腫瘍マクロファージ相互作用を研究するインビトロアッセイ

この記事は、マクロファージを引き付けるために腫瘍細胞から条件付き培地の能力を評価するのに有用なインビトロアッセイを表す。

腫瘍関連マクロファージ(TAM)は、異なるタイプの癌に対する腫瘍塊の細胞の大部分を占める。神経膠芽腫(GBM)は、治療法のない悪性脳腫瘍であり、腫瘍塊の半分までである。TAMは、細胞内の特定の遺伝子の活性化に応じて、腫瘍前または抗腫瘍でありうたることができる。腫瘍における遺伝的変異は、サイトカイン発現を調節することにより、腫瘍微小環境へのAMの募集に影響を与える可能性がある。ここでは、腫瘍細胞からの条件付き培地によるマクロファージ募集を評価する定量的細胞ベースアッセイについて説明する。このアッセイは、ヒトマクロファージ細胞株MV-4-11を用いて、神経膠芽腫からの条件付き培地によるマクロファージの引力を研究し、高い再現性と低変動性を可能にする。このアッセイで生成されたデータは、腫瘍と腫瘍微小環境との相互作用のより良い理解に寄与することができる。同様のアッセイは、T細胞およびナチュラルキラー(NK)細胞を含む腫瘍細胞と他の免疫細胞との相互作用を評価するために使用することができる。

マクロファージは、高い催奇形性と機能的不均一性1を有する免疫細胞である。彼らは宿主防衛システム、組織修復、発達および腫瘍進行1で重要な役割を果たす。TAMは固形腫瘍の微小環境におけるマクロファージである。特定のTAmは、T細胞媒介性細胞傷害活性を阻害し、腫瘍微小環境(TME)を調節し、血管新生、侵来および転移を促進することを通じて腫瘍増殖を促進することができる2、3、4、^5.TMEはTMEの中で最も豊富な細胞型の一つであり、より多くのTAMは一般的に多くのタイプの固形腫瘍6の悪い患者生存と相関する。腫瘍細胞の明確な遺伝的特徴は、マクロファージを募集する能力に影響を与える。GBMでは、治療法のない積極的な脳腫瘍では、マクロファージは腫瘍質量7の半分まで表すことができる。表皮成長因子受容体(EGFR)とその切り捨て変異体EGFRvIIIの共増幅は、腫瘍成長の利点^を付与するGBMで頻繁に観察され、8.EGFRおよびEGFRvIIIを共発現する細胞は、EGFRまたはEGFRvIIIを一人で7を発現する細胞と比較してより多くのマクロファージを引き付ける。

ケモカインは、TME6,9における免疫組成の調節に重要な役割を果たす小さなサイトカインのファミリーである。ヒト細胞は50以上のサイトカ^イン10を発現する。腫瘍における免疫浸潤は、サイトカインとサイトカイン^受容体11との相互作用によって大きく実現される。免疫細胞の各タイプは、異なるケモカイン受容体/ケモカイン受容体を発現し、特定のケモカイン/ケモカイン^受容体12を分泌する細胞によって募集することができる。癌細胞は、TAM、調節性T細胞および骨髄由来サプレッサー細胞(MDSC)6などの免疫細胞を募集する特定のケモカインの発現を増加させることができる。腫瘍によって分泌される特異的ケモカインの遮断は、腫瘍塊への免疫細胞の浸潤を阻害する有望な方法であり得る。

ここでは、ケモカインおよびマクロファージ細胞株を含む腫瘍細胞からの条件付き培養媒体を用いて、腫瘍マクロファージ相互作用のインビトロ評価を可能にするプロトコルについて説明する。

1. 中程度の準備

1. 無血清幹細胞培地の調製
   1. 50x B27サプリメントを解凍し、表皮成長因子(EGF、0.1%BSAで10mM酢酸で20μg/mL)、線維芽細胞増殖因子(FGF、0.1%BSAで10mM酢酸で20μg/mL)を解凍する。
   2. EGFの500 μL(最終濃度20ng/mL)、FGFの500 μL(最終濃度20ng/mL)、10mLの50x B27~500mLのダルベッコの改変イーグル中型/栄養混合物F-12(DMEM/F12)、100xペンリン/ペニンの5mLを加えます。ボトルを4~6回反転して混ぜ、500mL 0.1μmの濾過カップを通して殺菌します。ボトルに印を付け、4 °Cに保管してください。
      注:媒体は4°Cで1ヶ月まで使用するのに良いです。
2. MV-4-11培養培地を調製する:イスコベの改変ダルベッコ培地(IMDM)の500mLに50mLのウシ血清(FBS)を加える。ボトルを4~6回反転して混ぜ、500mL 0.1μmの濾過カップを通して殺菌します。ボトルに印を付け、4 °Cに保管してください。
   注:媒体は4°Cで1ヶ月まで使用するのに良いです。
3. 腫瘍細胞維持培地を調味する:ダルベッコの修飾イーグル培地(DMEM)の500mLにFBSの50mLを加える。ボトルを4~6回反転して混ぜ、500mL 0.1μmの濾過カップを通して殺菌します。ボトルに印を付け、4 °Cに保管してください。
   注:媒体は4°Cで1ヶ月まで使用するのに良いです。

2. 細胞の調製

1日目:

1. 腫瘍細胞の解凍
2. 腫瘍細胞維持培地(ステップ1.3に記載)を37°Cの水浴で20分間温めます。
3. 液体窒素タンクから凍結U87、U87:EGFR、U87:EGFRvIIIおよびU87:EGFR+EGFRvIII細胞を取ります。37°Cの水浴で細胞を2分間解凍します。
   注意:液体窒素タンクから細胞を取り出す際は注意が必要です。必要に応じて、熱保護と安全ゴーグル付きの手袋を着用してください。
4. 70%のエタノールで組織培養フード表面にスプレーし、ペーパータオルで表面の70%エタノールを拭き取ります。
5. 細胞と中瓶を含む低温バイアルを70%エタノールでスプレーし、表面の70%エタノールをペーパータオルで拭き取り、組織培養フードに入れます。
6. 15 mL無菌遠心管に腫瘍細胞維持媒体のピペット5 mL。腫瘍細胞を含むチューブを4~6回反転して混合する。15 mL遠心管にすべての細胞をピペット。遠心管を4~6回反転して混ぜます。
7. 4°Cで5分間200 x gで細胞を遠心分離します。上清を吸引する。
8. リン酸緩衝生理食生(PBS)の10 mLで細胞を洗浄します。4°Cで5分間200 x gで細胞を遠心分離します。上清を吸引する。
9. 腫瘍細胞維持培地の12mLで細胞を再中断する(ステップ1.3に記載されているように)。ピペットを上下に3~5回混ぜます。細胞をT75細胞培養フラスコに移す。
10. 5%CO₂で37°Cインキュベーターで細胞を成長させます。腫瘍細胞維持培地を4°C冷蔵庫に戻します。

2日目:

2. 顕微鏡下の細胞を確認してください。必要に応じてメディアを変更します。細胞は培養中の単層で増殖する必要があります。

3日目:

3. MV-4-11細胞の解凍
   1. MV-4-11培養培地(ステップ1.2に記載)を37°Cの水浴で20分間温めます。
      注:MV-4-11は、特定の研究の必要性に応じて、一次マクロファージまたは他のマクロファージ細胞株に変更することができる。
   2. 液体窒素タンクから凍結したMV-4-11細胞を取ります。37°Cの水浴で細胞を2分間解凍します。
      注意:液体窒素タンクから細胞を取り出す際は注意が必要です。必要に応じて、熱保護と安全ゴーグル付きの手袋を着用してください。
   3. 70%のエタノールで組織培養フード表面にスプレーし、ペーパータオルで表面の70%エタノールを拭き取ります。
   4. 細胞と中瓶を含む低温バイアルを70%エタノールでスプレーし、表面の70%エタノールをペーパータオルで拭き取り、組織培養フードに入れます。
   5. MV-4-11培養培地のピペット5mL(ステップ1.2に記載)を15mL無菌遠心管に入れる。腫瘍細胞を含むチューブを4~6回反転して混合する。15 mL遠心管にすべての細胞をピペット。遠心管を4~6回反転して混ぜます。
   6. 4°Cで5分間200 x gで細胞を遠心分離します。上清を吸引する。
   7. 10mLのPBSで細胞を洗浄し、4°Cで5分間200xgで細胞を遠心分離します。 上清を吸引する。
   8. MV-4-11培養培地の12mLで細胞を再中断する(ステップ1.2に記載)。ゆっくりと上下3~5回パイペットを混ぜます。細胞をT75細胞培養フラスコに移す。
   9. 5%CO₂で37°Cインキュベーターで細胞を成長させます。
4. 腫瘍細胞の分裂
   1. 37°Cの水浴で血清フリー幹細胞培地(ステップ1.1に記載)を20分間温めます。
   2. 70%のエタノールで組織培養フード表面にスプレーし、ペーパータオルで表面の70%エタノールを拭き取ります。冷蔵庫からセルの取り外し液を取ります。70%エタノールで培地および細胞剥離液ボトルをスプレーし、表面の70%エタノールをペーパータオルで拭き取り、組織培養フードに入れます。
      注:アキュト器細胞剥離液を事前に温めしないでください。
   3. 腫瘍細胞培養をインキュベーターから組織培養フードに移す。培地を吸引し、フラスコに2mLの細胞剥離溶液を加える。
      注:アキュターゼを追加する前にPBSですすすることはここでオプションです。
   4. フードにフラスコをセット腫瘍細胞が毎分切り上がるかどうかを確認してください。腫瘍細胞が切り上がったら、フラスコの側面を軽くタップして、フラスコから細胞が切り離すのを助けます。
   5. 血清フリー幹細胞培地のピペット8mLをフラスコに入れ、上下3回パイペットを混ぜて、細胞を15mL無菌遠心管に移す。4°Cで5分間200 x gで細胞を遠心分離します。上清を吸引する。
   6. 細胞を10mLのPBSで洗浄します。ピペットを上下に3~5回混ぜます。4°Cで5分間200 x gで細胞を遠心分離します。上清を吸引する。
      注:この手順は省略可能です。
   7. 血清フリー幹細胞培地の10mLで細胞を再中断する(ステップ1.1に記載されているように)。ピペットを上下に3~5回混ぜます。細胞の10 μLを取り、トリパンブルー溶液の10 μLと混合します。カウントスライドに混合物のピペット10 μLは、自動セルカウンタを使用して生細胞数を定量する。
   8. 血清フリー幹細胞培地(ステップ1.1に記載)で細胞密度を2.5 x 10⁵細胞/mLに調整し、細胞の2mLを6ウェル細胞培養プレートの各ウェルにシードします。細胞の種類ごとに、種子3ウェル(三量体試料)。同時に、無血清幹細胞培地のみ(細胞なし)の2mLで6ウェルを調製する。
      注:これらのサンプルは、負のコントロールとして 1) セル番号に基づいて条件付き中量を調整するための 2) を使用します。
   9. 5%CO₂で37°Cのインキュベーターに6ウェルプレートを入れます。細胞が24時間成長することを許可します。

3. インビトロマクロファージアトラクションアッセイ

1. 条件付きメディアの準備
   1. 腫瘍細胞維持培地(ステップ1.3に記載)を37°Cの水浴で20分間温めます。
   2. 70%のエタノールで組織培養フード表面にスプレーし、ペーパータオルで表面の70%エタノールを拭き取ります。冷蔵庫からセルの取り外し液を取ります。70%エタノールで培地と細胞剥離液のボトルをスプレーし、表面の70%エタノールをペーパータオルで拭き取り、ティッシュ培養フードに入れます。
   3. インキュベーターから6ウェルプレートを取り出します。15 mLの無菌遠心管に条件付き媒体を慎重にピペット。チューブを氷の上に置きなさい。別の15 mL滅菌遠心管によく「メディアのみ」のメディアをピペット。
      注:この手順の前に、細胞が付着しているかどうかを顕微鏡で確認してください。そうでない場合は、ステップ 2.4.8 でコーティングされたプレートを使用して、より良い取り付けを可能にしたり、計数ステップに浮動セルを含めることができます。
   4. 6ウェルプレートの各ウェルに0.5 mLのセル剥離溶液を加えます。腫瘍細胞が毎分切り上がるかどうかを確認してください。腫瘍細胞が切り上がったら、プレートの側面を軽くタップして、細胞の剥離を助けます。
   5. 腫瘍細胞維持培地のピペット2.5mLをウェルに、ピペットを上下3回混合し、細胞を15mL無菌遠心分離管に移す。細胞の10 μLを取り、トリパンブルー溶液の10 μLと混合します。カウントスライドに混合物のピペット10 μLを、自動セルカウンタを使用して生細胞の数を定量化する。
   6. 血清フリー幹細胞培地(一晩37°Cインキュベーション)を用いて細胞数に応じて調節された培地の体積を調整する。たとえば、Well Aが最も少ない数の細胞を持つウェルの3倍の生細胞を有する場合、その条件付き培地1:3を希釈する。このステップは、細胞増殖速度によって引き起こされる差異を制御するために使用されます。
      注:一晩37°Cインキュベーションで血清フリー幹細胞培地を使用する理由は、長時間の37°C曝露で培地中の可能な変化を制御するからである。
   7. 0.45 μm フィルターを使用して、条件付きメディアをフィルタリングします。条件付きメディアを氷の上に置きます。
      注:このステップは、条件付き媒体内の細胞および細胞破片を除去する。
2. MV-4-11細胞の調製
   1. IMDM培地(FBSなし)を37°Cの水浴で20分間温めます。
   2. 70%のエタノールで組織培養フード表面にスプレーし、ペーパータオルで表面の70%エタノールを拭き取ります。70%のエタノールで中瓶をスプレーし、ペーパータオルで表面の70%エタノールを拭き取り、組織培養フードに入れます。
   3. MV-4-11細胞のフラスコを組織培養フードに取り込む。15 mL無菌遠心チューブに細胞のピペット10 mL。10 μLの細胞を取り、トリパンブルー溶液の10 μLと混合します。カウントスライドに混合物のピペット10 μLを、自動セルカウンタを使用して生細胞の数を定量化する。4°Cで5分間200xgで細胞を遠心分離します。上清を吸引する。
   4. 10 mLのPBSで細胞を洗浄し、4°Cで5分間200xgで細胞を遠心分離します。 上清を吸引する。
   5. IMDM培地(FBSを使用せずに)の細胞を1x10⁶セル/mLの最終細胞密度に再中断します。
      注:ここで使用するマクロファージの細胞数を調整することができる。
3. トランスウェル・アッセイ
   注:このステップでは、細胞移行アッセイキットを使用するか、試薬を購入して別途挿入します。MV-4-11 セルの場合は、5 μm の細孔サイズのトランスウェルインサートを選択します。マクロファージの移行を検出するには、下部チャンバー内のマクロファージの数を直接定量化するか、比色/蛍包法を使用します。ここでは、色分法を用いてアッセイを示す。
   1. 24ウェルプレート、インサート、試薬を室温にします。
   2. 上記のMV-4-11細胞を250μLで各インサートに加えます。
   3. 24ウェルプレートの下部チャンバーに400 μLの条件付き培地/中(37°Cでの一晩インキュベーションで、これらのサンプルは負のコントロールとして機能します)を追加します。各腫瘍ラインまたはコントロールに対して、三部サンプルを使用します。インサートと条件付き媒体の間の気泡は避けてください。気泡は、マクロファージが底部ウェルに移行するのを阻害します。
   4. プレートを37°Cのインキュベーターで4時間5%CO2でインキュベートします。
      注:インキュベーション時間を調整できます。下部のチャンバーに移動する細胞は、顕微鏡下で見ることができます。
   5. 同じ井戸の内壁のインサートをそっとタップし、インサートを捨てます。MV-4-11細胞が懸濁液中で増殖するにつれて、細胞剥離溶液またはトリプシン処理はここでは必要ありません。
   6. ウェルの細胞を上下に3回ゆっくりとピペットし、混ぜます。蛍光測定に適した黒壁96ウェルプレートに225μLの細胞懸濁液を移します。
   7. 4xリシスバッファーでCyQuant色素1:75を希釈します。渦は簡単に、ソリューションをスピンダウンします。96ウェルプレートの各ウェルに75μLの溶液を加えます。室温で15分インキュベートします。
   8. 蛍光プレートリーダーを使用して480/520 nmフィルターセットを使用して蛍光を読み取ります。
   9. ブランクを減算し、対照腫瘍細胞株に正規化してデータを分析します。

結果は通常、棒グラフを介して表示されます (図 1に示す例)。480/520 の値が高いサンプルは、条件付きメディアがマクロファージを募集する能力が高いことを示します。実験的なニーズに応じて、追加のコントロールを含めることができます。例えば、中和抗体を使用して、条件付き培った培膜を治療してマクロファージケモタキシスを廃止し、同じアッセイを行うことができます。また、条件付きメディアに余分なケモカイン(CCL2)を追加することもでき、これは正のコントロールとして機能します。

図1:EgFRとEGFRvIIIを共発現するU87細胞からの条件付き培養培地は、対照ベクターを発現するU87細胞よりも多くのマクロファージ、またはEGFR/EGFRvIIIを一人で引き付ける。この図は、An. ら⁷から変更されています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

このプロトコルでは、いくつかの重要なステップがあります:1)トランスウェルインサートの選択。MV-4-11細胞株の場合、5μmトランスウェルインサートはうまく機能します。しかし、一般的に使用される単球細胞株THP-1のような他の細胞株の場合、異なる細孔サイズがより良く働くかもしれません。2)異なる細胞株が異なる速度で成長するにつれて、セル番号に応じて条件付き媒体の体積を調整することが重要である。この目的のために、同じ実験条件下でインキュベートされた無細胞培温を用いて、条件付き培養培具を希釈することができる。3)FBSはサイトカインを含有する。上室にMV-4-11細胞を播種するために無血清培地を使用することが重要です。ここで FBS を使用すると、細胞の移行が観察されない場合があります。

研究者は、異なるアプリケーションに対してこのアッセイを変更できます。例えば、他の腫瘍細胞は、一次患者由来異種移植片培養物、またはマウス細胞のいずれかが、上記の例で使用される脳腫瘍細胞株を置換することができる。マクロファージ細胞株は、特定の必要性に応じて、患者またはマウスからの一次マクロファージまたは単球によって置換することができる。1つの重要な点は、研究者が最良の結果を確実にするために、同じ種から細胞を選択する必要があることです。マクロファージケモタキシス経路は高度に保存されているが、異なる種間の構造のタンパク質配列の変化は、実験結果を解釈するために合併症の層を追加する可能性がある。

TAMは、がん免疫学13、14でますます注目を集めています。腫瘍の異なる遺伝的変化が腫瘍微小環境におけるTAMおよび他の免疫細胞の募集にどのように影響するかは、まださらなる研究を待っている。トランスウェル挿入物の細孔サイズを変更することにより、このアッセイは、腫瘍とT細胞およびNK細胞などの他の免疫細胞との相互作用を研究するために使用することができる。トランスウェルアッセイを使用して腫瘍と免疫相互作用を評価する利点の1つは、特定の腫瘍遺伝子/突然変異が特定のタイプの免疫細胞の募集にどのように影響するかを示しやすいことです。さらに、このアッセイはゲノムワイドスクリーンのスケールアップが容易です。このアッセイは、研究者が腫瘍と免疫細胞の相互作用を研究するための追加の可能性を開きます。さらに、このアッセイは、腫瘍細胞からの条件付き培養培養物がマクロファージ/他の免疫細胞の転写プロファイルにどのように影響するかを研究するために使用することができる。

すべてのアッセイには限界があります。このアッセイについて、条件付き培地は、インビトロで培養された腫瘍細胞からである。ここで分泌されたケモカインは、生体内で増殖した腫瘍によって分泌されるものとは異なる場合があります。さらに、マクロファージ細胞株は腫瘍浸潤マクロファージとは異なり、より一般的で転写的に多様である。したがって、他のインビトロおよびインビボ法を用いたインビトロ所見のさらなる確認が必要である。

ウィリアム・A・ワイスはステムシナジー・セラピューティクスの共同創設者です。Zhenyi Anは何も開示する必要はありません。

助成金:Z.Aは、アレックスのレモネードスタンド財団、米国脳腫瘍協会、NIH T32CA108462、サンドラー財団が部分的に資金提供している画期的な生物医学研究プログラムから支援を受けました。W. ワイスは、NIH助成金R01CA221969、R01NS091620、P50CA097257、U01CA217864、P30CA82103によってサポートされました。サミュエル・G・ワックスマン癌研究財団;そして、エブリンとマッティ・アンダーソン・チェア。