に関連する血管損傷および炎症反応を避けるために、この技術は後にトランス腸骨アクセスの導入によって洗練され、さらに動物¹²の生存率が高くなる。

野生型ラットはアテローム硬化性病変¹³を発症しないため、アポエ^-/-ラットは、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)14などのヌクレアーゼ技術を用いて生成されており、クラスター化された定期的に間隔をあけた短いパリンドローム反復(CRISPR/Cas9)15、およびジンクフィンガー(ZF)16。^ApoE-/-ラットは2011年から市販されている。アテローム原性の背景を提供する^apoE-/-ラットは、特にISRに関して、ヒトサイズの冠状動脈ステントのより現実的な評価を可能にする。

ここで、我々は、経大的なアクセス経路を介して、市販の薄いストラットコバルトクロム薬物溶出ステント(DES)を用いた方法を記述するが、ベアメタルステント(BMS)または生分解性ステントのような他のステントタイプの研究にも適用することができる。

実験は、科学的目的のために使用される動物の保護に関するドイツの動物福祉法(TSchG)および指令2010/63/EUに従って行われました。この研究の公式承認は、政府動物のケアと使用委員会によって付与されました (プロトコル No.: AZ 87-51.04.2010.A065;ランデサムト・フュル・ナートゥール、ウムヴェルト・ウント・ヴェルブラウヒャーシュッツ・ノルドハイン=ヴェストファーレン、レックリングハウゼン、ドイツ)。研究プロトコルは、実験動物のケアと使用のためのガイドに準拠しています。術後疼痛治療は、ドイツ実験動物科学会(GV-SOLAS)とイニシアチブ獣医痛み治療の勧告に基づいています。

1. 基本的なテクニックと一般的な手順

1. ホモ接合アポエ^{を使用してください -/-} スプレイグ・ドーリーラット。標準的な方法¹⁷を使用して、各動物の遺伝子型を特定する。
2. 同じ条件(21°C±2°C、湿度5%±60%、明暗サイクル12時間)で動物を保管し、水と食べ物への自由なアクセスを確保してください。
3. 清潔で無菌状態ですべての手順を実行します。
4. ラットを麻酔したら、16倍の倍率で手術顕微鏡ですべての処置を行う。
5. 圧縮止止めには綿棒を使用してください。授乳中のリンゲル溶液を浸したガーゼ綿棒(5cm x 5cm)は、鼠径部を湿潤に保つのに役立ちます。
6. 廃棄物処理規則に従って、使用済み資材を処分する。

2. 手術前の準備

1. 手術を開始する前に、動物用医薬品を準備してください。特に明記されていない限り、すべての溶液を室温に保ちます。
2. 処置の30分前に 、0.03-0.05 mg/kgブプレノルフィンを皮下に投与する。
3. ラットを腹腔内注射で麻酔薬を100mg/kg体重(BW)(S)ケタミンおよび8mg/kg BWキシラジンで麻酔します。
4. 計量スケールを使用してラットの体重を評価します。
5. ラットを加熱パッドに置き、医療テープを使用して上肢と下肢を固定します。大腿動脈と大動脈の間に直線を作るように、左後肢を完全に伸ばし、背骨に沿ってラットを配置する。これは大動脈分岐を通して気球取付けられたステントを進めるのを容易にする。
6. 2 L/minの流量で97.5%酸素中1.5体積%イオブルランの吸入で麻酔を維持する。
   注:ラットは挿管せずに自発的に呼吸することができます。
7. 意識不明の間に目の損傷を防ぐために眼軟膏を適用します。
8. ラットの鼠径部と下腹部の部分から毛皮を剃り、ポビドネ-ヨウ素溶液で対応する皮膚を殺菌する。
9. 手術を開始する前に、尾端とデジタル間組織をつまんで麻酔の適切な深さを確認してください。

3. 手術

1. 皮膚と下層筋膜を開くために、左鼠径部に〜0.5\u20121 cmの内側切開を行います。
2. 脈動した左大腿動脈が同定されるまで、深部で鈍く解剖し、プローブする。
3. 非常に細かい鉗子を使用して、周囲の結合組織を穏やかに除去することによって大腿動脈を準備する。大腿神経にも大腿静脈も、動脈の内側に害を与えないように注意してください。
4. 大腿動脈の約1cmを準備します。慎重に容器の下に鉗子の先端を置き、そっと持ち上げます。
5. 動脈の遠位部および近位部分の下の4-0シルク縫合糸の糸片および形態スリング。外科用クランプの枝の間の2つの糸のスリングの両端をクランプします。動脈を制御するために外科用クランプを使用してください。血流を一時的に中断するために、スリングを軽く伸ばして持ち上げます。
   注:組織の損傷につながる可能性があり、長時間の止血帯を避けるために速く働きます。
6. 鋭利なマイクロハサミを使用して、大腿動脈の真ん中で動脈切開術を行う。
7. 動脈切開術を通してガイドワイヤーを導入します。近位糸スリングに達したら、外科用クランプを動かして糸の張力を解放し、ガイドワイヤーを腹部大動脈に向かってさらに進める。
   注: 取り扱いが容易な場合は、ワイヤカッターを使用してガイドワイヤをカットします。
8. ダイヤフラムと腎動脈の間にガイドワイヤーの近位端を置きます。
   注:ガイドワイヤーを進みすぎると、大動脈や心臓の損傷のリスクがあります。少なくとも最初の数匹の動物のためにガイドワイヤーとステントの適切な位置を確保するために腹部を開くことをお勧めします。
9. ガイドワイヤーを介して2.25mm x 8mm(最大2.5mm x 8 mm)の圧着とバルーンマウントされた冠状動脈ステントを大腿動脈に導入し、腹部大動脈に進めます。
10. ステントを大動脈分岐のすぐ上に置き、腎動脈の下に置きます。インフレシリンジシステムを使用して、バルーンカテーテルを15sの12気圧に膨らませてステントを展開します。
11. バルーンカテーテルを収縮させ、使用中のステントに対するメーカーの推奨に従って負圧を維持します。
12. ステントを所定の位置に残したまま、膨張したカテーテルをゆっくりと引き出します。
13. カテーテルを取り出す直前に、切開部の上の糸ループに緊張を作り出し、外科的クランプで血流を中断します。次にバルーンカテーテルを取り外し、容器を直接近位にリゲートします。
14. 近位と遠位の糸を結んで大腿動脈を装い、動脈管内の十分な止血を確認する。副次動脈は、四肢へのさらなる灌流を保証する。
15. 10-0非蘇性縫合糸を使用して、動脈の上の筋肉を閉じるだけでなく、皮膚切開。

4. ステント移植後の動物のケア

1. 操作の直後に、ラットが温め空気(30\u201235 °C)と酸素供給を備えた特別な集中治療室のケージで60分間回復することを許可する。
2. 完全に回復するまで、動物を注意深く見てください。その後、ラットを通常のケージに移動します。水と食べ物へのアドリビタムアクセスを提供します。
3. 術後鎮痛を6-12時間ごとに0.03-0.05mg/kgブプレノルフィン.c(500μl NaCl)で6時間ごとに、臨床評価の下で合計72時間投与する。
4. 植え付けられたステントの血栓症を避けるためにクロピドグレル(15mg/kg)と混合食品を持っています。
5. 高コレステロール血症状態とプラーク形成を高めるために、生後6\u20128週に西洋の食事餌を開始し、安楽死まで続ける。必要であれば、正常なラットチャウを与えられた動物のコホートがコントロールとして機能することができる。

5. 組織の収集と処理

1. 指定された時点で組織の排泄を開始する前に、IACUCガイドラインに従って動物を安楽死させる。観察期間の終わりに組織学的分析のためにステント大オルタを収穫する。
2. 正中線の切開で腹部を開き、大間のステントセグメントと大間の隣接する非ステント部分を取り除き、それぞれ0.5cmを測定します。
3. 組織を4%緩衝ホルマリンの溶液に入れ、24時間固定します。
4. ステント動脈組織をプラスチックに埋め込み、標準プロトコル^18、19に従って組織学的および免疫組織化学的染色を行う。

6. ヒストモルフォメトリック解析

1. 適切な画像解析ソフトウェアを用いてコンピュータにリンクされた顕微鏡を用いて、ステント付大関係の近位、中間部、および遠位部分のヒストモルフォメトリクス解析を行う。
2. 外部弾性薄層(EEL、アドベンチシアとメディアの間)、内部弾性薄層(IEL、メディアとネオインティマの間)、およびグラフィック描画タブレットを備えたルーメンの輪郭をトレースします。これらの値から、ソフトウェアで EEL 面積、IEL 領域、およびルーメン領域を計算します。
3. ステント・レステノーシス (ISR) の断面積率を計算します。
   
4. 合計のネオインティマル領域を計算します (A_i):
   
5. 支柱と内腔の間の距離として、各ステントストラット上のネオインティマル厚さ(NIT)を測定します。ステント支柱間の NIT を IEL とルーメンの間の距離として測定します。
   注: または、NIT を次のように計算します。
   
   ここで、P_L および P_IEL はルーメンと内部弾性層周長、それぞれ²⁰です。
6. スタディの要件に従って、追加の解析を実行します。

このプロトコルは、トランス大腿部アクセス経路を用いたラットの腹部大動脈におけるステント移植について説明する(図1)。この動物モデルの最初の中心点は、人間サイズの冠状動脈ステントの展開を可能にすることです。市販の圧着およびバルーン付着冠状動脈ステントは、ラットの腹部大動脈に配置することができる。したがって、加えて、ステント展開の原理はヒトと同様に適用することができる。ラットの使用のもう一つの利点は、市販されている^apoE-/- ラットのような遺伝子組み換え株の入手可能性である。

我々は最近、この方法を用いて、アポリポタンパク質E欠損ラットが野生型ラット²¹と比較してISRを発症しやすいかどうかを評価した。ステント移植を受けた雄ラットの合計42匹から、36匹のラットが28日後に研究プロトコルを完成させた(生存率= 85.71%)。2匹のラットがそれぞれ血管閉鎖不全、内出血、ステント血栓症で死亡した。3匹の動物のステントは、処理の失敗のために組織が深刻に損傷または破壊されたため、分析できませんでした。おそらく、これはソーイング手順中に起こりました。この手法を、試験開始前に数回実行するトレーニングをお勧めします。

残りの33匹のラットでは、人体サイズの冠状動脈ステントは、マラッポ位置や血管損傷の兆候を伴う無しに正常に配備された(表1)。体重は野生型^apoE++およびapoE-/-ラット(530.1±15.94g対513.6±16.45g)で類似していた。ホモ接合アポエ^-/-ラットは、野生型アポ^E++ラットと比較して、著しく上昇したネオインティマル過形成およびISRを開発した(図2)。apoE^-/-バックグラウンドは、特に西洋の食事を与えた場合、アテローム性動脈硬化症の影響を受けやすい動物をレンダリングしますが、私たちはラットの前のアテローム硬化性プラークを観察しませんでした。

図1:トランス・大腿部アクセスを用いたラットの腹部大動脈へのステント注入のスキーマ。
() 血流が中断した後、ガイドワイヤーが内側動脈切開を通して導入される。(b) 圧着とバルーン付き冠状動脈ステントがガイドワイヤー上で大腿動脈に導入される。(c)気球取り付けられたステントは腹部大動脈に進み、バルーンインフレによって展開される。ステントは分岐の上および腎動脈の下に置くべきである。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図2:西部食餌でステント注入後28日目のGiemsa染色腹部大動脈の代表的な顕微鏡写真。
() ワイルドタイプアポエ^+/+ラットおよび (b) ホモ接合アポエ^-/-ラット.高出力画像:NI=ネオインティマ、セント=ステントストラット、M=チュニカメディア、L=ルーメン。図はコルネリッセン、A.ら^21.からの修正で再現されています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

表1:トランス・大腿部アクセスを用いたラット腹部大動脈におけるステント移植の結果。

このプロトコルは、ヒトサイズの冠状動脈ステントを^apoE-/- ラットの腹部大動脈に移植する方法を説明する。いくつかの技術的な点は強調する価値があります。まず、ステントサイズと大オータのサイズの不一致を避けるべきです。ステントを小さすぎると、ステントのマラプ位置につながる可能性がありますが、大間に大きすぎるステントの埋め込みは、血管の過度の伸縮、引裂、および損傷を引き起こす可能性があります。そのため、直径2.0~2.5mmのステントを使用し、ステントを伸ばすことなく、推奨範囲内に注入圧力を保つことをお勧めします。最も適した注入圧力は、通常、ステントメーカーによって与えられる。大腿静脈の過剰な損傷とその後の静脈は、血管壁が非常に薄く、非常に傷がちやすく、出血を止めにくくするので避けるべきである。大腿動脈は脈動によって大腿静脈と区別され、注意深く観察されるべきである。もう一つの落とし穴は、ガイドワイヤーおよび/またはバルーンカテーテルを導入する際の動脈損傷および解剖の可能性である。動脈解離は、バルーンカテーテルを導入しながらシルクタイを使用してスリングで大腿動脈を遠位に制御および伸ばすことによって最小限に抑えることができる。抵抗に遭遇した場合、デバイスの進め直しを直ちに停止することが不可欠です。この場合、親指と人差し指の間の小さな動きは、デバイスの方向を変える助けになります。私たちの経験では、これは最も頻繁に、一般的な腸骨動脈が分岐に近づくと、ここで後腹膜空間に深く降下する際に、うっとう靭帯のすぐ下にあり、さらに上がっています。生存率が安定し、いくつかの経験を持つ前に、オペレータのための学習曲線は確かに存在するでしょう、平均外科的時間は約20分です。

ヒトでは、ステントは通常、重度に狭い動脈硬化性動脈に移植される。一般的にapoE欠乏症は、動物をアテローム硬化性病変の発症の影響を受けやすいが、我々はラットのプラーク形成を観察しなかった。アテローム硬化性病変におけるステント移植が望まれる場合、西洋の食事は出生後6\u20128週から始まり、犠牲になるまで続けるべきである。感受性株におけるアテローム硬化性病変は、高脂肪食²²で7\u201214週後に発症する。これまでのところ、apoE^-/- ラットに関する限られたデータのみが公開されています。しかし、20週²³週前の自発的病変の発症を報告した研究はない。Zhaoら.^apoE-/- ラットの典型的なアテローム性動脈硬化症は、72週¹⁵で犠牲になるまでプラーク負担および病変重症度の連続的な増加を伴う少なくとも24週間後に観察された。したがって、文献によれば、ラットが14-16週齢で自発的なアテローム性動脈硬化症を発症することはあり得ない。したがって、我々は、古いラットを使用し、事前に形成されたアテローム硬化性病変のステント移植が研究のために望まれる場合、できるだけ早く西洋の食事を開始することをお勧めします。

6匹の動物が手術を生き延びなかった。クロピドグレル投与にもかかわらず、2匹の動物がステント血栓症で死亡した。ステント血栓症を軽減するために、動物はアスピリンで48時間前処理されるか、またはエノキサパリンの腹腔内注射を術後に受けることができる。手術の1日前にクロピドグレルを導入すると血栓症のリスクも低下する可能性がありますが、同時に抗血栓療法の激化は出血のリスクを高めます。ステント血栓症は、PCI^24、25、26の一般的な合併症であり^、いくつかの理由があります。我々の研究では、ステント血栓症の死亡者は、不十分なバルーンインフレと同時ステントマラプ位置から生じる可能性がある。ヒトにおけるステント移植とは対照的に、ラット腹部大動脈におけるステント展開は血管造影によって制御されなかった。したがって、効果のないバルーンインフレは、手術中に検出および修正することができません。同様に、ステントの配備は、分岐船の意図しない閉塞につながる可能性があります。手術を行う手術は、例えば、透視的な制御下での手術を行うことが可能でないため、少なくとも最初の数回の処置では、腹部を開いてステントの正確な展開を確認することを推奨します。ステント血栓症の他の潜在的な原因は、炎症反応、重度の傷害、または血管壁の切断である可能性があります。外科医はこれらの合併症を示す臨床徴候を認識する必要があり、動物は観察期間を通して毎日検査されなければならない。

ラット腹部大動脈は、動物の体重^27、28に応じて、直径1.8mm〜3.0mmの間を測定^する。さらに小さな大腿骨および腸骨動脈を通ってかさばるステントを進めることは、腸の裂け目および血管壁への損傷を引き起こす可能性がある。したがって、この技術は、大介の血管壁の過剰引伸または損傷を避けるために、より小さなステント(直径2.0〜2.5mmの間)の注入に限定される。

もう一つの制限は、処置後に止血を達成するために大腿動脈を結紮する必要性であり、潜在的に下肢虚血のリスクを負う。しかし、これまでの研究では、咬合に対する微小血管系遠位の副次的動脈と同様に、ラット²⁹の大腿動脈の結紮後に下肢灌流を維持することができ、観察期間中に下肢虚血の臨床徴候を示したラットはいなかった。それでも、四肢虚血は術後死の潜在的な原因を表すだけでなく、全身的な炎症反応を誘発する可能性があり、結果に偏る可能性もあるので、研究者はこの潜在的なリスクを認識する必要があります。

ラットは一般的に費用対効果の高い動物モデルですが、遺伝子組み換えapoE^-/- ラットを使用するとコストが増加します。もう一つの制限は、アテローム硬化性プラークがラットで発症するまでに比較的長い時間がかかるということです。さらに、大動脈と冠状動脈の間には、注意を払う必要がある重要な血行力学的な違いがあります。大動脈では、大動脈の剪断応力が高く、乱流を引き起こす分岐は存在しない。これは、内膜過形成の発症と修復の程度を減少させる。

レステノーシスは冠状動脈ステントの長期的な成功を制限する主要な要因の1つです。さまざまな動物モデルが、それぞれの利点と欠点を特徴とする、レステノーシスの病態生理を研究するために使用されてきました。他の動物モデルと比較して、ラットは高いスループット、取り扱いとハウジングの容易さ、再現性、および費用対効果の利点を保持すると同時に、人間サイズの冠状動脈ステントの移植を可能にする。ラットの腹部大動脈ステントの最初のプロトコルは、Langeveldらによって報告^された。しかし、このモデルは、血流の一時的な中断を達成するために大動脈の物理的な収縮に関連するステントを導入するために、腹腔内アクセスを必要とする。結果として生じる操作および血管損傷は、潜在的に炎症性反応を引き起こす可能性があり、合併症につながるだけでなく、ISR¹²を顕著にする可能性がある。その後、小山田らは共通の腸骨動脈¹²を通してステントを導入してプロトコルを変更した。彼らは、2つの異なるアプローチ(トランス大動脈対腸骨動脈)の生存率を比較し、腹部を横断的に展開したステントを有する動物の死亡率が有意に高いことを発見した(57%対11%、p<0.05)。ラットは、最も一般的に、腹部大動脈¹²で起こる場合に壊滅的である切開/縫合部位で血栓症によって死亡した。さらに外傷を軽減し、ヒトの移植技術をより密接に模倣し、我々はステントを導入するためにトランス大腿骨アクセスを使用し、14%の死亡率を報告した。2匹のラットがそれぞれ血管閉鎖不全、内出血、ステント血栓症で死亡した。しかし、最近の研究では、ラット腹部大動脈へのステント移植後の死亡率は、トランス大動脈アクセス^30,31であっても6%と低いと報告^{されている}。それでも、ラット大オルタ³⁰にマグネシウムステントを移植した後のNevzatiらによる研究では、罹患率と死亡率を合わせると13.4%であった。船舶閉鎖不全も内部出血もそのシリーズでは報告されなかったが、ステント血栓症はラット³⁰の10.5%で明らかであった。一方、Aquariusらは、側壁動脈瘤を流れダイバータで治療した後にステント血栓症を報告しなかったが、この研究では、より薄いステントストラット装置を用い、二重抗血小板療法をラット³¹に投与した。我々は、ステント血栓症のリスクと出血リスクのバランスを取ろうとし、我々の研究でクロピドグレルとヘパリンを投与した。これは、ラットの4.76%で発生したステント血栓症のリスクを減少させたかもしれないが、それはまた、内部出血または血管閉鎖障害のために、出血のリスクが比較的高い理由であった可能性があります(ラットの9.52%)。

ここでは、ラット腹部大動脈への薬物溶出ステントの移植を実証したが、同様にこの方法は、他の同様のサイズのステント装置、例えばベアメタルステントまたはビオレソーブル血管足場の評価に使用することができる。

要約すると、アポリポタンパク質E欠損ラットの腹部大動脈ステントは、ステント移植後にISRを調査するための信頼性の高い再現性モデルである。このモデルは、アテローム硬化性病変を自発的に発症する可能性が高い古いラットの使用に拡張し、ヒト冠動脈介入に使用される他の装置を試験することによって可能である。

著者らは開示するものは何もない。

埋め込みとスライド制作に関する貴重な技術支援をしてくれたアンジェラ・フロイント夫人に感謝します。また、動物実験外科研究所のタデウシュ・ストインスキー氏の獣医の仕事に対する洞察力に満ちた支援に感謝します。