肝のパーティションを関連付けると段階的な肝切除 (ALPPS) プロシージャの門脈結紮ラットモデル

段階的肝切除のため肝臓パーティションの関連付けと門脈結紮を使用して急速な肝肥大を誘発する境界線切除可能肝腫瘍の切除のため (ALPPS) が提案されています。このモデルは、急激な肥大に関与するメカニズムの解明が、再生の高速化、促進または薬剤のテストを可能に。

最近の臨床データは、プライマリおよび転移性の肝腫瘍に積極的な外科的アプローチをサポートします。大腸癌肝転移のようないくつかの兆候の大きな切除または多発性肝腫瘍の主な制限要因となっている肝切除後肝組織の量が後ろに残って。ポスト肝切除術の重篤な合併症を避けるために必要な機能組織の最小限な肝不全、高い罹患率と死亡率を持っています。肝切除の前に将来の残成長を誘導するより定着して肝臓手術、インターベンション放射線科医によって門脈塞栓術の形でまたは門脈結紮切除術の前に数週間の形で。最近、肝再生より広範かつ急速に、最初の段階ではし、1 週間だけ待っている、第 2 ステージ (肝臓パーティションを関連付けることで切除後の門脈結紮に実質の断裂が追加されることが示されました。段階的肝切除のため門脈結紮 = ALPPS)。ALPPS は急速に人気となって、世界中が、その高周術期死亡率を批判されています。この手順による迅速かつ広範な成長のメカニズムはよくわからなかった。動物モデルは、ALPPS 加速肝再生の生理学的および分子メカニズムを探索する開発されています。このプロトコルは、加速再生の機構の探査ができるラット モデルを示します。

肝臓の残りのサイズは、肝腫瘍の切除を制限します。¹一般的なとき未満 25% 肝組織の背後に残っている、患者 (「小さすぎるサイズ症候群」) 全体の有機体の代謝機能の不足のため急性肝不全から死リスク増加になります。²このポスト肝肝不全は、肝切除後最も壊滅的な合併症。そのため臨床医は門脈の流れを操作することによって肝切除術前に肝再生を誘導するために試してみました。³門脈を閉塞すると、一度門脈血流の残りの部分は遅い速度で成長を開始し、それにより 60% までサイズを増やすことができますがわかった。⁴外科的結紮⁵またはインターベンショナル門脈閉塞が両方とも臨床的に確立されています。⁴ボリュームや肝臓の機能の増加、信頼性ですが肝部分切除後の残肝の成長に比べて肝臓ポータル閉塞がのみ約 5 分の 1 した後の成長率。⁶

成長する肝臓に必要な時間は数ヶ月に数週間肝臓を切除後、はるかに速い速度で再生成できます。このように、肝臓はそれの部分を除去した後正常に戻る育つ唯一の器官です。⁷同じようなペースで肝再生を誘導する部分的な hepactectomy が開発された後外科医のグループによって人は、閉塞間の離断を追加することを発見したし、非閉塞部肝臓肝臓を誘導する新規プロシージャ肝切除後、切除前と同じ成長速度で肥大します。⁹手順開始一週間以内の大規模な主に切除、肝腫瘍の切除を可能にする、将来的に肝週残内 80% の急速な肥大します。プロシージャを呼び出した「段階的肝切除ための関連付け肝臓パーティションおよび門脈結紮 = ALPPS」、世界中で急速に人気となった。¹⁰複数のレポートは、¹¹複雑な手術もその高い合併症率批判された一方、新技術により境界線切除可能肝腫瘍の手術適応の拡大をサポートしました。^12,13

2012 年より組織学的特性とメカニズムの理解を許可して薬の効果をテストする ALPPS の出版物以来、齧歯動物の開発、またゆっくりと急激な肥大の大動物モデルが試みられました、動物肝組織の異なる成長率。開発最初の動物モデルは、ラットのモデルだった。このモデルでは、右と中央の葉の左の部分の間の実質の断裂後の急激な肥大は右中央の葉の再生を加速しました。¹⁴別のモデルはマウスに後で導入されました。このモデルでは左葉外側切除し、肝左の中央葉以外のすべての葉の門脈枝が結ばれました。¹⁵一方で、豚の ALPPS の大動物モデル記載されているも.¹⁶

流量の変化と門脈血流、肝組織の酸素圧力のような生理学的メカニズムの研究、ラット モデルはマウスにおける ALPPS のモデルより優れています。マウスのモデルをラットのもう一つの利点は、ラットのモデルは左葉外側と ALPPS の肝切除術の効果を汚染することがあります¹⁵の切除の必要がないことです。ラットのモデルは対照的に肝臓を減らさない細胞塊。豚モデル成長葉として右後葉を使用しますが、豚肝臓、高い葉状。したがって、右後部と右前頭葉の間既に薄い組織橋で切除平面を作成することは困難です。対照的に、個別に各ポータル静脈によって提供される 2 つの部分から成っているラットの中葉と顕微鏡技術を使って 2 つの実質の断裂面を簡単に作成することができます。小さな動物のコンピューター断層撮影 (CT) および/または磁石共鳴画像 (MRI) の空室状況により追加切除と門脈結紮門脈結紮だけで体積の成長の非常に正確な定量化が重要であります。任意の急速な肝肥大モデルの検証。

ここに示すプロトコルを記述する手技と体積の検証および門脈結紮とを離断、門脈結紮後ゆっくりと急激な肥大のモデルの生理学的特性に使用するプロシージャそれぞれ、ラット。

このプロトコルのすべての実験は、チューリッヒ、スイス連邦共和国のカントンの獣医当局によって承認された (番号 60/2014)。さらに、実験の手順をすべて行った動物実験に関するガイドライン」を遵守してスイス アカデミーの医療科学 (SAM) とガイドラインの連合の欧州研究所動物科学協会 (FELASA).

1. 畜産、手術室設備・機器、麻酔

1. 12/12 時間の明暗サイクルに換気ケージ病原体フリーの標準的な条件下でのラット 250-300 グラムの重量をしてください。食料と水は常温 22 ± 動物無料アクセスを与える 1 ° C
2. 30 5 vol % とイソフルランをフラッシュする場所ボックスで麻酔作用 s (図 1 a)、動物は深い麻酔下まで 3 vol % のイソフルラン麻酔濃度が続きます。つま先ピンチ反射によって麻酔のレベルを確認します。
3. 皮下を使用して鎮痛が続いて 0.02 mg/kg 12 時間間隔 48 時間術後の段階では、外科的介入時にブプレノルフィン (0.01 mg/kg) を適用を提供します。
4. 彼らが自発的に呼吸 1.0 2.5 集 % イソフルランの酸素の混合ガスにさらされる作業場所に動物を転送 (流れ: 600 mL/分)。
5. 動物の目を閉じて、目を保護するために、軟膏を使用します。5 mL の生理食塩水を皮下注入、腹部の両側にそれの半分に 0.1 mg アトロピンによって続いた。
6. 手術室で手術顕微鏡を使用して手術を行います。
7. ラットの鼻をプッシュするラテックス膜 (図 1 b) から成る換気マスクを使用して揮発性麻酔下で動物を飼います。テープ (図 1 b) と四肢を修正します。
8. サイド テーブルの滅菌方法で手術器具のレイアウト: 腹壁と剣、はさみ、アドソンの撤回のための 3-0 縫合糸だけでなく、生理食塩水に Betadine を浸したスポンジ (図 2 a) 腹部壁のリトラクター (図 2 b)鉗子、罰金のヒント microforceps のストレート湾曲し、結紮プロシージャ (図 2) の 6-0 シルク ネクタイをカット済み。
9. 肝実質の断裂に非付着バイポーラ microforceps を使用します。腹壁と SH 1 針と 5-0 Maxon (図 2 D) 3-0 シルク縫合糸を使って皮膚を閉じます。止血バイポーラ鉗子を使用します。

2. 手術の開始

1. 正中線の外側を 2 cm エリアで性器に、剣から小動物の毛のクリッパーの動物の腹部を剃る。徹底的に髪を削除します。
2. Betadine 浸したスポンジで 3 回この地域を消毒します。
3. 肌にメスを用いた正中切開を行い、手術用のはさみを使用して腹部を開きます。
4. 右と左の腹壁と縫合糸 3-0 シルク (図 3 a) で剣を撤回します。
5. 胃・大腸・小腸自作小さいワイヤー リトラクター (図 3 b) によるラットの肝十二指腸間膜からを撤回します。

3. 門脈結紮 (PVL)

1. 胃および小腸 (図 3 b) の横方向の収縮によって門脈分枝にアクセスします。
2. にべもなく、microforceps と腹膜を拾い、ゆっくりと内側に剥離によって門脈を解剖します。
3. 次の順序で (図 3) を門脈枝を分析: (1) 右後枝、(2) 横方向と左中央支店を一緒に、左と (3) 尾状葉枝。
   1. 最初に、腹膜の取材で直接実行される肝葉に小さな動脈枝を引き裂くことを避けるために小さい、ないあまりにも精力的な動きで腹膜をはがします。
   2. 門脈は裸、遅い前方を押しながら枝を取り囲む、拡散運動し、プル 6-0 シルクの 1 cm 作品それぞれの門脈枝のまわりで結ぶし、それを縛る。
4. 右後頭葉枝を縛る。(図 3)右後枝の技術的な難しさは、右後頭葉動脈は右後方の門脈枝にまたがって実行されてという事実で成っています。
   1. 曲線 microforceps 門脈右枝を公開する腹膜と一緒に頭側動脈を引き出します。
   2. 前のカットで右後頭葉支店 6-0 シルク ネクタイを縛る。右後葉は目に見えて青ざめてポータル静脈を結紮後。
   3. 旋回中の抵抗に対して推進を避けるため、動脈や門脈をテアリングを防ぐため。出血の場合滅菌綿棒で少なくとも 1 分間圧力を適用し、次に見直します。出血が停止しない場合は、動物を犠牲します。
5. (私の人生の愛) (LLL) 横方向の左と左の中央葉を縛る枝。これらの枝は、1 つの一般的なトランクを持っています。(図 3)。左の中央葉支店は、LLL の実質内門脈から発生します。
   1. カット済み 6-0 シルク ネクタイを使用して私のライフ支店 LLL 両方と愛につながる門脈を縛る。
   2. LLL につながる動脈に損傷を避けるため、腹膜の層内で実行している私の人生を愛する。腹膜慎重に戻って皮をむき、限り、彼らはそのまま滞在します。私の人生に目に見えて LLL と愛薄い枝を結紮後。
6. 尾状葉枝 (図 3) を縛る。ラットにおける別の尾状葉をややにつながる門脈脱ぐ、門脈から遠位方向と内側右葉枝の主要な門脈からの離陸 (厳密に下方にない人間や大きな動物のように)。
   1. それを分析し、腹膜と胆管、門脈から動脈を持ち上げて、それを取り囲みます。
   2. 横方向から来る曲線 microforceps と尾状葉の門脈枝を取り囲みます。尾状突起が二つ目に見えて青く尾状葉枝は 6-0 絹糸を結紮後。
7. 右と左の中央葉の間明確な分界線によって表示される右手正中葉 (RML) の排他的な門脈血流につながるこれらの 3 つの門脈の枝を結ぶこと。

4. 門脈結紮離断 (PVL + T) と

1. RML 間の分界のラインに沿って切除を行い、PVL (図 3 D) 後の人生が大好き。
2. Precauterize 肝組織の分界線に沿って 1 mm 熱傷ストリップを作成するのに非常に細かい脳神経外科先端非付着バイポーラ銀鉗子を使用します。
3. 慎重に precauterized 組織を切断するのにハサミを使用します。かなり、断裂の深さを適切に評価することは困難です。目標は、ラットの intrahepatically を実行する、可能な限り上大静脈に近くなることです。下大静脈の損傷は、することができます通常、停止しては広範な出血を伴うです。
4. 傷害の場合、綿棒を使用して穏やかな圧力を適用が 3-4 分以内で出血が停止しない場合犠牲動物。縫合糸を使用して上大静脈を修復の試み一般に成功していません。ラットは、空気栓塞を機会に発生し、心停止につながる可能性がありますに非常に敏感です。

5. 術中門脈圧と流量の

1. 圧モニター (図 4 a) に接続されている G30 針で直接穿刺して門脈圧を評価します。
2. 2 mm のボリューム フロー プローブが横方向に配置使用はポータル流量以上 2 分 (図 4 b) の直接計測フロー デバイスに接続。安定した測定品質マシンのディスプレイに示されているレコード データのみ。
3. すなわち3 つの門脈枝またはオフに 3 つの門脈枝を結ぶと実質の断裂を実行するオフを結ぶそれぞれのプロシージャを定義するステップのグループの後、門脈血流量と圧力を別々 に評価します。RML と愛私の人生。

6. 最後の外科の手順

1. 閉じる前に腹腔内で小腸が正しく配置されていることを確認します。
2. SH 1 針で腹膜と腹壁縫合糸 3-0 シルクを閉じます。
3. 最後にマクソン 5-0 を使用して皮膚を縫合します。
4. もう一度お肌を消毒します。
5. 再度適用生理食塩水 5 mL 皮下皮下組織の横に、腹部に。

7 小さな動物の CT を用いたラット肝超高速

1. 最初の ct の前に 24 h は、G26 静脈内カテーテルを尾静脈に造影剤の 200 μ L を挿入します。
2. マイクロ CT を使用すると、ラットをスキャンします。全身麻酔を誘導するためにプレキシ グラス箱に動物を配置 (30 5 vol % で最初フラッシュ s、動物は麻酔下で、配管システムを介してスキャンを通してそれを維持するまで 2-3 vol % のイソフルラン麻酔濃度が続く)。最適な画像品質のためには、動物の呼吸と CT スキャンを同期します。
3. デジタル画像と通信医学 (DICOM) ファイルをエクスポートし、イメージング プラットフォーム OsiriX 8.0 パブリック ドメインを使用して分析します。肝臓でナノ粒子のコントラストの radiodensitiy に基づく葉罫線 (Schaddeらの図 2 aを参照してください部分的な肝の体積を計算する利益 (率 ROI) メニューの地域を使用して"閉じた多角形「ツールを使用します。¹⁷)
4. 標準モデルで 3 日間を成長し、ボリュームの増加を評価するために CT スキャンを得る毎日肝臓を許可します。

2 つの異なる手術門脈結紮 (PVL) と明らかに異なる成長カイネティクスの断裂 (PVL + T) 結果に PVL。PVL PVL + T ではるかに大きい中央右葉 (RML) ができるに対し、3 日以内の適度なボリュームの増加を誘導する (図 5) を見た。これは、毎日の超高速で検証できます。それは PVL + t.¹⁷でトリプル中に PVL で 3 日以内、RML の量が約 2 倍します。

門脈内流量測定、PLV とまた PVL + T の減少の流れにもかかわらず、安定した流れを明らかにする (Schaddeらの図 3 aを参照してください。¹⁷). 全体の門脈血流量が原因となり、「ポータル hyperflow"以前の肝実質の約 26% を介して行われることが示唆されました。

門脈内の圧力測定は 9 mmHg PVL と PVL + T (Schaddeらの図 3 bを参照してくださいに 5 mmHg から平均門脈の圧力の急激な増加を明らかにします。¹⁷). これは、ポータルの hyperflow の結果では可能性が高い。肝組織の量は減少しませんので、急性門脈圧増加、単独での断裂にはされません。¹⁷繰り返し測定表示 24 時間¹⁷の圧力増加が堅調

図 1: 麻酔。(A) 動物の麻酔にイソフルラン (5 vol %) でボックスをフラッシュした後イソフルラン気化 (600 mL 酸素/min です) 全身麻酔の維持のため。(B) 動物は、手術顕微鏡下で滅菌作用面に釘付けになった。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 2: 滅菌装置。(A) 露出と撤回滅菌しっとりスポンジ。(B) 線ミニ トラクター ゴムバンドに接続されています。(C) バイポーラ鉗子、ポッツはさみ;湾曲した microforceps、ストレートの microdissectors は、門脈枝の解剖に使用されます。(D) 大きいはさみ、ニードル ホルダー、針は、開閉に使用されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 3: 郭清。(A) 腹部と、剣の側面正中開腹後縫合糸 3-0 シルクで取り消されます。(B) 胃を入れ込んで、小腸大腸ラットおよび肝門部の胃十二指腸靱帯横を公開できます。(C) 門脈結紮 (PVL)、(1) の右の葉に門脈枝の左葉外側 (2) と (3) の尾状葉が 6-0 シルク ネクタイ (左) と組み合わされています。PVL を離断 (PVL + T)、さらに、(私の人生) 右中葉 (RML) と左中央葉の間虚血性境界線 transected (右)。(D) 私の人生と RML (左)、写真は愛間明確な分界線を示しています。この行はバイポーラ microforceps を用いた PVL + T (右) 断裂の後が続きます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 4: 術中門脈圧と流量の。(A) 中、針圧力トランスデューサーが露出した門脈に挿入されます。(B)、2 mm ボリューム フロー プローブを使用して、主要な門脈内のボリュームのフローを測定します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 5: 肝臓超高速。PVL だけ後より PVL + T 後のサイズでより肝が増加。毎日超高速デジタル画像と通信医学 (DICOM) ファイル ラット マイクロ CT スキャナーで得られたし、プラットフォームをイメージング パブリック ドメインを使用しての実行を示します。違いは軸画像上明らかなのですが、定量的超高速前レポート¹⁷の実行を示しています成長カイネティクスに差。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

このプロトコルは ALPPS の動物モデルの PVL + T、約 2 倍の PVL 単独と比較して 3 日以内のボリュームの増加による、急激な肥大を呈する。¹⁷で図 1に示すように、中間の肝はその左側と右側に 2 つの独立したポータルの静脈によって提供される 1 つの連続した実質の質量ので右中肝、肝成長モデル葉として使用は最近、公開された作品。¹⁷は、他のレポートと比較して、モデルはいくつかの利点を提供しています。解剖学的, 中葉の最高の選択は、断裂とそれにより担保の流れの閉塞をことができます 1 つの連続した実質の質量として人間の肝臓を表します。左中央葉の門脈枝の分岐 (私の人生を愛する) 私の人生と LLL の愛の結合された結紮の左葉外側 (LLL) 内できます。

様々 なラットがあった、1 つのマウス ALPPS モデル開発し、説明。¹⁸多くのラットのモデル^19,20と説明だけマウス モデル¹⁵肝量の減少が必要です。質量削減引き金となるかもしれません拡張肥大独立。これは私たちの¹⁷と同様のラットのモデルとは対照的です。^14,21,22,23マウスモデルの利点では、遺伝子改変動物の使用可能性があります。またこれらの小さな動物モデルに豚モデルが開発されて、¹⁶人間のように似たような手術手技を用いて、同じような成長率の結果します。これおそらく最も密接に似ている人間の手術にもかかわらず、小動物モデルは彼らはより速く、非常に重要なことがあります、実行、グループの動物の大きい数を許可し易いより少なく高価します。

生理的には、ラット モデル マウス モデルよりも簡単に血流、担保と酸素化の研究ができます。本研究は肝臓、すなわち仙骨での体積変化を評価する人間で臨床的に使用される同じ方法を使用して初めてです。いくつか他の研究、制御グループ (例えばALPPS²⁴の豚モデルで) を含めるを行うまだ ALPPS 成長カイネティクスを想定すると対照をなして肥大を PVL + T と PVL を比較することによって検証されます。PVL の下、RML は、3 日以内に倍増、PVL + T は肥大を大幅増加します。追加切除の 3 日後肥大のこの加速度映す PVE との最初の大規模な ALLPS レジストリ レポート 10 日後 ALPPS の 86% の増加のため大規模なメタアナリシスでチケットを報告されている 46% ボリュームの増加、人間の条件202 患者。²⁵ラット プロシージャ PVL + T と人間 ALPPS は肥大の 2 つの手順の種類、それぞれのタイム フレームで達成の量を倍増します。

このプロトコルの中で重要なステップは、門脈枝の解剖 PVL、PVL + t. の中央葉の切除門脈枝の解剖時に全体の肝十二指腸間膜を覆う腹膜の薄層を妨害する抵抗に対して商品をプッシュしていないことが重要です。門脈の偶発的な破損は、回復不能に可能性があります、動物の犠牲が必要綿棒だけを使用して圧力によって停止する可能性があります。一般に、それ強調されなければならない、研究結果と不必要な動物の苦しみの原因する恐れがありますので動物動物の血液量の推定 10% 以上の血液の損失に苦しんで、研究から除外すること。

中央の葉の切除は、罰金銀バイポーラ鉗子と十分な生理食塩水を滴下、はさみを用いた焼灼組織の簡単な加工が続くを用いた肝組織の焼灼を慎重に実現できます。切除の大量出血や下大静脈に空気塞栓症を避けるための齧歯動物では肝臓の内部に通じる上大静脈を発生する前に停止するべきであります。肺循環への空気のエントリは、ラットでの突然の心停止に します。

動物のための生理学的ストレスの増加につながるすべての変更を含めることができますこのプロトコルのトラブルシューティング出血量, あまりにも長い手術時間の増加による過鎮静、低体温、低血圧など。このプロトコルはマウスのような他の齧歯動物種も変更可能性があります。私たちは正常にこのプロトコルを c57bl/6 マウス (データは示されていない) で説明する手法を行った

このプロトコルの制限は遅い肥大; 対高速機構を研究するこの議定書の排他的使用です。したがって"ALPPS"手順、肥大した肝臓を除くすべての deportalized 肝組織の切除の第二段階は、このプロトコルに記述がないです。この切除しかし簡単に実現できます次の縫合結紮し、はさみを使用して肝葉の除去を使用して、齧歯動物の肝切除術の手技。

全体的にみて、この現在のモデルは、急速な肝肥大のメカニズムの解明と薬と介入のテスト実験をことができます。このモデルを使用して、最近ことも示された急速な低酸素シグナルによるプロリン水酸化酵素阻害剤、自分のプレーをシグナリング、酸素欠乏を示唆で重要な役割を持つ、RML の肥大を組み合わせて門脈結紮に誘導もことができる、肝の成長カイネティクスの変調。プロリン水酸化酵素阻害剤は肝再生を速める可能性があるし、さらにする必要がありますのような薬をテストしました。^17,26従来および新規の化学療法のエージェントの役割をテストすることがあり、肝再生の高速化への影響が解明、今後のアプリケーションはこのモデルの可能性があります。モデルはまた、またはを使用してたとえばインドシアニン グリーン (ICG) 肝胆イミノジ酸 (飛騨) シンチ ラットの文脈に置くことを最終的にゆっくりと急激な体積変化を持っているので肝機能を勉強する機会を提供しています肝機能から肝機能の再生肝ボリュームよりも重要です。^27,28後ろ向きコホート研究でのみテストされてこれまでのところ ICG²⁹と飛騨シンチグラフィー^30,31 ALPPS 患者の評価が、これらはまだ質問に答えるための非常に重要なツールがあります。ボリュームまたは関数が変更されたかどうか、類似または急速な肝再生における異種です。

要約すると、高速と低速の肝再生再生肝臓外科領域における今後の研究ができるのも特徴と標準化されたモデルを提案する.

著者が明らかに何もありません。

著者の謝辞があります。