In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction (en)

Cet article représente un analyse in vitro utile pour évaluer la capacité du milieu conditionné des cellules de tumeur pour attirer des macrophages.

Les macrophages associés aux tumeurs (TAM) représentent un grand pourcentage de cellules dans la masse tumorale pour différents types de cancers. Glioblastoma (GBM), une tumeur maligne de cerveau sans traitement, a jusqu'à la moitié de la masse tumorale TAMs. Les TAM peuvent être pro-tumoral ou anti-tumoral, selon l'activation de gènes spécifiques dans les cellules. Les mutations génétiques dans les tumeurs, par la régulation de l'expression cytokine, peuvent affecter le recrutement de TAMs au microenvironnement de tumeur. Ici, nous décrivons un essai cellulaire quantitatif pour évaluer le recrutement de macrophage par le milieu conditionné des cellules de tumeur. Cet exemple utilise la lignée cellulaire de macrophage humain MV-4-11 pour étudier l'attraction du macrophage par le milieu conditionné du glioblastome, ce qui permet une reproductibilité élevée et une faible variabilité. Les données générées avec cet analyse peuvent contribuer à une meilleure compréhension de l'interaction entre la tumeur et le microenvironnement tumoral. Des résultats similaires peuvent être utilisés pour évaluer l'interaction entre les cellules tumorales et d'autres cellules immunitaires, y compris les lymphocytes T et les cellules tueuses naturelles (NK).

Les macrophages sont des cellules immunitaires à haute hétérogénéité phénotypique et fonctionnelle¹. Ils jouent des rôles importants dans les systèmes de défense hôte, la réparation des tissus, le développement et la progression tumorale¹. Les TAM sont des macrophages dans le microenvironnement des tumeurs solides. Certains TAMs peuvent favoriser la croissance de tumeur en inhibant l'activité cytotoxique T cellule-négociée, modulant le microenvironnement de tumeur (TME), favorisant l'angiogenèse, l'invasion et la métastasie^{2,3,4, 5}. Les TAMsont parmi les types de cellules les plus abondants dans le TME et lenombre plus élevé de TAMs est généralement corrélé avec la survie plus mauvaise patiente dans beaucoup de types de tumeurs pleines 6. Les signatures génétiques distinctes des cellules tumorales affectent leur capacité à recruter des macrophages. Dans GBM, une tumeur cérébrale agressive sans traitement, les macrophages peuvent représenter jusqu'à la moitié de la masse tumorale⁷. La co-amplification du récepteur épidermique de facteur de croissance (EGFR) et de son EGFRvIII mutant de truncation est fréquemment observée dans GBM, qui confère des avantages de croissance de tumeur^8. Les cellules co-exprimant EGFR et EGFRvIII attirent plus de macrophages que les cellules exprimant EGFR ou EGFRvIII individuellement⁷.

Chemokines sont une famille de petites cytokines qui jouent un rôle important dans la régulation de la composition immunitaire dans le TME^6,9. Les cellules humaines expriment plus de 50 cytokines¹⁰. L'infiltration immunitaire dans les tumeurs est largement réalisée par l'interaction entre les cytokines et les récepteurs cytokine¹¹. Chaque type de cellules immunitaires exprime des récepteurs chimiokine distincts/chemokines et peut être recruté par des cellules sécrétant des chimiokines spécifiques/récepteurs de chimiokine¹². Les cellules cancéreuses peuvent augmenter l'expression de certaines chimiocines pour recruter des cellules immunitaires telles que les TAM, les lymphocytes T régulateurs et les cellules suppressrices dérivées du myéloïde (MDSC)⁶. Le blocus de la chimiokine spécifique sécrétée par les tumeurs peut être un moyen prometteur en inhibant l'infiltration des cellules immunitaires dans la masse tumorale.

Ici, nous décrivons un protocole qui permet l'évaluation in vitro de l'interaction tumeur-macrophage, utilisant les médias conditionnés des cellules de tumeur contenant des chemokines et des lignées de cellules de macrophage.

1. Préparation moyenne

1. Préparation du milieu des cellules souches sans sérum
   1. Décongelez le supplément de 50x B27, le facteur de croissance épidermique (EGF, 20 g/mL en acide acétique de 10 mM avec 0,1 % de BSA) et le facteur de croissance du fibroblaste (FGF, 20 g/mL dans 10 mM d'acide acétique avec 0,1 % de BSA).
   2. Ajouter 500 oL d'EGF (concentration finale 20 ng/mL), 500 oL de FGF (concentration finale 20 ng/mL), 10 ml de 50x B27 à 500 mL de Mélange d'aigle modifié/nutritif F-12 (DMEM/F12) et 5 mL de 100x Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep) Inverser la bouteille 4-6 fois pour mélanger, filtrer la stérilisation à travers une tasse de filtration de 500 ml 0,1 m. Marquer la bouteille et l'entreposer à 4 oC.
      REMARQUE: Le milieu est bon à utiliser jusqu'à un mois à 4 oC.
2. Préparer le milieu de culture MV-4-11 : Ajouter 50 ml de sérum bovin fœtal (FBS) à 500 ml du moyen dudulbecco modifié d'Iscove (IMDM). Inverser la bouteille 4-6 fois pour mélanger, filtrer la stérilisation à travers une tasse de filtration de 500 ml 0,1 m. Marquer la bouteille et l'entreposer à 4 oC.
   REMARQUE: Le milieu est bon à utiliser jusqu'à un mois à 4 oC.
3. Préparer le milieu d'entretien des cellules tumorales : Ajouter 50 ml de FBS à 500 ml du milieu aigle modifié (DMEM) de Dulbecco. Inverser la bouteille 4-6 fois pour mélanger, filtrer la stérilisation à travers une tasse de filtration de 500 ml 0,1 m. Marquer la bouteille et l'entreposer à 4 oC.
   REMARQUE: Le milieu est bon à utiliser jusqu'à un mois à 4 oC.

2. Préparation cellulaire

Jour 1:

1. Décongélation des cellules tumorales
2. Réchauffez le milieu d'entretien des cellules tumorales (tel que décrit à l'étape 1.3) à un bain d'eau de 37 oC pendant 20 min.
3. Prenez les cellules congelées U87, U87:EGFR, U87:EGFRvIII et U87:EGFR-EGFRvIII du réservoir d'azote liquide. Décongeler les cellules du bain d'eau de 37 oC pendant 2 min.
   CAUTION: Soyez prudent lorsque vous prenez les cellules du réservoir d'azote liquide. Portez des gants avec protection thermique et lunettes de sécurité au besoin.
4. Vaporiser la surface du capuchon de culture tissulaire avec 70 % d'éthanol et essuyer 70 % d'éthanol à la surface avec du papier essuie-tout.
5. Vaporiser les flacons cryogéniques contenant des cellules et la bouteille moyenne avec 70% d'éthanol, essuyer 70% d'éthanol sur la surface avec des essuie-tout, et les amener dans le capot de culture de tissu.
6. Pipette 5 ml de support d'entretien de cellules de tumeur dans un tube stérile de centrifugeuse de 15 ml. Inverser le tube contenant des cellules tumorales 4-6 fois à mélanger. Pipette toutes les cellules dans le tube centrifugeur de 15 ml. Inverser le tube de centrifugeuse 4-6 fois pour mélanger.
7. Centrifuger les cellules à 200 x g pendant 5 min à 4 oC. Aspirez le supernatant.
8. Laver les cellules avec 10 ml de phosphate tamponné salin (PBS). Centrifuger les cellules à 200 x g pendant 5 min à 4 oC. Aspirez le supernatant.
9. Resuspendre les cellules dans 12 ml du milieu d'entretien de cellules de tumeur (comme décrit dans l'étape 1.3). Pipette de haut en bas 3-5 fois pour mélanger. Transférer les cellules dans un flacon de culture cellulaire T75.
10. Cultivez les cellules dans un incubateur de37 oC avec 5 % de CO 2. Remettre le milieu d'entretien des cellules tumorales au réfrigérateur à 4 oC.

Jour 2:

2. Vérifiez les cellules sous le microscope. Changer le support si nécessaire. Les cellules doivent se développer dans un monocouche dans la culture.

Jour 3:

3. Décongélation des cellules MV-4-11
   1. Réchauffez le milieu de culture MV-4-11 (tel que décrit à l'étape 1.2) à un bain d'eau de 37 oC pendant 20 min.
      REMARQUE: MV-4-11 peut être changé en macrophages primaires ou d'autres lignées de cellules macrophages, selon le besoin de l'étude spécifique.
   2. Retirez les cellules MV-4-11 congelées du réservoir d'azote liquide. Décongeler les cellules à un bain d'eau de 37 oC pendant 2 min.
      MISE EN GARDE: Soyez prudent lorsque vous prenez les cellules du réservoir d'azote liquide. Portez des gants avec protection thermique et lunettes de sécurité au besoin.
   3. Vaporiser la surface du capuchon de culture tissulaire avec 70 % d'éthanol et essuyer 70 % d'éthanol à la surface avec du papier essuie-tout.
   4. Vaporiser les flacons cryogéniques contenant des cellules et la bouteille moyenne avec 70% d'éthanol, essuyer 70% d'éthanol sur la surface avec des essuie-tout, et les amener dans le capot de culture de tissu.
   5. Pipette 5 mL de milieu de culture MV-4-11 (tel que décrit à l'étape 1.2) dans un tube de centrifugeuse stérile de 15 ml. Inverser le tube contenant des cellules tumorales 4-6 fois à mélanger. Pipette toutes les cellules dans le tube centrifugeur de 15 ml. Inverser le tube de centrifugeuse 4-6 fois pour mélanger.
   6. Centrifuger les cellules à 200 x g pendant 5 min à 4 oC. Aspirez le supernatant.
   7. Laver les cellules dans 10 ml de PBS et centrifuger les cellules à 200 x g pendant 5 min à 4 oC. Aspirez le supernatant.
   8. Resuspendre les cellules dans 12 ml de mv-4-11 milieu de culture (comme décrit à l'étape 1.2). Pipette doucement de haut en bas 3-5 fois pour mélanger. Transférer les cellules dans un flacon de culture cellulaire T75.
   9. Cultivez les cellules dans un incubateur de37 oC avec 5 % de CO 2.
4. Fractionnement des cellules tumorales
   1. Réchauffez le milieu des cellules souches sans sérum (tel que décrit à l'étape 1.1) dans un bain d'eau de 37 oC pendant 20 min.
   2. Vaporiser la surface du capuchon de culture tissulaire avec 70 % d'éthanol et essuyer 70 % d'éthanol à la surface avec du papier essuie-tout. Retirez la solution de détachement cellulaire du réfrigérateur. Vaporiser les bouteilles de solution de détachement moyen et cellulaire avec 70 % d'éthanol, essuyer 70 % d'éthanol à la surface avec du papier essuie-tout et les amener dans le capuchon de culture tissulaire.
      REMARQUE: Ne pas réchauffer la solution de détachement cellulaire accutase.
   3. Transférer la culture des cellules tumorales de l'incubateur dans le capot de culture tissulaire. Aspirer le milieu, ajouter 2 ml de solution de détachement cellulaire dans le flacon.
      REMARQUE: Le rinçant avec PBS avant d'ajouter accutase est facultatif ici.
   4. Mettre le flacon dans le capot. Vérifiez si les cellules tumorales arrondissnt chaque minute. Une fois les cellules tumorales arrondies, appuyez doucement sur le côté du flacon pour aider les cellules à se détacher du flacon.
   5. Pipette 8 ml de milieu de cellules souches sans sérum dans le flacon, pipette de haut en bas 3 fois pour mélanger, et transférer les cellules dans un tube de centrifugeuse stérile de 15 ml. Centrifuger les cellules à 200 x g pendant 5 min à 4 oC. Aspirez le supernatant.
   6. Laver les cellules dans 10 ml de PBS. Pipette de haut en bas 3-5 fois pour mélanger. Centrifuger les cellules à 200 x g pendant 5 min à 4 oC. Aspirez le supernatant.
      REMARQUE: Cette étape est facultative.
   7. Resuspendre les cellules dans 10 ml de milieu de cellules souches sans sérum (comme décrit à l'étape 1.1). Pipette de haut en bas 3-5 fois pour mélanger. Prendre 10 l des cellules et mélanger avec 10 l de solution Trypan Blue. Pipette 10 l du mélange dans la glissière de comptage, quantifier le numéro de cellule vivante à l'aide d'un compteur cellulaire automatique.
   8. Ajuster la densité cellulaire à 2,5 x 10⁵ cellules/mL avec un milieu de cellules souches sans sérum (tel que décrit à l'étape 1.1), et seed 2 ml des cellules dans chaque puits d'une plaque de 6 puits de culture cellulaire. Pour chaque type de cellules, les graines 3 puits (échantillon de triplicate). En même temps, préparer 6 puits avec 2 ml de milieu de cellules souches sans sérum seulement (pas de cellules).
      REMARQUE: Ces échantillons seront utilisés : 1) comme contrôles négatifs et 2) pour ajuster le volume moyen conditionné en fonction du nombre de cellules.
   9. Mettre les plaques de 6 puits dans un incubateurde 37 oC avec 5 % de CO 2. Laisser les cellules se développer pendant 24 h.

3. In Vitro Macrophage Attraction Assay

1. Préparation des supports conditionnés
   1. Réchauffez le milieu d'entretien des cellules tumorales (tel que décrit à l'étape 1.3) à un bain d'eau de 37 oC pendant 20 min.
   2. Vaporiser la surface du capuchon de culture tissulaire avec 70 % d'éthanol et essuyer 70 % d'éthanol à la surface avec du papier essuie-tout. Retirez la solution de détachement cellulaire du réfrigérateur. Vaporiser les bouteilles du milieu et de la solution de détachement cellulaire avec 70% d'éthanol, essuyer 70% d'éthanol sur la surface avec des essuie-tout et les amener dans le capot de culture tissulaire.
   3. Sortez les plaques de 6 puits de l'incubateur. Soigneusement pipette le support conditionné dans 15 ml de tubes de centrifugeuse stériles. Mettez les tubes sur la glace. Pipette les médias dans le "média seulement" bien dans un tube de centrifugeuse stérile séparée de 15 ml.
      REMARQUE: Avant cette étape, assurez-vous de vérifier sous le microscope pour voir si les cellules se fixent. Si ce n'est pas le cas, on peut utiliser des plaques enduites à l'étape 2.4.8 pour permettre une meilleure fixation ou inclure les cellules flottantes dans l'étape de comptage.
   4. Ajouter 0,5 ml de solution de détachement cellulaire dans chaque puits de la plaque de 6 puits. Vérifiez si les cellules tumorales arrondissnt chaque minute. Une fois les cellules tumorales arrondies, appuyez doucement sur le côté de la plaque pour aider les cellules à se détacher.
   5. Pipette 2,5 ml de milieu d'entretien des cellules tumorales dans le puits, pipette de haut en bas 3 fois pour mélanger et transférer les cellules dans un tube de centrifugeuse stérile de 15 ml. Prendre 10 l des cellules et mélanger avec 10 l de solution Trypan Blue. Pipette 10 l du mélange dans la glissière de comptage et quantifier le nombre de cellules vivantes à l'aide d'un compteur cellulaire automatique.
   6. Ajuster le volume du milieu conditionné en fonction du numéro de cellule à l'aide du milieu de cellules souches sans sérum (incubation de 37 oC pendant la nuit). Par exemple, si Well A a 3x autant de cellules vivantes que le puits avec le moins de cellules, diluer son support conditionné 1:3. Cette étape est utilisée pour contrôler la différence causée par le taux de prolifération cellulaire.
      REMARQUE: La raison d'utiliser le milieu de cellules souches sans sérum avec une incubation de 37 oC pendant la nuit est de contrôler le changement possible dans les milieux avec une exposition prolongée de 37 oC.
   7. Filtrer le support conditionné à travers des filtres de 0,45 m. Mettez les supports conditionnés sur la glace.
      REMARQUE: Cette étape élimine les cellules et les débris cellulaires dans le support conditionné.
2. Préparation des cellules MV-4-11
   1. Réchauffez le milieu IMDM (sans FBS) à un bain d'eau de 37 oC pendant 20 min.
   2. Vaporiser la surface du capuchon de culture tissulaire avec 70 % d'éthanol et essuyer 70 % d'éthanol à la surface avec du papier essuie-tout. Vaporiser la bouteille moyenne avec 70% d'éthanol, essuyer 70% d'éthanol sur la surface avec des essuie-tout et les apporter dans le capot de culture de tissu.
   3. Prenez le flacon de cellules MV-4-11 dans le capot de culture de tissu. Pipette 10 ml de cellules dans un tube de centrifugeuse stérile de 15 ml. Prendre 10 l de cellules et mélanger avec 10 l de solution Trypan Blue. Pipette 10 l du mélange dans la glissière de comptage et quantifier le nombre de cellules vivantes à l'aide d'un compteur cellulaire automatique. Centrifuger les cellules à 200 x g pendant 5min à 4 oC. Aspirez le supernatant.
   4. Laver les cellules avec 10 ml de PBS et centrifuger les cellules à 200 x g pendant 5 min à 4 oC. Aspirez le supernatant.
   5. Resuspendre les cellules dans le milieu IMDM (sans FBS) pour une densité cellulaire finale de 1x10⁶ cellules/mL.
      REMARQUE: Le nombre de cellules de macrophages utilisés ici peut être ajusté.
3. Transwell d'assay
   REMARQUE: Pour cette étape, utilisez un kit d'assiducellulaire ou achetez les réactifs et insérez séparément. Pour les cellules MV-4-11, choisissez des inserts Transwell de taille de 5 pores. Pour détecter la migration des macrophages, quantifier directement le nombre de macrophages dans la chambre basse ou utiliser des méthodes colorimétriques/fluormétriques. Ici, nous démontrons l'assay en utilisant la méthode coloriométrique.
   1. Porter la plaque de 24 puits, l'insert et les réactifs à la température ambiante.
   2. Ajouter 250 l de cellules MV-4-11 préparées ci-dessus dans chaque insert.
   3. Ajouter 400 ll de milieu/moyen conditionné seulement (avec une incubation de nuit à 37 oC, ces échantillons servent de contrôle négatif) aux chambres inférieures de la plaque de 24 puits. Pour chaque ligne ou contrôle tumoral, utilisez des échantillons de triplicate. Évitez les bulles entre l'insert et le milieu conditionné. Les bulles empêcheront les macrophages de migrer vers les puits inférieurs.
   4. Incuber les plaques dans un incubateur de 37 oC avec 5 % de CO₂ pendant 4 h.
      REMARQUE: Le temps d'incubation peut être ajusté. Les cellules qui migrent dans les chambres inférieures peuvent être vues sous le microscope.
   5. Appuyez doucement sur l'insert sur la paroi intérieure du même puits et jetez l'insert. Comme les cellules MV-4-11 se développent en suspension, la solution de détachement cellulaire ou le traitement de trypsine n'est pas nécessaire ici.
   6. Doucement pipette les cellules dans les puits de haut en bas 3 fois pour mélanger. Transférer 225 l de suspension cellulaire sur une plaque de 96 puits à parois noires adaptée à la mesure fluorescente.
   7. Diluer le colorant CyQuant 1:75 avec un tampon de lyse 4x. Vortex brièvement et tourner vers le bas la solution. Ajouter 75 ll de solution à chaque puits de la plaque de 96 puits. Incuber 15 min à température ambiante.
   8. Lisez la fluorescence à l'aide du filtre 480/520 nm avec un lecteur de plaque de fluorescence.
   9. Analyser les données en soustrayant le blanc et la normalisation à la ligne de cellules tumorales de contrôle.

Les résultats sont généralement affichés au moyen de graphiques à barres (exemple illustré à la figure 1). Des échantillons avec des valeurs élevées de 480/520 indiquent que le support conditionné a une grande capacité de recruter des macrophages. Selon les besoins expérimentaux, des contrôles supplémentaires peuvent être inclus. Par exemple, on peut utiliser des anticorps neutralisants pour traiter les médias conditionnés pour abolir la chimiotaxie macrophage, et effectuer le même analyse. On peut également ajouter des chemokines supplémentaires (c.-à-d. CCL2) au support conditionné, qui sert de contrôle positif.

Figure 1 : Les médias conditionnés des cellules U87 co-exprimant l'EGFR et l'EGFRvIII attirent plus de macrophages que les cellules U87 exprimant un vecteur de contrôle, ou EGFR/EGFRvIII individuellement. Ce chiffre a été modifié à partir de An, et al.⁷. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Dans ce protocole, il y a plusieurs étapes clés : 1) sélection de l'insert Transwell. Pour la lignée cellulaire MV-4-11, les inserts Transwell de 5 m fonctionnent bien. Cependant, pour d'autres lignées cellulaires telles que la lignée cellulaire de monocytes THP-1 couramment utilisée, une taille de pores différente pourrait mieux fonctionner. 2) Comme différentes lignées cellulaires se développent à des vitesses différentes, il est important d'ajuster le volume des supports conditionnés en fonction du nombre de cellules. À cette fin, les médias sans cellules incubés dans les mêmes conditions expérimentales peuvent être utilisés pour diluer les supports conditionnés. 3) FBS contient des cytokines. Il est important d'utiliser un milieu sans sérum pour ensemencer les cellules MV-4-11 dans la chambre haute. Si FBS est utilisé ici, parfois la migration cellulaire ne peut pas être observée.

Les chercheurs peuvent modifier cet analyse pour différentes applications. Par exemple, d'autres cellules tumorales, soit la culture primaire de xénogreffe dérivée du patient, ou les cellules de souris peuvent remplacer la lignée cellulaire tumorale du cerveau utilisée dans l'exemple mentionné ci-dessus. La lignée de cellules macrophages peut être remplacée par des macrophages primaires ou des monocytes de patients ou de souris en fonction des besoins spécifiques. Un point important est que les chercheurs doivent sélectionner des cellules de la même espèce pour assurer le meilleur résultat. Bien que la voie de chimiotaxie de macrophage soit fortement préservée, la variation de la séquence de protéine de la structure entre différentes espèces peut ajouter des couches de complication pour interpréter des résultats expérimentaux.

Les MAT attirent de plus en plus l'attention dans l'immunologie du cancer^13,14. Comment différents changements génétiques dans les tumeurs affectent le recrutement de TAMs et d'autres cellules immunitaires dans le microenvironnement de tumeur attend toujours d'autres études. En changeant la taille des pores des inserts Transwell, cet analyse peut être utilisé pour étudier l'interaction entre la tumeur et d'autres cellules immunitaires telles que les lymphocytes T et les cellules NK. Un avantage d'utiliser l'analyse De Transwell pour évaluer l'interaction tumeur-immune est qu'il est facile de démontrer comment les oncogènes/mutations spécifiques affectent le recrutement d'un certain type de cellules immunitaires. En outre, cet effort est facile à mettre à l'échelle pour les écrans à l'échelle du génome. Cet analyse ouvre des possibilités supplémentaires pour les chercheurs d'étudier les interactions tumorales-immunes. En outre, cet analyse peut être utilisé pour étudier comment les médias conditionnés des cellules tumorales affectent le profil de transcription des macrophages / autres cellules immunitaires.

Tous les essais ont leurs limites. Pour cet exemple, le milieu conditionné provient de cellules tumorales cultivées in vitro. Les chimiocines sécrétées ici pourraient être différentes de celles sécrétées par des tumeurs cultivées in vivo. En outre, la lignée de cellules de macrophage est différente des macrophages infiltrants de tumeur, qui sont plus phénotypiquement et transcriptionnellement divers. Par conséquent, une confirmation supplémentaire des résultats in vitro utilisant d'autres méthodes in vitro et in vivo est nécessaire.

William A. Weiss est cofondateur de StemSynergy Therapeutics. Zhenyi An n'a rien à révéler.

Soutien aux subventions : Z. An a reçu le soutien d'Alex's Lemonade Stand Foundation, de l'American Brain Tumor Association, du NIH T32CA108462 et du Program for Breakthrough Biomedical Research, qui est partiellement financé par la Sandler Foundation. W. Weiss a reçu l'appui des subventions des NIH R01CA221969, R01NS091620, P50CA097257, U01CA217864, P30CA82103; la Samuel G. Waxman Cancer Research Foundation; et la chaise Evelyn et Mattie Anderson.