In Vitro Analisi per studiare l'interazione tumora-macrophage

Questo articolo rappresenta un utile saggio in vitro per valutare la capacità del mezzo condizionato dalle cellule tumorali per attirare i macrofagi.

I macrofagi associati al tumore (TAM) rappresentano una grande percentuale di cellule nella massa tumorale per diversi tipi di cancro. Glioblastoma (GBM), un tumore maligno al cervello senza cura, ha fino a metà dei ARM di massa tumorale. I TAM possono essere pro-tumorale o anti-tumorale, a seconda dell'attivazione di geni specifici nelle cellule. Le mutazioni genetiche nei tumori, attraverso la regolazione dell'espressione della citochina, possono influenzare il reclutamento di TAM nel microambiente tumorale. Qui, descriviamo un saggio quantitativo basato sulle cellule per valutare il reclutamento di macrofaci da parte del mezzo condizionato dalle cellule tumorali. Questo analisi utilizza la linea cellulare del macrofago umano MV-4-11 per studiare l'attrazione dei macrofazaggi da parte del mezzo condizionato dal glioblastoma, consentendo un'elevata riproducibilità e bassa variabilità. I dati generati con questo saggio possono contribuire a una migliore comprensione dell'interazione tra il tumore e il microambiente tumorale. Un saggio simile può essere usato per valutare l'interazione tra le cellule tumorali e altre cellule immunitarie, comprese le cellule T e le cellule killer naturali (NK).

I macrofagi sono cellule immunitarie con un'elevata eterogeneità fenotipica e funzionale¹. Essi svolgono ruoli importanti nei sistemi di difesa ospite, riparazione dei tessuti, sviluppo e progressione del tumore¹. I TAM sono macrofagi nel microambiente dei tumori solidi. Alcuni TAM possono promuovere la crescita tumorale inibendo l'attività citotossica mediata dalle cellule T, modulando il microambiente tumorale (TME), promuovendo l'angiogenesi, l'invasione e la metastasi^{2,3,4, 5}. I TAM sono tra i tipi di cellule più abbondanti nel TME e un numero più elevato di TAM in genere è correlato alla peggiore sopravvivenza del paziente in molti tipi di tumori solidi⁶. Le distinte firme genetiche delle cellule tumorali influenzano la loro capacità di reclutare macrofagi. In GBM, un tumore cerebrale aggressivo senza cura, i macrofagi possono rappresentare fino alla metà della massa tumorale⁷. La coamplificazione del recettore del fattore di crescita epidermico (EGFR) e del suo mutante di troncamento EGFRvIII è frequentemente osservata in GBM, che conferisce vantaggi di crescita tumorale⁸. Le cellule che coeprimono EGFR ed EGFRvIII attraggono più macrofagi rispetto alle cellule che esprimono EGFR o EGFRvIII da poco^.

Le chemiochine sono una famiglia di piccole citochine che svolgono un ruolo significativo nella regolazione della composizione immunitaria nel TME^6,9. Le cellule umane esprimono più di 50 citochine¹⁰. L'infiltrazione immunitaria nei tumori è in gran parte realizzata dall'interazione tra citochine e recettori citochine¹¹. Ogni tipo di cellule immunitarie esprime recettori chemiochine distinti/ chemiochine e può essere reclutato da cellule che secernono chemiochine specifiche / recettori chemiochine¹². Le cellule tumorali possono aumentare l'espressione di alcune chemiochine per reclutare cellule immunitarie come TAM, cellule T regolatorie e cellule soppressori derivate da mieloidi (MDSC)⁶. Il blocco della chemiochina specifica secreta dai tumori può essere un modo promettente per inibire l'infiltrazione delle cellule immunitarie nella massa del tumore.

Qui, descriviamo un protocollo che consente la valutazione in vitro dell'interazione tumora-macrofago, utilizzando supporti condizionati dalle cellule tumorali contenenti chemiochine e linee cellulari di macrofago.

1. Preparazione media

1. Preparazione del mezzo di cellule staminali senza siero
   1. Scongelare il supplemento 50x B27, il fattore di crescita epidermico (EGF, 20 g/mL in acido acetico 10 mM con 0,1% BSA) e il fattore di crescita del fibroblasto (FGF, 20g/mL in 10 m di acido acetico con 0,1% BSA).
   2. Aggiungere 500 l di EGF (concentrazione finale 20 ng/mL), 500 lof di FGF (concentrazione finale 20 ng/mL), 10 mL da 50x B27 a 500 mL di Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) e 5 mL di 100x Penicillin/Streptomycin (Pen/Strepp). Invertire la bottiglia 4-6 volte per mescolare, filtrare sterilizzare attraverso una tazza di filtrazione da 500 mL 0,1 m. Contrassegnare la bottiglia e conservarla a 4 gradi centigradi.
      NOT: Il mezzo è buono da usare per un massimo di un mese a 4 gradi centigradi.
2. Preparare il mezzo di coltura MV-4-11: aggiungere 50 mL di siero bovino fetale (FBS) a 500 mL del mezzo di Dulbecco modificato di Iscove (IMDM). Invertire la bottiglia 4-6 volte per mescolare, filtrare sterilizzare attraverso una tazza di filtrazione da 500 mL 0,1 m. Contrassegnare la bottiglia e conservarla a 4 gradi centigradi.
   NOT: Il mezzo è buono da usare per un massimo di un mese a 4 gradi centigradi.
3. Preparare il mezzo di manutenzione delle cellule tumorali: aggiungere 50 mL di FBS a 500 mL di Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM). Invertire la bottiglia 4-6 volte per mescolare, filtrare sterilizzare attraverso una tazza di filtrazione da 500 mL 0,1 m. Contrassegnare la bottiglia e conservarla a 4 gradi centigradi.
   NOT: Il mezzo è buono da usare per un massimo di un mese a 4 gradi centigradi.

2. Preparazione delle cellule

Giorno 1:

1. Scongelamento delle cellule tumorali
2. Riscaldare il mezzo di manutenzione delle cellule tumorali (come descritto al punto 1.3) a un bagno d'acqua di 37 gradi centigradi per 20 min.
3. Prendere le cellule congelate U87, U87:EGFR, U87:EGFRvIII e U87:EGFR-EGFRvIII dal serbatoio di azoto liquido. Scongelare le cellule al bagno d'acqua di 37 gradi centigradi per 2 min.
   PROCEDIMENTI: Fare attenzione quando si prendono le cellule dal serbatoio di azoto liquido. Indossare guanti con protezione termica e occhiali di sicurezza in base alle esigenze.
4. Spruzzare la superficie del cofano di coltura dei tessuti con il 70% di etanolo e pulire il 70% di etanolo sulla superficie con gli asciugamani di carta.
5. Spruzzare le fiale criogeniche contenenti cellule e la bottiglia media con 70% di etanolo, pulire 70% etanolo sulla superficie con gli asciugamani di carta, e portarli nella cappa di coltura dei tessuti.
6. Pipette 5 mL di mezzo di manutenzione delle cellule tumorali in un tubo di centrifuga sterile 15 mL. Invertire il tubo contenente le cellule tumorali 4-6 volte per mescolare. Pipette tutte le cellule nel tubo di centrifuga di 15 mL. Invertire il tubo di centrifuga 4-6 volte per mescolare.
7. Centrifugare le cellule a 200 x g per 5 min a 4 gradi centigradi. Aspirare il super-attuoso.
8. Lavare le cellule con 10 mL di fosfato tamponato salina (PBS). Centrifugare le cellule a 200 x g per 5 min a 4 gradi centigradi. Aspirare il super-attuoso.
9. Risospendere le cellule in 12 mL di supporto di manutenzione delle cellule tumorali (come descritto nel passaggio 1.3). Pipetta su e giù 3-5 volte per mescolare. Trasferire le cellule in un pallone di coltura cellulare T75.
10. Far crescere le cellule in un'incubatrice a 37 gradi centigradi con il 5% di CO₂. Rimettere il mezzo di manutenzione delle cellule tumorali nel frigorifero di 4 gradi centigradi.

Giorno 2:

2. Controllare le cellule al microscopio. Se necessario, modificare il supporto. Le cellule dovrebbero crescere in un monostrato in coltura.

Giorno 3:

3. Scongelamento delle cellule MV-4-11
   1. Riscaldare il mezzo di coltura MV-4-11 (come descritto al punto 1.2) con un bagno d'acqua di 37 gradi centigradi per 20 min.
      NOT: MV-4-11 può essere cambiato in macrofagi primari o altre linee cellulari macrofagi, a seconda della necessità dello studio specifico.
   2. Prendere le cellule MV-4-11 congelate dal serbatoio di azoto liquido. Scongelare le cellule a un bagno d'acqua di 37 gradi centigradi per 2 min.
      ATTENZIONE: Fare attenzione quando si prendono le cellule dal serbatoio di azoto liquido. Indossare guanti con protezione termica e occhiali di sicurezza in base alle esigenze.
   3. Spruzzare la superficie del cofano di coltura dei tessuti con il 70% di etanolo e pulire il 70% di etanolo sulla superficie con gli asciugamani di carta.
   4. Spruzzare le fiale criogeniche contenenti cellule e la bottiglia media con 70% di etanolo, pulire 70% etanolo sulla superficie con gli asciugamani di carta, e portarli nella cappa di coltura dei tessuti.
   5. Pipetta 5 mL di MV-4-11 (come descritto al punto 1.2) in un tubo di centrifuga sterile da 15 mL. Invertire il tubo contenente le cellule tumorali 4-6 volte per mescolare. Pipette tutte le cellule nel tubo di centrifuga di 15 mL. Invertire il tubo di centrifuga 4-6 volte per mescolare.
   6. Centrifugare le cellule a 200 x g per 5 min a 4 gradi centigradi. Aspirare il super-attuoso.
   7. Lavare le cellule in 10 mL di PBS e centrificare le cellule a 200 x g per 5 min a 4 gradi centigradi. Aspirare il super-attuoso.
   8. Risospendere le celle in 12 mL di MV-4-11 (come descritto nel passaggio 1.2). Delicatamente pipette su e giù 3-5 volte per mescolare. Trasferire le cellule in un pallone di coltura cellulare T75.
   9. Far crescere le cellule in un'incubatrice a 37 gradi centigradi con il 5% di CO₂.
4. Suddivisione delle cellule tumorali
   1. Riscaldare il mezzo di cellule staminali senza siero (come descritto al punto 1.1) con un bagno d'acqua a 37 gradi centigradi per 20 min.
   2. Spruzzare la superficie del cofano di coltura dei tessuti con il 70% di etanolo e pulire il 70% di etanolo sulla superficie con gli asciugamani di carta. Prendere la soluzione di distacco cellulare dal frigorifero. Spruzzare le bottiglie di soluzione di distacco medio e cellulare con 70% di etanolo, pulire 70% etanolo sulla superficie con gli asciugamani di carta e portarli nella cappa di coltura dei tessuti.
      NOT: Non preriscaldare la soluzione di distacco delle celle accutasi.
   3. Trasferire la coltura delle cellule tumorali dall'incubatrice nella cappa di coltura dei tessuti. Aspirare il mezzo, aggiungere 2 mL di soluzione di distacco cellulare nel pallone.
      NOT: Il risciacquo con PBS prima di aggiungere accutase è facoltativo qui.
   4. Mettere il pallone nel cofano. Controlla se le cellule tumorali si arrotondano ogni minuto. Una volta che le cellule tumorali si arrotondano, toccare delicatamente il lato del pallone per aiutare le cellule a staccarsi dal pallone.
   5. Pipette 8 mL di mezzo di cellule staminali senza siero nel flacone, pipette su e giù 3 volte per mescolare, e trasferire le cellule in un tubo di centrifuga sterile 15 mL. Centrifugare le cellule a 200 x g per 5 min a 4 gradi centigradi. Aspirare il super-attuoso.
   6. Lavare le cellule in 10 mL di PBS. Pipetta su e giù 3-5 volte per mescolare. Centrifugare le cellule a 200 x g per 5 min a 4 gradi centigradi. Aspirare il super-attuoso.
      NOT: Questo passaggio è facoltativo.
   7. Risospendere le cellule in 10 mL di mezzo di cellule staminali senza siero (come descritto al punto 1.1). Pipetta su e giù 3-5 volte per mescolare. Prendere 10 l delle cellule e mescolare con 10 L di soluzione Trypan Blue. Pipetta 10 - L della miscela nel vetrino di conteggio, quantificare il numero di cellule viventi utilizzando un contatore cellulare automatico.
   8. Regolare la densità cellulare a 2,5 x 10⁵ cellule/mL con il mezzo di cellule staminali senza siero (come descritto al punto 1.1), e semiare 2 mL delle cellule in ogni pozzo di una piastra di coltura cellulare a 6 pozze. Per ogni tipo di cellule, seme 3 pozzi (campione triplicato). Allo stesso tempo, preparare 6 pozzi con 2 mL di mezzo di cellule staminali senza sè (senza cellule).
      NOT: Questi campioni saranno utilizzati: 1) come controlli negativi e 2) per regolare il volume medio condizionato in base ai numeri di cellulare.
   9. Mettere le 6 piastre di pozzo in un'incubatrice a 37 gradi centigradi con il 5% di CO₂. Lasciare che le cellule crescano per 24 ore.

3. In Vitro Macrophage Attrazione Saggio

1. Preparazione dei supporti condizionati
   1. Riscaldare il mezzo di manutenzione delle cellule tumorali (come descritto al punto 1.3) a un bagno d'acqua di 37 gradi centigradi per 20 min.
   2. Spruzzare la superficie del cofano di coltura dei tessuti con il 70% di etanolo e pulire il 70% di etanolo sulla superficie con gli asciugamani di carta. Prendere la soluzione di distacco cellulare dal frigorifero. Spruzzare le bottiglie del mezzo e la soluzione di distacco cellulare con il 70% di etanolo, pulire 70% etanolo sulla superficie con gli asciugamani di carta e portarli nella cappa di coltura dei tessuti.
   3. Togliere i piatti a 6 pozzi dall'incubatrice. Tubo con attenzione il supporto condizionato in 15 mL di tubi di centrifuga sterile. Metti i tubi sul ghiaccio. Pipette il supporto nel "solo media" bene in un tubo di centrifugare sterile 15 mL separato.
      NOT: Prima di questo passaggio, assicurarsi di controllare al microscopio per vedere se le cellule si attaccano. In caso contrario, è possibile utilizzare piastre rivestite al punto 2.4.8 per consentire un migliore attaccamento o includere le celle galleggianti nel passaggio di conteggio.
   4. Aggiungere 0,5 mL di soluzione di distacco cellulare in ogni pozzetto della piastra a 6 pozze. Controlla se le cellule tumorali si arrotondano ogni minuto. Una volta che le cellule tumorali si arrotondano, toccare delicatamente il lato della piastra per aiutare le cellule a staccarsi.
   5. Pipetta 2,5 mL di mezzo di manutenzione delle cellule tumorali nel pozzo, pipetta su e giù 3 volte per mescolare e trasferire le cellule in un tubo di centrifuga sterile da 15 mL. Prendere 10 l delle cellule e mescolare con 10 L di soluzione Trypan Blue. Pipetta 10 - L della miscela nel vetrino di conteggio e quantificare il numero di cellule viventi utilizzando un contatore cellulare automatico.
   6. Regolare il volume del supporto condizionato in base al numero di cellulare utilizzando il mezzo di cellule staminali libere del siero (incubazione di 37 gradi centigradi durante la notte). Ad esempio, se il pozzo A ha 3 volte il numero di celle vive con il minor numero di celle, diluire il supporto condizionato 1:3. Questo passaggio viene utilizzato per controllare la differenza causata dal tasso di proliferazione cellulare.
      NOT: Il motivo per utilizzare il supporto per cellule staminali prive di siero con 37 gradi centigradi è quello di controllare il possibile cambiamento nel supporto con un'esposizione prolungata di 37 gradi centigradi.
   7. Filtrare il supporto condizionato con i filtri da 0,45 m. Metti il supporto condizionato sul ghiaccio.
      NOT: Questo passaggio rimuove le cellule e i detriti cellulari nel supporto condizionato.
2. Preparazione delle cellule MV-4-11
   1. Riscaldare il mezzo IMDM (senza FBS) a un bagno d'acqua di 37 gradi centigradi per 20 min.
   2. Spruzzare la superficie del cofano di coltura dei tessuti con il 70% di etanolo e pulire il 70% di etanolo sulla superficie con gli asciugamani di carta. Spruzzare la bottiglia media con il 70% di etanolo, pulire 70% etanolo sulla superficie con gli asciugamani di carta e portarli nella cappa di coltura dei tessuti.
   3. Prendere il flacone di cellule MV-4-11 nel cofano di coltura dei tessuti. Pipetta 10 mL di cellule in un tubo di centrifuga sterile da 15 mL. Prendere 10 l di cellule e mescolare con 10 .L di soluzione Trypan Blue. Pipetta 10 - L della miscela nel vetrino di conteggio e quantificare il numero di cellule viventi utilizzando un contatore cellulare automatico. Centrifugare le cellule a 200 x g per 5min a 4 gradi centigradi. Aspirare il super-attuoso.
   4. Lavare le cellule con 10 mL di PBS e centrifugare le cellule a 200 x g per 5 min a 4 gradi centigradi. Aspirare il super-attuoso.
   5. Risospendere le celle nel mezzo IMDM (senza FBS) per una densità di cellule finali di 1x10⁶ celle/mL.
      NOT: Il numero di cellule di macrofagi utilizzati qui può essere regolato.
3. Saggio di Transwell
   NOT: Per questo passaggio, utilizzare un kit di analisi per la migrazione delle celle o acquistare i reagenti e inserire separatamente. Per le celle MV-4-11, scegliere Inserti Transwell con dimensioni di 5 pori m. Per rilevare la migrazione dei macrofagi, quantificare direttamente il numero di macrofagi nella camera inferiore o utilizzare metodi colorimetrici/fluorimetrici. Qui, dimostriamo il saggio usando il metodo colorimetrico.
   1. Portare la piastra 24-bene, l'inserto e i reagenti a temperatura ambiente.
   2. Aggiungete 250 celle di MV-4-11 preparate sopra in ogni inserto.
   3. Aggiungete 400 l di medio/medio condizionato (con incubazione notturna a 37 gradi centigradi, questi campioni servono come controllo negativo) alle camere inferiori della piastra di 24 pozze. Per ogni linea o controllo tumorale, utilizzare campioni triplicati. Evitare le bolle tra l'inserto e il mezzo condizionato. Bolle inibirà macrofagi di migrazione ai pozzi di fondo.
   4. Incubare le piastre in un'incubatrice di 37 gradi centigradi con il 5% di CO₂ per 4 h.
      NOT: Il tempo di incubazione può essere regolato. Le cellule che migrano nelle camere inferiori possono essere viste al microscopio.
   5. Toccare delicatamente l'inserto sulla parete interna dello stesso pozzo e scartare l'inserto. Poiché le cellule MV-4-11 crescono in sospensione, la soluzione di distacco cellulare o il trattamento con la trypsin non è necessaria qui.
   6. Pipette pipette delicatamente le cellule nei pozzi su e giù 3 volte per mescolare. Trasferire 225 litri di sospensione cellulare su una piastra a parete nera 96 piani adatta per la misurazione fluorescente.
   7. Diluire il tinrito CyQuant 1:75 con tampone di lisi 4x. Vortice brevemente e girare verso il basso la soluzione. Aggiungete 75 l di soluzione ad ogni pozzetto della piastra di 96 pozze. Incubare 15 min a temperatura ambiente.
   8. Leggere la fluorescenza utilizzando il set di filtri 480/520 nm con un lettore di lastre di fluorescenza.
   9. Analizzare i dati sottraendo lo spazio vuoto e normalizzandosi alla linea cellulare del tumore di controllo.

I risultati sono di solito mostrati tramite grafici a barre (esempio mostrato Figura 1). I campioni con valori elevati di 480/520 indicano che il supporto condizionato ha un'elevata capacità di reclutare macrofagi. A seconda delle esigenze sperimentali, possono essere inclusi controlli aggiuntivi. Ad esempio, si possono usare anticorpi neutralizzanti per trattare i media condizionati per abolire il macrofalo chemiotassi, ed eseguire lo stesso saggio. Si possono anche aggiungere chemiochine extra (cioè CCL2) ai supporti condizionati, che funge da controllo positivo.

Figura 1: i supporti condizionati dalle cellule U87 co-esprimenti EGFR ed EGFRvIII attirano più macrofagi rispetto alle cellule U87 che esprimono un vettore di controllo, o EGFR/EGFRvIII in modo minore. Questa cifra è stata modificata da An, et al.⁷. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

In questo protocollo, ci sono diversi passaggi chiave: 1) selezione dell'inserto Transwell. Per la linea cellulare MV-4-11, 5 inserti Transwell m funzionano bene. Tuttavia, per altre linee cellulari come la linea cellulare monocito comunemente usata THP-1, una dimensione diversa dei pori potrebbe funzionare meglio. 2) Man mano che linee cellulari diverse crescono a velocità diverse, è importante regolare il volume dei supporti condizionati in base ai numeri di cellulare. A tale scopo, i supporti privi di cellule incubati nelle stesse condizioni sperimentali possono essere utilizzati per diluire i supporti condizionati. 3) FBS contiene citochine. È importante utilizzare le cellule MV-4-11 MV-4-11 senza siero nella camera superiore. Se fBS viene utilizzato qui, a volte la migrazione delle celle non può essere osservata.

I ricercatori possono modificare questo saggio per diverse applicazioni. Ad esempio, altre cellule tumorali, sia primaria coltura di xenotrapianto derivato dal paziente, o cellule del topo possono sostituire la linea cellulare del tumore cerebrale utilizzata nell'esempio sopra citato. La linea cellulare dei macrofagi può essere sostituita da macrofagi primari o monociti da pazienti o topi a seconda delle esigenze specifiche. Un punto importante è che i ricercatori devono selezionare le cellule della stessa specie per garantire il miglior risultato. Anche se la via chemiotassiva macrofago è altamente conservata, la variazione della sequenza proteica della struttura tra diverse specie può aggiungere strati di complicanza per interpretare i risultati sperimentali.

I TAM stanno attirando sempre più attenzione nell'immunologia del cancro^13,14. Come i diversi cambiamenti genetici nei tumori influenzano il reclutamento di TAM e altre cellule immunitarie nel microambiente tumorale attende ancora ulteriori studi. Modificando le dimensioni dei pori degli inserti Transwell, questo saggio può essere utilizzato per studiare l'interazione tra tumore e altre cellule immunitarie come le cellule T e le cellule NK. Uno dei vantaggi dell'utilizzo del saggio Transwell per valutare l'interazione tumora-immune è che è facile dimostrare come specifici oncogeni/mutazioni influenzino il reclutamento di un certo tipo di cellule immunitarie. Inoltre, questo saggio è facile da scalare per schermi a livello di genoma. Questo saggio apre ulteriori possibilità per i ricercatori di studiare le interazioni tra cellule tumorali e immunitarie. Inoltre, questo saggio può essere utilizzato per studiare come i supporti condizionati dalle cellule tumorali influenzano il profilo di trascrizione dei macrofagi/altre cellule immunitarie.

Tutti i saggi hanno i loro limiti. Per questo saggio, il mezzo condizionato proviene da cellule tumorali coltivate in vitro. Le chemiochine secrete qui potrebbero essere diverse da quelle secrete da tumori cresciuti in vivo. Inoltre, la linea cellulare dei macrofagi è diversa dall'infiltrazione tumorale dei macrofagi, che sono più fenotipicamente e transcrimente diversi. Pertanto, è necessaria un'ulteriore conferma dei risultati in vitro utilizzando altri metodi in vitro e in vivo.

William A. Weiss è co-fondatore di StemSynergy Therapeutics. Non c'è niente da rivelare.

Grant Support: Un ha ricevuto il sostegno di Alex's Lemonade Stand Foundation, American Brain Tumor Association, NIH T32CA108462 e Program for Breakthrough Biomedical Research, che è parzialmente finanziato dalla Sandler Foundation. W. Weiss è stato supportato da sovvenzioni NIH R01CA221969, R01NS091620, P50CA097257, U01CA217864, P30CA82103; la Samuel G. Waxman Cancer Research Foundation; e la sedia Evelyn e Mattie Anderson.