ウランの酸化銅ナノ粒子による微量元素の除去

Production bleed water (PBW) was treated with cupric oxide nanoparticles (CuO-NPs) and cellular toxicity was assessed in cultured human cells. The goal of this protocol was to integrate the native environmental sample into a cell culture format assessing the changes in toxicity due to CuO-NP treatment.

その場で回収 （ISR） では 、米国におけるウラン抽出の主な方法です。 ISRの間に、ウランが鉱体から浸出され、イオン交換により抽出しました。得られた生産ブリード水（PBW）は、ヒ素や他の重金属などの汚染物質が含まれています。アクティブISRウラン施設からPBWのサンプルを第二銅酸化物ナノ粒子（CuOを、NPS）で処理しました。 PBWのCuOを-NP処置はヒ素、セレン、ウラン、バナジウムを含む、優先汚染物質を減少させました。 PBWは、細胞増殖培地の液成分として使用し、生存率の変化はMTT（3-（4,5-ジメチルチアゾール-2-イル）-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド）によって決定された処理された未処理及びCuO-NPアッセイヒト胎児腎臓（HEK 293）およびヒト肝細胞癌（Hep細胞のG2）細胞です。のCuO-NP処理が改善されたHEKおよびHEP細胞生存率と関連していました。この方法の制限は、増殖培地成分によって、およびオスモル中PBWの希釈を含みますality調整だけでなく、必要に応じてpH調整。この方法は、希釈による効果とが伝統的にわずかに酸性であるPBWのpHの変化へのより広い文脈に限定されています。この方法は、より中立的な海域でのCuO-NPの治療を評価する広範な用途を持つことができます。

米国電気供給の約20％は核エネルギーによって提供され、エネルギーの独立性を高めるために国のインセンティブに基づいている、米国の原子力容量が¹増加すると予想されます。核エネルギーの世界的な成長は、米国外で発生した²成長の大部分で、継続することが予想されます。 2013年の時点で、米国のウランの83％は輸入されたが、埋蔵量の952544トン、米国^3,4内に存在します。 2013年7新しい施設アプリケーションとワイオミング州、ニューメキシコ州、ネブラスカ⁵との間の14の再起動/拡張アプリケーションがありました。米国では、ウランは主に、その場の回復に （ISR）を介して抽出された^6を処理します。 ISRは、より少ない土地の破壊を引き起こし、環境汚染物質^7を解放することができテーリング杭の作成 ​​が回避されます。 ISRは、ウランを介して浸出液から抽出された後、地下の鉱体からウランを浸出する水ベー​​スの酸化·ソリューションを使用していますイオン交換法^8。鉱体における負の水分バランスを維持するために、生産ブリード水（PBW）と呼ばれる浸出水の一部は、抜き取られます。 PBWの部分は、逆浸透（RO）を使用して、汚染除去およびマイニングプロセスに再導入されたが、毒性汚染物質が表面のための状態の規制機関によって決定される許容可能なレベルまで低減することができればPBWはまた、有益な工業または農業用途を有することができるし、地下水^9。現在、ほとんどのISRウラン施設はPBWから汚染物質を除去するためにROを使用しています。しかし、RO処理は、エネルギー集約的であり、調整された処分を必要とする有害廃棄物の食塩水を生成します。

多くの水の浄化方法は吸着剤、膜およびイオン交換を含む、存在します。これらのうち、吸着は、最も一般的に使用され、ナノ粒子合成における最近の発展は、吸着剤ベースの水の汚染除去の機能^10の処理を強化しました。銅オキシ以前に広くウランISR PBWに研究されていなかったデ·ナノ粒子（CuOを-NPS）が、地下水からの汚染物除去の最近の研究では、CuOを-のNPは、前または後の水処理工程を必要としないなどのユニークな特性を、（持っていることが判明しました例えば 、pHまたは酸化還元電位）を調整し、異なるpH、塩濃度、または競合イオン^）11において、 例えば、（異なる水組成物でよく行います。また、CuOを、NPを、容易に再生のCuO-NPは再利用することができ、その後、水酸化ナトリウム（NaOH）を用いて浸出することにより再生されます。天然水からのCuO-NP微量金属フィルタリング機能の詳細は、先に^11-14を公開されています。

水処理のために有用であるが、金属酸化物ナノ粒子は、生物に対して毒性であり得るが、毒性の程度は、ナノ粒子の特性および成分^10,15,16に部分的に依存します。したがって、simultを勉強することが重要ですフィールドアプリケーション前aneous汚染物質除去とナノ粒子の毒性。現在の研究では（ヒ素、セレン、バナジウム及びウランを含む）PBW優先汚染物質を除去するためのCuO-NPの能力を決定し、PBW細胞毒性でのCuO-NPの治療の効果を評価しました。

PBWは、アクティブなISRウラン施設から収集し、優先度の汚染物質の除去にCuOを-NPの治療の有効性を決定するために利用されました。のCuO-NPの治療前後PBW細胞毒性も評価しました。 PBWは、複雑な地質（環境/産業用）の混合物であり、有害物質のための環境健康科学（NIEHS）と機関の研究所＆疾病登録（ASTDR）の両方が混合物を含め、環境に関連する混合物の毒性の研究に重点を置いています彼らは自然や産業環境に存在し、ならびにin vivoでのさらなる試験のための化学物質の優先順位を決定するためにin vitro試験で推進として^17-19。低用量混合物への慢性暴露は、少なくともではない、ほとんどの実験室での研究の短い時間枠内で、明らかな効果を生じないため、慢性の研究は、低用量の混合物のエクスポージャーは、困難です。同様に、化学物質の混合物のインビトロ試験でほとんどが2以上の金属^20,21の定義されたラボ製の混合物に細胞を公開します。これらの研究は、ベースライン情報を提供するが、簡略化された混合物は、混合物成分の全範囲が存在しているネイティブ、環境試料、で発生する可能性があり、複雑な拮抗との相乗的相互作用を複製しません。

本研究の目的は、PBWの代替汚染物除去プロセスを調べるために、培養ヒト細胞を用いた細胞毒性にPBW（のCuO-NP）の治療の効果を評価することでした。結果は、汚染物質を除去するための、より効率的で環境に優しい方法の開発を通じてウラン産業の利益を得ることができます。本研究では、提供します最初の証拠のCuO-NPSがPBWの重点汚染物質の削減は、哺乳動物細胞²²に細胞毒性を減少させます。

すべてのサンプルは、ワイオミング州のウランISR施設のウラン液処理建屋で収集しました。

1.生産ブリード水（PBW）

1. ISRウラン施設から水サンプルの2種類を収集：PBWと浸透（RO）水を逆にします。イオン交換処理後の監視タップからではなく、逆浸透除染の前にPBWを収集します。 PBWは、逆浸透処理によって除染された後、ROのサンプルを収集します。
   注：浸出剤は、それがカラムに回収し、イオン交換のために準備されたウランの液処理建物に複数のウェルのフィールドのパイプラインで輸送されます。イオン交換後の浸出剤の約1~3％が回路から除去され、生産ブリード水（PBW）と呼ばれます。 PBWマイニングプロセスで再使用されるか、またはRO濾過して脱塩/除染されます。
2. 高密度ポリエチレンゼロヘッドスペースと（HDPE）ボトル応じに水サンプルを収集環境品質のワイオミング州省^{（WYDEQ）23}のサンプル収集と分析のための標準的な操作手順に。
3. クールなそれらを保つためにオンサイト氷上および輸送試料温度およびpHを測定します。
4. 4℃で保存PBW。以下のプロトコルに指示されるように、メディアの準備中に添加される濃縮されたイーグル最小必須培地（EMEM-10X）後までクールPBWソリューションをしてください。
   注：PBWがフリーズすることができたり、室温に加温した場合に析出する酸化ソリューションです。希釈した後PBW溶液が十分に加熱されたとき、それが細胞に、インキュベーション中にアプリケーションの前に37℃に沈殿しないことを希薄です。

のCuOナノ粒子の調製（CuOを-NPS）

1. 0.2 MのCuCl _{2•2H 2} O 250mlの0.4 Mの水酸化ナトリウム（NaOH）、及び5gのポリエチレングリコール（P 250 mlを含有する純粋なエタノール溶液を合わせ6ミリメートルホウケイ酸ガラス球を備えた丸底フラスコ中のEG）。
2. 修正された電子レンジで溶液を配置し、それが20％の電力（上の6秒間隔、24秒オフ）で10分間、大気圧で還流下で反応させます。
3. ガラス球を残し、その後50mlコニカルチューブにデカントし、室温（20℃）に溶液を冷却します。
4. 遠心分離機デカント30分間、1,000×gで50ミリリットルコニカルチューブ内の溶液、その後は300ミリリットルの熱水（60〜65℃）、エタノール100mlの配列とのCuO-のNPを洗浄し、アセトン100ml。
5. 50mlコニカルチューブ中で室温（20℃）でのCuOを-NPを乾燥させます。
6. 乳鉢に、そのチューブのうちのCuO-NPをこすり。スズ箔でのCuO-のNPをカバーし、残りの液体を除去するためにオーブンで110℃までのCuO-NPを加熱します。 1バッチにCuOを-のNPを組み合わせ及びCuO-NPの重量を量ります。
   注：のCuO-NPの準備とPBWのCuOを-NP処理は水QUALで実施されました生態系の科学と管理、ワイオミング大学の性研究所。のCuO-NP合成はマーティンソンとレディ^（2009）11の手順に従いました。

のCuO-のNPとPBW 3.治療

1. PBW 50mlを、続いて50mlコニカルチューブへのCuO-NPの50mgの（1mg / ml）を加えます。チューブを密封し、250rpmでベンチトップオービタルシェーカーで30分間反応させました。
2. 遠心分離試料管30分間250×gで、その後は、0.45μmのシリンジフィルターを用いて上清を濾過します。遠心分離速度を変化させ、時間のCuO-NPは遠心管中で小型化を保証するために、ナノ粒子に依存することができます。

4.元素分析

1. 次のように元素分析のために未処理（対照）及びCuO-NP処理したPBWのサンプルを準備します。
2. 2.0のpHに微量金属グレードの硝酸でのCuO-NP-処理および未処理PBWのアリコート（40ml）で酸性化します。誘導couplによって陽イオンのための酸性化PBWのアリコートを分析レディ及びロス^（2012）13に記載されるようにプラズマ質量分析（ICP-MS）を編
3. のCuO-NP-処理および未処理PBWのunacidifiedアリコート（20ミリリットル）を準備し、レディとロス^（2012）13に記載されているようにイオンクロマトグラフィー（IC）によりアニオンためunacidifiedアリコートを分析します。
   注：アリコートをララミーWY 82070.は^{13（2012）、IC}とICPMS手順の説明はレディとロスで見つけることができ、農業分析サービスのワイオミング州省で分析しました。

PBWを用いた細胞培養培地の5準備

1. 2コントロール（EMEM-1XとRO +メディア）と8つのPBWテストメディアソリューション生存率研究において（各未処理PBW及びCuO-NP処理されたメディアの4つの濃度）を使用します。次のようにソリューションの概要は以下のとおりです。
   1. EMEM-1X制御のために、L-グルタミンおよび炭酸水素ナトリウムが既に追加でイーグル最小必須培地（EMEM-1X）を購入。ウシ胎児血清（FBSを追加）と製造者の指示に従って、抗生物質。
      NOTE：EMEM-1Xは、細胞増殖のために適切な濃度に希釈し、L-グルタミンおよび重炭酸ナトリウムを含む購入します。 EMEM-1Xは、ウシ胎児血清（FBS）およびペニシリンおよびストレプトマイシンの抗生物質ミックス（50 IU / mlのペニシリンおよび50μg/ mlストレプトマイシン）を追加する必要があります。これは本研究で用いた両方の細胞タイプについて、製造業者の推奨する増殖培地であるため、EMEM-1Xは、制御媒体として使用されます。濃縮EMEM-10Xは、試験溶液を生成するために、施設または未処理またはCuOを-NP処置PBWからRO水で希釈します。濃縮されたEMEM-10X購入したとき、これらはウシ胎児血清（FBS）およびペニシリンおよびストレプトマイシンの抗生物質ミックスに加えて、追加されるように、L-グルタミン、または炭酸水素ナトリウムが含まれていません。
   2. ISR施設から収集RO対照溶液用RO水について。 PBWのテストメディアにのみ100％ROワットを置き換えると同じプロトコルを使用してくださいPBWの代わりにISR施設から小胞体。研究室からの未処理及びCuO-NP処理液の使用ROまたは超純水を希釈します。
   3. 細胞培養培地の成分と混合する前に、4つの試験濃度に未処理のPBWを希釈します。以下の組み合わせで（実験室）からRO未処理PBWを混合することにより、未処理PBWソリューション4つの異なる濃度を準備します。100％（純粋PBW +なしRO水）、75％（PBW + 62.5ミリリットルのRO水187.5ミリリットル）、 50％または25％（PBWのRO水+ 187.5ミリリットルの62.5ミリリットル）（PBWのRO水+ 125ミリリットルの125ミリリットル）。
   4. 細胞培養培地の成分と混合する前に、4つの試験濃度へのCuO-NP処置PBWを希釈します。以下の組み合わせでRO（実験室）を用いたPBW（30分間1 mg / mlのCuOを-NPで前処理）を混合することにより、CuOを-NP処理したPBWソリューション4つの異なる濃度を準備します。100％（純粋CuO- NP処理したPBW +なしRO水）+ 62.5ミリリットルRO水のCuO-NP処理したPBWの75％（187.5ミリリットル）、50％（125のCuO-NP処理したPBW + RO水の125​​ミリリットル）または25％（のCuO-NP処理したPBW + RO水の187.5ミリリットルの62.5ミリリットル）のミリリットル。
2. 100％ROの190ミリリットルと100％、75％、50％以上に濃縮されたEMEM-10Xの25ミリリットルを追加することにより、RO +メディア、未処理PBW +メディア及びCuO-NP処理したPBW +メディア濃度の250ミリリットルを準備ステップ6.1.3と6.1.4で作成された既成の未処理またはCuOを-NP処理したPBW濃度の25％。
3. NaOHまたはHClを用いて7.4に各溶液のpHを調整します。
4. 25ミリリットル（10％）ウシ胎児血清（FBS）、2.5ミリリットルのL-グルタミン、0.55グラムのNaHCO ₃および1.25ミリリットルペン：以下の標準コンポーネントとそれぞれ未処理及びCuO-NP処理したPBWの濃度だけでなく、RO +メディアを補完/連鎖球菌（50 IU / mlのペニシリンおよび50μg/ mlストレプトマイシン）。
5. 未処理PBW +メディアの各濃度の浸透圧を調整し、RO水を追加し、メジャー浸透圧計を使用しては290〜310mOsm / kgのPBW +メディアとRO +メディアのCuO-NPは、処理しました。
6. 使用して各溶液を濾過0.22μmの真空フィルターユニット、および4℃で保存します。
   注：未処理のPBW +メディア濃度56％、44％で、29％及び16.5％及びCuO-NP-で5％の範囲内の最終培地濃度を変化させる、浸透圧を調節するために使用されるRO水の量のわずかな変化に起因し53％、45％、30％および17％でPBW +媒体濃度で処理しました。

6.細胞生存率

注：腎臓および肝臓は、培養ヒト胎児腎臓（HEK293）細胞（HEK）およびヒト肝細胞癌細胞（HepG2）細胞（HEP）の試験方法を採用^24-26、重金属毒性の標的臓器であることを考えます。

1. 2〜3日製造者の指示に従って実験に用いた96ウェルプレートをメッキする前に、HEKとHEP細胞の培養を準備します。
2. 3- [4、5-ジメチルチアゾール-2-イル] -2、5-​​ジフェニルブロミド（MTT）アッセイを用いて細胞生存率を測定します。
   注：MTTアッセイプロトコルはミーから変更されましたrloo ら^{。（2011）27。}
   1. 粉末状でMTTを取得します。 50 mg / mlのストック濃度を補うために、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を追加します。 2時間溶液を撹拌した後、1.5ミリリットル冷凍庫安全チューブに0.45μmのシリンジフィルター、アリコートを使用してフィルタリング。 4℃で光とストアからチューブを保護します。
3. 、トリプシンを使用して培養皿からHEKとHEP細胞を除去し、5分間1,000×gで遠心分離し、トリプシンをデカント。 5mlのPBSを追加し、単一細胞溶液を得るために、細胞を混合します。その後、溶液1ミリリットル当たりの細胞数を得るために、血球計数器に単一細胞溶液20μlを加えます。 5分間1000×gで再び細胞を遠心し、PBSで細胞をリンスするために使用デカント。 500細胞への細胞の濃度を調整するEMEM-1Xの適切な量を追加/ 100μL（100μl/ウェル）。
4. 蒸発を制御するために、200μlのPBSでプレートの周囲の井戸を埋めます。
5. 種子細胞500細胞/ウェル（細胞でメッキされていない）周囲ウェル以外の各ウェルに100μlの添加の密度での。
   注：HEKとHEP細胞のための播種密度は、成長のピークは日4-5の周囲に発生することを可能にする実験的な成長曲線に基づいています。全ての細胞株は、播種密度を推定するための成長曲線を準備します。
6. それらは、細胞密度のベースラインMTTの読み取りを行う前に（プレートの形タイト癒着）を回収することができ、37℃で24時間、細胞をインキュベートします。
7. （周囲を含まない）、最初の列からの播種培地を除去し、1時間、ウェルにMTT（培地中5mg / ml）の100μlを加えることにより、細胞密​​度のベースラインMTT読み取りを実行します。
8. 1時間後、MTTを除去し、生存細胞（20分）によって産生されるMTTホルマザンを溶解するためにジメチルスルホキシド（DMSO）の100μLを加えます。
9. 塩基を得るために570nmでの吸収波長の第1列の光学密度（OD）を読みます。行の読み取り。
   1. すべてのプレートが正しく播種し、細胞がプレートの間に一貫して増加していることを確認するために、ベースラインされた測定値を使用します。次の24時間のインキュベーションの前にテストされているカラムからDMSOを除去。
      注：DMSOをプレートに残っている場合は、一晩、それがメディアボリュームの減少を引き起こし、隣接する列から水分を引きます。
10. 試験溶液を温め（ すなわち 、EMEM-1X、RO、未処理のPBW及びCuO-NP処置PBWメディアソリューション）水浴中で37℃です。
11. メディア、未処理PBW +メディア濃度またはCuOを-NP +（周囲またはベースラインの読み取りに使用された最初の列を含まない）、プレートの残りの部分から播種メディアを取り出して、EMEM-1X100μlで置き換え、RO - 処​​理PBW +メディア濃度（プレート当たり1溶液）。 7日（日2-8）の合計のために彼らの試験濃度や制御ソリューションで細胞をインキュベートします。
    注：総あり10プレート：1 EMEM-1倍、1 RO +メディア、それぞれの未処理PBWの1 +メディア濃度（56％、44％、29％および16.5％）と、それぞれのCuO-NP処理したPBW +メディア濃度（53％、45％の一方のプレート、細胞株あたり1実験あたり30％＆17％）。
12. ベースラインのMTT読み取り、次のそれぞれの日には、それぞれのプレートの次の列から（6.11の下にノートに記載された）対照および試験ソリューションを削除する（ 例えば、2日目試験および対照培地を、ウェルBG行3から削除され、3日目：行を4、ウェルBG 等 ）、上記の手順6.7から6.9に記載されているようにMTTプロトコルを繰り返します。
13. 7日間毎日のプロトコルを繰り返します。各列（6ウェル）のためにOD結果を平均し、7日間の成長曲線を生成するために時間に対して報告しました。
14. のCuO-NP処理したPBW +培地で細胞生存率に対する銅キレート化の効果を評価するには、それぞれのプレートにソリューションを追加する前に、ソリューションを制御し、テストするためにD-ペニシラミンの100μMを追加する以外は、上記と同じ手順に従ってください。データ肛門を行います科学的なグラフ作成ソフトウェアを使用してysis。

7.地球化学モデル

1. 次のWebサイトからのVisual MINTEQバージョン3.0 / 3.1のフリーウェアをダウンロードしてくださいhttp://www2.lwr.kth.se/English/Oursoftware/vminteq/ 。
   注：Visual MINTEQは、金属分化、溶解度平衡、天然水のための収着などの計算のためのフリーウェアの化学平衡モデルです。加えて、イオン分化、イオン活性、イオン錯体及び要素の除去²⁸の可能なメカニズムを調べるために、治療前後の元素の濃度（質量分析の結果）と比較される飽和指数を予測するために使用されます。
2. プログラムに、pHは、アルカリ度と異なる元素の濃度を含む、ステップ4からプログラムと入力質量分析データを開きます。
   注：地下水がその場 urani に中に酸化されていることを考えるとUM抽出プロセスは、入力のためにヒ素、バナジウム、及びウランの酸化種を使用しています。

8.阻害濃度50（IC _50）

1. 最初の3つの別々の実験の5日目の生存率（ODの平均値）を平均化することにより、未処理及びCuO-NP処理したPBW +メディア濃度のIC _50を計算します。
2. EMEM-1Xの5日目の生存率の平均値からの未処理及びCuO-NP処理したPBW +メディア濃度の減算5日目の生存率の平均値は、生存率の差を計算します。そしてEMEMで5日目の平均生存能力による生存率の差を分割し、阻害パーセントを取得するために100を掛けます。
3. 各未処理及びCuO-NP処理したPBW +メディアの集中のための生存率パーセントを取得するには100（EMEM-1Xの生存率）から阻害パーセントを引きます。
4. 1の濃度と100の生存率パーセントでEMEM-1Xを設定することにより、科学的なグラフ作成ソフトに入力。ログにすべての濃度を変換しますスケール（X =ログ（X））と最小二乗適合分析を非線形回帰を行います。

9.データ解析

1. 両側検定、対になった、スチューデントt検定を用いて、未処理及びCuO-NP処理したPBWにおける元素の濃度を比較します。
2. 7日間にわたって収集成長曲線のデータを用いて、曲線（AUC）下の面積を計算し、反復測定分散分析（ANOVA）を用いて分散分析、全ての群の間でTukeyの事後比較に続いた（n = 3）。
3. （上述の）未処理及びCuO-NP処置PBW +メディアソリューションの両方の成長曲線の5日目からのデータを使用してIC _50を計算する。<0.05のP値は有意であると考えています。
   注：統計分析の目的のために、半分検出限界の質量分析値はその制限値²⁹を下回るイオン濃度レベルに割り当てられていました。

未処理及びCuO-NP処理したPBWでPBWの成分濃度、pHを表1に報告されている。マーティンとレディ（2009）は、CuOを-NPのゼロ電荷点が9.4±0.4と推定されていることを報告しました。これらの条件では、PBWのpHは7.2〜7.4であったことを考えると、水がナノ粒子表面が負に帯電した種の吸着を可能に課金させる、のCuO-のNPにプロトンを寄付しています。ヒ素、セレン、ウラン、バナジウム（ 表1）を含むPBWからのCuO-NP治療除去優先汚染物質。平均ヒ素濃度は[0.002 mg / Lで（両側検定対応のあるt検定、P <0.0001）に0.0175から] 87％減少しました。のCuO-NPの治療も著しく低減セレン（30％）、ウラニウム（78％）、バナジウム（92％）、およびリン酸（85％）（p <0.05）。

スペシエーションモデリングの結果、 表2に報告、分析結果をサポートしていますの99％PBWにヒ素を溶解TALはHASO ₄ ^2-とH ₂阿蘇₄として存在している^-とPBWにおける全溶存セレンの94％のSeO ₄ ^2-として存在します。これらの種は、負のCuO-のNPに吸着することができるため、充電されています。分化モデリングものCuO-NPをへの吸着を促進し、PBWにおけるバナジウム種の99％が負に帯電していることを予測しました。しかし、分化モデリングはCuOを-のNPへの吸着を制限する種が負に帯電しているウランの唯一の35.5パーセントを予測しました。飽和指標の分析は、ヒ素、セレン、ウランやバナジウム含有鉱物のない種が飽和近く（ すなわち 、鉱物沈殿）レベル、CuOを-のNPへの支援の吸着、対沈殿しなかったことを予測しました。

優先汚染物質の予想濃度は、未処理及びCuO-NP処理したPBW、希釈していない対照培地のサンプル（EMEM-1X）、56％から作られたメディアであるかどうかを評価するために、未処理のPBW +培地と53％のCuO-NP処置PBW +培地をICP-MSにより分析しました。希釈していないコントロール培地（EMEM-1X）は、L-グルタミンおよび重炭酸ナトリウム（プレ追加）が供給される商用製品です。期待どおりに、細胞増殖に必須であるが、ヒ素、ウラン、バナジウム、 表3に報告、無視できる程度であったため、制御EMEM-1X中の銅とセレン濃度がわずかに上昇した。予備的研究は、ヒ素、セレン及びバナジウム濃度が減少したことを示しましたのCuO-NP処理と減少がCuOを-NP処理したPBW +メディアでの濃度で表現されたこと。のCuO-NP処理したPBW +メディアにおけるウランの測定濃度は、未処理PBWに比べて減少し、この減少は、Visual MINTECのV.3モデリングによって予測されるよりもより顕著でした。予想されるように、銅のレベルはのCuO-NP処理した培地中で上昇しました。

哺乳類のPBWの細胞傷害性を改善するのCuO-NP処理の能力を決定するために、細胞は、生存率のCuO-NPの治療前後のPBW +媒体の溶液に曝露された細胞において評価しました。両HEK（ 図1A）およびHEP（ 図1B）細胞は、最大7日間未処置または処置PBW +メディアの異なる濃度に曝露しました。のCuO-NP処理が両方の細胞株における細胞生存率を改善し、一方、未処理のPBW +培地中で増殖させた細胞では、生存率は、濃度依存的に損なわれました。 図1Cに統合AUCはCuOを-NP処理したPBW +培地で増殖させたHEK細胞は、3最高濃度（29％、44％および56％）で、未処理PBW +メディアと比較して、より生存可能であったことを示しています。未処理PBW +メディア（44％および56％）の2つだけの最高濃度は、CuOを-NP処理したPBW +メディア（ 図1D）と比較して減損の生存率を示した：HEP細胞がわずかに異なる生存率を示しました。 PBWのより希薄濃度HEP細胞に対して低毒性であり、細胞生存率は、以下の処置によって影響します。ザ16.5％、未処理PBW +培地で増殖させ、両方のHEKとHEP細胞の生存率は、53％のCuO-NP処理したPBW +メディア（P <0.05）で増殖した細胞からの有意な差はなかったです。このように、CuOを-NP処置はコントロールレベルに近い生存率、PBWの細胞毒性を改善するように見えました。上述したように、PBWのCuOを-NP処理は銅濃度の増加と関連しています。増加はレディとロス（2012）による初期の結果に基づいて、予想された、ここで彼らは、地下水からヒ素を除去するためのCuO-のNPを使用していました。銅の増加は、PBWの特定の水の化学的性質に依存するが、1.3 mg / LでのEPA MCLの下に残りました。しかし、銅濃度の増加が改善された生存性に寄与していることを除外するために重要であった（ すなわち 、またはその代わりに優先汚染物質の減少、のに加えて）。したがって、銅キレート剤のD-ペニシラミンはEMEM-1X制御、RO +メディア制御、未処理及びCuO-NP処理したPBW +メディアソリューション、目に追加されました上記のように専用MTT生存成長曲線を作成しました。銅キレート化は重要ではありませんでしたRO +メディア制御、未処理及びCuO-NP処理したPBW +培地で培養したHEKまたはHEP細胞のいずれかの生存率に影響を与える（結果は示されていません）。

半最大阻害濃度（IC _{50）は、HEK}の5日目の成長および未処理PBW +培地（ 表4A）及びCuO-NP処置PBW +培地（ 表4B）で増殖させたHEP細胞から算出しました。未処理PBW +培地で増殖させたHEK細胞の場合は、IC ₅₀値は1.264（％PBWを記録）でした。このように、未処理PBW +メディアは生存率の50％の減少に到達するために18.38パーセントに希釈されなければなりません。のCuO-NP処理したPBW +培地で増殖させたHEK細胞の場合は、IC ₅₀値は2.744（％PBWを記録）でした。この結果は、溶液の理論的細胞傷害性は、メディアが同様の50％ドを生成すること（= 2.744％のPBWをログ）500％によって濃縮される必要があるであろう+ PBW処置程度に低下したことを示唆しています生存率のしわ。未処理PBW +培地で増殖させたHEP細胞については、IC _{50は、（％PBW}をログ）1.243でした。これは、生存率の50％減少を生じさせるために17.5％にPBW +媒体の希釈を必要とするであろう。これとは対照的に、CuOを-NP処理したPBW +培地で増殖させたHEP細胞について、IC _50は 5.327（％PBWを記録）でした。のCuO-NP処理したPBW +培地中の細胞の生存率はEMEM-1X（コントロール）で増殖させた細胞からの有意な差はなかったので、この値は可能性が高いので、大きかったです。 5日目の両方HEKおよびHEP細胞の増殖の、 図2に示した明視野画像。のCuO-NP処置PBW +培地（ 図2E、F）での細胞数と添付ファイルが未処理のPBW +培地（ 図2C、D）と比較して改善されました。

図1：成長曲線。増殖曲線は、生存能力とgを評価するために使用されました治療中の文化のrowth。53％のCuO-NP処理したPBW +メディア（上のパネル）と比較して、PBW +メディアの4の希釈液で増殖させたHEK（A）及びHEP（B）細胞の成長曲線。 EMEM-1X制御（EMEM） 、RO 、53％のCuO-NPで処置しました 、16.5％、未処理PBW 、29％未処理PBW 、44％未処理PBW 、56％未処理PBW 。 HEK（C）及びHEP（D）7日の成長曲線データ（下のパネル）の曲線（AUC）分析中のエリア。 * P <0.05 EMEM制御、RO制御、53％のCuO NP-扱わPBWメディアに比べ§p<0.05に比べ#P <0.05と比較しました。 （と、両側ANOVAを用いて比較Tukeyの事後解析において、n = 3）

図2：EMEM-1X制御（EMEM）（A、B：前及びCuO-NP処理後の細胞形態明視野顕微鏡HEK（左列）およびHEP（右列）5日目の細胞（20X）は、中で増殖させました）、56％未処理PBW +メディア（C、D）および53％のCuO-NP処置PBW +メディア（E、F）は、細胞の形態を調べました。 EMEM-1X制御（EMEM）中で増殖させたHEKとHEP細胞は（A、B）の健康な、近コンフルエントな成長を示しています。未処理PBW +培地で増殖させたHEKとHEP細胞は数が減少していると、（C、D）切り離されて表示されます。のCuO-NP処理したPBW +培地で増殖させたHEKとHEP細胞がより良い添付ファイルと健康、よりコンフルエント細胞（Eを表示しますNG>、F）。

表1：陽イオンと陰イオンの分析前及びCuO-NP処理後の平均元素濃度のCuO-NPで処理する前と後。のCuO-NP-処理および未処理PBWの濃度との間に有意差は、* = P <0.05、** = P <0.01および*** = p <0.001として指定されています。空白のセルは、有意な差がないことを示します。塩化物濃度は46.5±0.707と55.25±8.180の範囲でした。アルミニウム、ホウ素、モリブデンの濃度が低く、原因のCuO-NPの治療に有意な変化を示さありませんでした。マンガン濃度が一貫していませんでした。

表2：種は、Visual MINTEQの版を使用してモデル化します。 3.0ソフトウェア。ビジュアルMINTEQの版。 3.0ソフトウェア（技術KTH王立研究所Valhallavägen、スウェーデン）を表1に示すPBW成分の金属スペシエーションを計算するために使用した。（水溶液）=水性その種の固体形態とは対照的です。

表3：メディア内の汚染物質の濃度 EMEM-1X制御における優先汚染物質濃度（mg / L）の濃度（EMEM）、未処理PBW、CuOを-NP処理したPBW、未処理PBW +メディア及びCuO-NP処理したPBW +メディア。メディアコンポーネントを追加した（n = 3）は、未処理PBW +メディアで表現及びCuO-NP処理したPBW +メディアはセルに適用された治療による汚染物質の濃度の変化を確実にするために評価された後LS。

表4：IC ₅₀のIC ₅₀ の計算は、未処理のPBW +培地または生存能力の50％阻害に必要とされるのCuO-NP処置PBW +媒体の濃度を表します。   未処理のPBW +メディア（A）の希釈液に露出し、HEK細胞またはHEPのCuO-NP処置PBW +メディア（B）が5日目に生存率パーセントは、半最大阻害濃度（IC _50）を計算するために使用しました。

以前の研究では、CuOを-NPは地下水^11,13,30,31からヒ素を除去することを報告しました。本研究では、これらの以前の知見をサポートし、また、CuOを-NPはPBWから追加の汚染物質を除去することを報告しています。この研究はまた、他の汚染物質および潜在的な競合するイオン¹¹の存在にもかかわらず、CuOを-NPは、ヒ素の除去に有効であることを以前のレポートを確認します。分化モデリングはCuOを-NPのへの吸着を可能にする、PBWにおけるバナジウム種の97％が負に帯電していることを予測して、バッチ処理は、バナジウムの92％が除去されました。

これはCuOの-NPを使用してPBWから特定の汚染物質を除去の影響を調査し、その後除去に関連細胞毒性の変化を評価した最初の研究です。結果は、in vitroアプローチを使用して複雑な混合物の細胞傷害性の変化を調査することが可能であることを実証するが、これらの方法には、制限がないわけではありません。 PBWがfを使用することができませんでした細胞のULL強度、生き残るためにあるため、培養細胞は、定義された増殖培地と特定のオスモル濃度を必要とします。 PBW +メディアはまた、pH調整なしで細胞に使用することができませんでした。 PBWのpHは、しかし、治療後7.31前および7.36でした。増殖培地成分の添加は、希釈に応じて、約6.8のpHを低下させました。 pH調整は、しかし、細胞培養培地の調製において、通常の手順です。 PBW +培地のpHを調整するメディアコンポーネントを持つ元素種の分子間相互作用が変化していてもよいです。未処理及びCuO-NP処置PBWは、試験溶液（PBW +培地）を得るために様々な割合で、濃縮EMEM-10Xの増殖培地と混合しました。 ICP-MS分析は、かなりのCuO-NP-処理（ヒ素、銅、セレン、ウラン、バナジウム）の影響を受けて金属の濃度は、培地成分と浸透圧調整による希釈後に予想される濃度であったことを確認するために、試験媒体上で実施しました。減少のCuO-NP処理後のヒ素、セレン、バナジウムに未処理PBW +メディア及びCuO-NP処理したPBW +メディア間の濃度差に反映されています。ウラン濃度は、予測されるよりもCuOを-NP処理したPBW +メディアで高くなっています。 ICP-MSデータ（ 表1）は、モデリングによって予測よりも多くがウランのCuO-NP処理中PBWから除去されたことを示唆しています。スペシエーションモデリング（ 表2）は、pHが7.3で、ウラン種の唯一の35.5パーセントが負に帯電していることを予測しました。モデルは、主要なウラン種、カルシウム炭酸ウラニル（のCa ₂ UO _{2（CO 3）3）、}中立であることを予測します。

ウランの観察された78％の除去が原因（カルシウムウラニル炭酸ミネラルなど）ウラン吸着および沈殿の組み合わせに思われました。地球化学的モデリングに基づいて、吸着除去ウランの割合はCuOを-NPで高い濃度を可能にする計算されたよりも小さいです- 処​​理PBW +メディア。のCuO-NP-処理によるウランの除去のメカニズムは不明であるため、さらに調査が必要です。 PBWがしかしEMEM-10Xに追加されたときに、カルシウム、カリウムおよびマグネシウムの濃度の増加が予想されました。何の違いはCuOを-NP処理したPBW +メディア対未処理で見られなかったようにCuO-NP-治療は、これらの要素に有意な変化を生じませんでした。メディアコンポーネントで、実際の環境を組み合わせる手法は、治療による元素濃度で見られる変化を表現することに成功しました。しかし、PBWの酸化性質は、PBW +メディアが作ることができる方法を制限しました。試験媒体中の元素の最大濃度を増加させる試みにおいて、粉末状細胞培養培地は、もともとPBW +メディアを作るために、未処理及びCuO-NP処置PBWと混合しました。粉末培地は、多くの場合、カルシウム塩の沈殿をもたらし、それはcon​​cen製造、RO水で大きな希釈が必要PBW +媒体の浸透圧を増加させ液体10倍培地で得られるものに近いtrations。これらの問題は、その酸化状態にPBW固有の可能性が最も高いものであり、他の感度の低い混合物の問題ではないかもしれません。

MTTアッセイは、それがミトコンドリアの活性を測定することによって、細胞の全体的な健康状態を評価する認識標準ハイスループットアッセイであるので、細胞毒性を評価するために選択しました。この方法は、利点と欠点を有します。 96ウェルフォーマットは、しかしながら、複数のデータポイントを得るために有用です。 5日目の細胞の大部分は、見て不健康た丸みを帯びた、もはやプレートに取り付けられています。メディアは、真空を用いて除去される前に、図2の写真を撮影しました。メディアをオフに吸引し、その後MTT溶液を添加すると、未処理のPBWで見られた二日目の後にMTT信号の全体的な高原に貢献し、付着していない細胞または切り離し乏しい接着細胞を除去した可能性があります。仮定は、浮遊細胞が死亡または瀕死とOであるということですNLY付着した細胞は、この方法を用いて評価されます。これは、ナノ粒子を用いた研究に対するMTTアッセイの制限を考慮することも重要です。

以前の研究は、直接培養細胞に適用した場合、ナノ粒子は、サイズなどの独自の物理的特性に応じて、そのベースの化学的性質を超えて、固有の毒性を持っており^{、32,33を形成}することができる、ことを報告しています。この現在の研究では、細胞に直接のCuO-のNPを適用しませんでした。その代わりに、細胞は、以前のCuO-NPの大部分を除去するために遠心分離、CuOを-NPを用いて処理した後、PBWがPBW +培地を調製するために使用される前よりのCuO-NPを除去するために二回濾過されたPBWに曝露しました。 MSの結果は、処理後の銅の増加を示しました。これは、処置PBW Uのままにし、遠心分離/濾過工程を通過したことがあり、治療またはCuOを-NPの中にナノ粒子から溶解した銅イオンとすることができますPBW +メディアを作るためのsed。 85±1メートル² / gで¹¹のBET測定表面積を有する12〜18ナノメートルの大きさでのCuO-NPの範囲が、凝集することが知られており、処理されたPBW中の銅濃度の最小の増加に基づいているにかかわらず、銅の大部分ソースの遠心分離及び濾過後に除去されます。改善された細胞の健康と合流の目視確認は、（ 図2）により、PBWのCuOを-NPの治療に対する改善された生存率をMTTアッセイの結果をサポートしています。他の方法を用いて、今後の研究は、CuOを-のNPによって生じる同様の交絡効果を評価（または特徴付ける）ことができます。

ヒト胎児腎臓（HEK 293）及びヒト肝細胞癌（HEP G2）細胞毒性試験のために選択しました。これらには、重金属臓器毒性^24,25,34-40に臨床的に関連する標準的な細胞株です。低い播種密度がMTTアッセイのために使用しました。細胞を回復させ、/ウェルの500細胞で播種しました。24時間、その後、テストメディアに暴露しました。低播種密度は、（2010）。6日目または7チャクラらにオーバーコンフルエントと固定になる前に、5日目の周り対数期と成長曲線を達成するために必要としたことで培養腎臓へのカドミウム毒性の研究で報告しましたサブコンフルエントな増殖細胞がコンフルエント（静止）細胞よりも細胞傷害性を示した：近位尿細管細胞（PTC）は、密集度および増殖状態は、カドミウム曝露に応答に影響を与えた（静止対増殖します）。他のアッセイに使用したものと同様のより高い濃度（より高い密集度）でPBWに露出HEP及びHEK細胞を、MTTアッセイで見られる形態のロバストな変化を示さなかった（結果は示さず）。また収穫非接着細胞株またはプロトコルを使用して、細胞毒性の変化を調査し、すべての細胞を回収（ 例えば、フローサイトメトリー）が必要です。

研究米国におけるMTT法の別の制限ナノ粒子は、ナノ粒子る一部のタイプは、細胞栄養干渉する可能性があることです。細胞培養培地は、典型的には、細胞の成長を補完するために、ウシ胎児血清（FBS）のような追加のタンパク質源を含みます。研究は、金属酸化物ナノ粒子は、ナノ粒子の増加により吸収能力を、FBSで重要な成長成分を枯渇させることができることを示しています。金属酸化物ナノ粒子は、カルシウム⁴¹との相互作用を介してFBSにリンクすることが示されています。溶液のpHに依存して、金属ナノ粒子は、正または負の電荷を運ぶことができます。細胞毒性試験は、ナノ粒子は、Ca ²⁺を含む細胞培養培地の吸着陽イオンに加え、次いで、FBS中のタンパク質上の結合部位カルシウムにNP-のCa ²⁺複合体の結合を介してFBS /血清アルブミンを除去し、金属を示しています。これは、本質的に、細胞を飢餓状態にし、NAに起因する細胞毒性を増加させ、メディアからのCa ²⁺及びFBSの濃度を低下させますnoparticles ^41。さらに、FBS / CAにナノ粒子の前露光²⁺それらの細胞毒性効果を減少させること、ナノ粒子を被覆しました。しかし、我々は直接のCuO-のNPにメディアを公開し​​ていませんでした。また、カリフォルニア州の有意な減少²⁺濃度は、FBSと結合するためにそれらをプライミングのCuO-NPの上のCa ²⁺の有意な吸収を示さない、CuOを-NPを用いた治療後のPBWで見られませんでした。しかし、PBW中のカルシウムの濃度は、ナノ粒子によって誘発される減少が明らかにされていない可能性があることを十分に高いです。これは、と以前の研究と比較して、高レベルのカルシウムが含まれていPBWでのCuO-のNPのヒ素吸収能力には低下がなかったため、この研究で使用したCuO-NPは、処理中にカルシウムを大量に吸収していることはまだ可能性は低いです低いカルシウム濃度¹³と地下水。

データは、CuOを-NPはヒ素、セレン、バナジウムおよびURAを削除することを示していますニウム、これはMTTアッセイにおける改善されたHEKおよびHEP細胞生存率と関連しています。生存率が改善されるメカニズムは、まだ決定されていないが、他のメカニズムの中でのCuO-NPによる優先汚染物質の除去に起因し得ます。現在の研究はまた、標準的な細胞培養方法は、 インビボ動物試験においてより高価で時間のかかるへ移動する前に、潜在的なメカニズムの研究の範囲を完了することを可能にする、ナノ粒子ISR水処理法の有効性を評価するために使用できることを実証します。のCuO-NPは水のpH調整あるいは酸化を必要としないので、また、CuOを-NPは、アルミニウム、鉄、チタン、マンガンの酸化物のような従来の吸着剤よりもマイニングプロセスのための金属の混合物での治療のために、より汎用性になるかもしれませんヒ素除去のための、及びCuO-NPのケイ酸塩および硫酸塩、競合するアニオン、リン酸の存在下で、亜ヒ酸とヒ酸の両方を削除します。また、CuOを-NPは、再生して再することができます-古本、試薬コストおよび廃棄¹²を必要とする使用済みの処理廃棄副産物の量を減少させます。

MTTプロトコルの潜在的な制限は、露光時の低細胞密度、細胞および信号の損失、細胞飢餓及びCuO-NP改変MTT反応性への細胞の可能な直接暴露の分離を含みます。細胞密度及び剥離の問題は、より高い播種密度を可能にするフローサイトメトリー、ならびにすべての細胞の集合（ すなわち 、両方のフローティングおよび添付）などの代替試験を使用することによって対処することができます。細胞飢餓の問題は、治療中に定期的に培地に成長因子濃度を測定することによって評価することができます。今後の課題は、可能性のCuO-NP暴露はアッセイの活動を変化させた場合に対処する別の細胞傷害性アッセイに現在のプロトコルを適用することに焦点を当てて治療中の細胞飢餓の測定ともcontaminaを除去するためのCuO-NPの能力を試験しますNTSとは、スーパーファンドサイトや廃棄物処理池からの廃棄物のような複雑な混合物の他の種類の細胞毒性に影響を与えます。このような研究はまた、方法は、様々な設定で堅牢であるかどうかを扱うことになります。

The authors have nothing to disclose.

We thank Dr. Roger Hopper and the Wyoming Department of Agriculture, Analytical Services Lab for the mass spectroscopy analysis of our samples. We would like to express our gratitude to the University of Wyoming, School of Pharmacy for allowing us to video this protocol in their laboratories. We would also like to thank the Theodore O. and Dorothy S. King Endowed Professorship Agreement for their graduate assistantship (SC), the University of Wyoming for the Graduate Assistantship support (JRS), and the Science Posse (NSF GK-12 Project # 084129) for the teaching fellowship (JRS). We would also like to thank Uranium One for allowing us to obtain samples and assisting us with questions. This work was supported by the School of Energy Resources, University of Wyoming.