Rimozione di Oligoelementi per Cupric nanoparticelle di ossido di uranio da

Production bleed water (PBW) was treated with cupric oxide nanoparticles (CuO-NPs) and cellular toxicity was assessed in cultured human cells. The goal of this protocol was to integrate the native environmental sample into a cell culture format assessing the changes in toxicity due to CuO-NP treatment.

Recupero in situ (ISR) è il metodo predominante di estrazione di uranio negli Stati Uniti. Durante ISR, l'uranio è dilavati da una massa minerale e estratto attraverso scambio ionico. L'acqua di spurgo risultante produzione (PBW) contiene contaminanti quali arsenico e altri metalli pesanti. Campioni di PBW da un impianto di uranio ISR attivo sono stati trattati con nanoparticelle di ossido rameico (CuO-NP). Trattamento CuO-NP di pbw ridotto contaminanti prioritari, tra cui l'arsenico, selenio, l'uranio, e vanadio. Assay greggia e CuO-NP trattata PBW stato utilizzato come componente liquida dei terreni di crescita cellulare e cambiamenti di redditività sono stati determinati dalla MTT (3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio bromuro) in rene umano embrionale (HEK 293) ed il carcinoma epatocellulare umano (Hep G2) cellule. Trattamento CuO-NP è stata associata con una migliore HEK e vitalità cellulare HEP. Limiti di questo metodo includono la diluizione del PBW da componenti multimediali di crescita e durante osmolRegolazione nalità così come la regolazione del pH necessario. Questo metodo è limitato nel suo contesto più ampio a causa di effetti di diluizione e cambiamenti nel pH del PBW che è tradizionalmente leggermente acida tuttavia; questo metodo potrebbe avere un uso più ampio valutare trattamento CuO-NP in acque più neutri.

Circa il 20% della fornitura elettrica degli Stati Uniti è fornito da energia nucleare e, in parte basato su incentivi nazionali per aumentare l'indipendenza energetica, Stati Uniti è previsto capacità nucleare per aumentare ^1. Crescita mondiale dell'energia nucleare dovrebbe inoltre continuare, con gran parte della crescita che si verificano al di fuori degli Stati Uniti ^2. Dal 2013, l'83% degli Stati Uniti di uranio è stato importato, ma esistono 952.544 tonnellate di riserve negli Stati Uniti ^3,4. Nel 2013 ci sono stati 7 nuove applicazioni impianto e applicazioni 14 riavvio / dilatazione tra Wyoming, New Mexico, e Nebraska ^5. Negli Stati Uniti, l'uranio viene estratto attraverso prevalentemente recupero in situ (ISR) i procedimenti ^6. ISR provoca meno disagi terra ed evita la creazione di cumuli di raccolta degli sterili che possono rilasciare contaminanti ambientali ^7. ISR utilizza soluzioni ossidanti a base acquosa per lisciviare uranio dal corpo minerale sotterranea, dopo di che l'uranio viene estratto dal percolato attraversoun processo di scambio ionico ^8. Per mantenere un equilibrio idrico negativo nel corpo minerale, una porzione del percolato, chiamato produzione sanguinare acqua (PBW), si spurga off. Una porzione del PBW viene decontaminato mediante osmosi inversa (RO), e reintrodotto nel processo di estrazione, ma PBW potrebbe anche avere usi industriali o agricole benefiche, se contaminanti tossici possono essere ridotti a livelli accettabili determinati dalla statali agenzie normative per superficie e sotterranee ^9. Attualmente, la maggior parte delle strutture di uranio ISR usano RO per rimuovere i contaminanti da PBW. Tuttavia, l'elaborazione RO è ad alta intensità energetica e produce salamoia rifiuti tossici, che richiede lo smaltimento regolamentato.

Esistono molti metodi di decontaminazione dell'acqua, tra cui adsorbenti, membrane e scambio ionico. Di questi, l'adsorbimento è il più comunemente usato, ei recenti sviluppi nella sintesi di nanoparticelle ha migliorato le funzionalità di base di adsorbenti acqua decontaminazione processi ^10. Oxi Cupricde nanoparticelle (CuO-NP) in precedenza non erano state ampiamente studiate sull'uranio ISR PBW, ma in recenti studi di rimozione dei contaminanti dalle acque sotterranee, CuO-NP sono stati trovati ad avere proprietà uniche, tra cui non richiede fasi di trattamento pre o post-acqua ( ad esempio, la regolazione del pH o potenziale redox) e rendimento in diverse composizioni di acqua (ad esempio, in diversi pH, concentrazioni di sale, o ioni concorrenti) ^11. Inoltre, CuO-NP sono facilmente rigenerato mediante esaurimento con idrossido di sodio (NaOH), dopo di che il rigenerato CuO-NP può essere riutilizzato. Dettagli di CuO-NP capacità di filtraggio traccia di metallo dalle acque naturali sono stati precedentemente pubblicati ^11-14.

Sebbene utili per il trattamento dell'acqua, nanoparticelle di ossido di metallo possono essere tossiche per gli organismi viventi, ma la misura della tossicità dipende, in parte, sulle caratteristiche nanoparticelle e costituenti ^10,15,16. Pertanto, è importante studiare simultaneous contaminanti rimozione e nanoparticelle tossicità prima di applicazioni sul campo. L'attuale studio ha determinato la capacità di CuO-NP per rimuovere i contaminanti prioritari PBW (tra cui l'arsenico, selenio, vanadio e uranio), e ha valutato l'effetto del trattamento CuO-NP su PBW citotossicità.

PBW stato raccolto da una struttura di uranio ISR attivo e utilizzato per determinare l'efficacia del trattamento CuO-NP in rimozione dei contaminanti priorità. PBW citotossicità prima e dopo il trattamento CuO-NP è stato anche valutato. PBW è un complesso geologico miscela (industriale / ambientale) e dal National Institute of Environmental Health and Science (NIEHS) e l'Agenzia per le sostanze tossiche e delle malattie del Registro di sistema (ASTDR) sono ponendo l'accento sullo studio della tossicità di miscele di rilevanza ambientale, comprese le miscele come esistono in natura o industriali impostazioni, così come la promozione in test in vitro per la priorità prodotti chimici per ulteriori test in vivo^17-19. Studi di cronica, a basso dosaggio esposizioni miscela sono difficili perché l'esposizione cronica a una miscela di bassa dose non produce effetti evidenti, almeno non nel breve lasso di tempo della maggior parte degli studi di laboratorio. Analogamente, più in studi in vitro di miscele chimiche esporre le cellule ad una miscela laboratorio misura definita di 2 o più metalli ^20,21. Questi studi forniscono informazioni di base, ma le miscele semplificate non replicano le complesse interazioni antagoniste e sinergici che possono verificarsi in un campione ambientale natale, dove la gamma completa di componenti della miscela sono presenti.

Gli obiettivi di questo studio erano di esaminare i processi di rimozione dei contaminanti alternative per PBW e per valutare l'effetto di (CuO-NP) trattamento in PBW citotossicità utilizzando cellule umane in coltura. I risultati potrebbero beneficiare l'industria dell'uranio attraverso lo sviluppo di metodi più efficienti o ecologici per la rimozione dei contaminanti. Questo studio forniscela prima evidenza che la riduzione dei contaminanti prioritari PBW da CuO-NP riduce citotossicità in cellule di mammifero ^22.

Tutti i campioni sono stati raccolti presso la sede di elaborazione liquido dell'uranio di un impianto ISR uranio in Wyoming.

1. Produzione Bleed Water (PBW)

1. Raccogliere due tipi di campioni d'acqua da un impianto di uranio ISR: PBW e osmosi (RO) acqua retromarcia. Raccogliere PBW da un rubinetto monitoraggio dopo il processo di scambio ionico ma prima di osmosi inversa decontaminazione. Raccogliere campioni RO dopo il PBW è decontaminato da un trattamento di osmosi inversa.
   NOTA: lixiviant è trasportato nelle condotte dai campi più oltre alla costruzione trasformazione liquido uranio, dove viene raccolta in una colonna e preparata per scambio ionico. Circa 1-3% del lixiviant dopo scambio ionico viene rimosso dal circuito e acqua di spurgo produzione definito (PBW). PBW viene riutilizzato nel processo di estrazione o decontaminata / demineralizzata con filtrazione RO.
2. Raccogliere campioni di acqua in polietilene ad alta densità (HDPE), con spazio di testa zero in basedi procedure operative standard per la raccolta e l'analisi del Dipartimento Wyoming di Qualità Ambientale (WYDEQ) ²³ campioni.
3. Misurare la temperatura e pH in loco e campioni di trasporto sul ghiaccio per mantenerli freschi.
4. Conservare PBW a 4 ° C. Mantenere la soluzione PBW fresco fino a dopo minimo supporto essenziale (EMEM-10x) il concentrato dell'Aquila viene aggiunto durante la preparazione dei media come indicato nella seguente protocollo.
   NOTA: PBW è una soluzione ossidata che precipiterà se lasciato congelare o riscaldare a temperatura ambiente. Dopo diluizione la soluzione PBW è sufficientemente diluito che non precipitare quando riscaldato a 37 ° C prima dell'applicazione alle cellule e durante l'incubazione.

2. Preparazione di CuO nanoparticelle (CuO-NP)

1. Combinare una soluzione etanolica puro contenente 250 ml di 0,2 M CuCl ₂ • 2H ₂ O, 250 ml di 0,4 M di idrossido di sodio (NaOH), e 5 g di polietilene glicole (PEG) in un pallone a fondo tondo con sei millimetri sfere di vetro borosilicato.
2. Posizionare la soluzione in un forno a microonde modificato e lasciare reagire a riflusso a pressione ambiente per 10 min a 20% di potenza (intervalli di 6 secondi su, 24 sec spento).
3. Raffreddare la soluzione a temperatura ambiente (20 ° C), quindi travasata in 50 ml provette coniche, lasciando le sfere di vetro.
4. Centrifugare la soluzione in 50 ml provette coniche a 1.000 xg per 30 min, decantata, e quindi lavare il CuO-NP con una sequenza di 300 ml di acqua calda (60-65 ° C), 100 ml di etanolo e 100 ml di acetone.
5. Essiccare il CuO-NP a temperatura ambiente (20 ° C) in 50 ml provette coniche.
6. Raschiare il CuO-NP di loro tubi in un mortaio. Coprire il CuO-NP con carta stagnola e riscaldare il CuO-NP a 110 ° C in un forno per rimuovere il liquido rimanente. Combina CuO-NP in una partita e pesare il CuO-NP.
   NOTA: La preparazione di CuO-NP e trattamento CuO-NP di PBW sono state condotte in acqua Quallità Laboratorio di Scienza e Ecosystem Management, Università di Wyoming. CuO-NP sintesi seguito la procedura di Martinson e Reddy (2009) ^11.

3. Il trattamento di PBW con CuO-NP

1. Aggiungere 50 mg (1 mg / ml) di CuO-NP in una provetta da 50 ml seguita da 50 ml di PBW. Sigillare il tubo e fatta reagire per 30 min su un banco superiore agitatore orbitale a 250 rpm.
2. Tubi campione centrifugare a 250 xg per 30 min e poi filtrare il supernatante usando un filtro a siringa da 0,45 micron. Modificare la velocità della centrifuga e il tempo può dipendere dalla nanoparticella di garantire la CuO-NP diventa compatta nella provetta da centrifuga.

4. Analisi elementare

1. Preparare greggia (controllo) e campioni pbw CuO-NP-trattati per analisi elementare come segue.
2. Acidificare aliquote (40 ml) di CuO-NP-trattati e non trattati con acido nitrico PBW grado traccia di metallo ad un pH di 2,0. Analizzare acidificate aliquote PBW per cationi di coupl induttivamenteed plasma-massa spettroscopia (ICP-MS) come descritto in Reddy e Roth (2012) ^13.
3. Preparare aliquote unacidified (20 ml) di CuO-NP-trattati e non trattati PBW e analizzare le aliquote unacidified per anioni di cromatografia ionica (IC) come descritto in Reddy e Roth (2012) ^13.
   NOTA: Aliquote sono stati analizzati dal Dipartimento di Agricoltura Wyoming Analytical Services, Laramie WY 82070. Una descrizione della procedura di IC e ICPMS può essere trovato in Reddy e Roth, (2012) ^13.

5. Preparazione di colture cellulari supporti Utilizzo PBW

1. Utilizzare due di controllo (EMEM-1x e RO + media) e otto soluzioni multimediali prova PBW (quattro concentrazioni ciascuno di PBW non trattati e dei media CuO-NP-trattati) negli studi di fattibilità. Panoramica delle soluzioni sono le seguenti:
   1. Per il controllo EMEM-1x, l'acquisto di mezzi di comunicazione essenziale minimo di Eagle (EMEM-1x) con L-glutammina e bicarbonato di sodio già aggiunto. Aggiungere siero fetale bovino (FBS) E gli antibiotici per le istruzioni del produttore.
      NOTA: EMEM-1x viene acquistato diluito alla concentrazione appropriata per la crescita cellulare e contenente L-glutammina e bicarbonato di sodio. EMEM-1x richiede l'aggiunta di siero bovino fetale (FBS) e una miscela antibiotico della penicillina e streptomicina (50 UI / ml di penicillina e 50 mg / ml di streptomicina). EMEM-1x è usato come mezzo di controllo, perché è terreno di coltura consigliata dal costruttore per entrambi i tipi di cellule utilizzate in questo studio. Concentrato EMEM-10x viene diluito con acqua RO dalla struttura o non trattati o CuO-NP-trattati PBW per produrre le soluzioni di prova. Concentrato EMEM-10x se acquistato non contiene L-glutammina o bicarbonato di sodio per cui questi vengono aggiunti in aggiunta al siero fetale bovino (FBS) e una miscela antibiotico della penicillina e streptomicina.
   2. Per la soluzione di controllo RO RO utilizzare acqua raccolti dalla struttura di ISR. Utilizzare lo stesso protocollo mezzi di prova PBW sostituire solo il 100% RO water dalla struttura ISR al posto di PBW. Per diluire l'acqua non trattata e uso soluzione CuO-NP-trattati con RO o ultrapura dal laboratorio.
   3. Diluire trattata PBW in quattro concentrazioni di prova prima della miscelazione con i componenti di colture cellulari multimediali. Preparare i quattro differenti concentrazioni di soluzioni PBW trattati miscelando greggia PBW con RO (da laboratorio) nelle seguenti combinazioni: 100% (PBW puro + acqua RO), 75% (187,5 ml di PBW + 62,5 ml di acqua RO), 50% (125 ml di PBW + 125 ml di acqua RO) o 25% (62,5 ml di PBW + 187,5 ml di acqua RO).
   4. Diluire CuO-NP-trattata PBW in quattro concentrazioni di prova prima della miscelazione con i componenti di colture cellulari multimediali. Preparare i quattro differenti concentrazioni di soluzioni PBW CuO-NP-trattati mescolando PBW (pre-trattati con 1 mg / ml CuO-NP per 30 min) con RO (da laboratorio) nelle seguenti combinazioni: 100% (CuO- puro PBW NP-trattati + senza acqua RO), il 75% (187,5 ml di CuO-NP trattati PBW + 62,5 ml acqua RO), il 50% (125ml di CuO-NP-trattata PBW + 125 ml di acqua RO) o del 25% (62,5 ml di PBW CuO-NP-trattati con + 187,5 ml di acqua RO).
2. Preparare 250 ml di RO + media, PBW trattata + media e la concentrazione dei media PBW + CuO-NP-trattati con l'aggiunta di 25 ml di concentrato EMEM-10x a 190 ml di 100% RO e il 100%, il 75%, 50% o il 25% delle concentrazioni premade PBW non trattati o CuO-NP trattati creato al punto 6.1.3 e 6.1.4.
3. Regolare il pH di ogni soluzione a 7,4 con NaOH o HCl.
4. Supplemento ciascuna concentrazione della greggia e CuO-NP-trattati PBW nonché RO + supporto con i seguenti componenti standard: 25 ml (10%) di siero fetale bovino (FBS), 2,5 ml L-glutammina, 0,55 g _NaHCO3 e 1,25 ml Pen / Strep (50 IU / ml di penicillina e 50 mg / ml di streptomicina).
5. Regolare la osmolalità di ogni concentrazione di PBW trattata + media, CuO-NP-trattata PBW + media e RO + media per 290-310 mOsm / kg con l'aggiunta di acqua RO e misurare con un osmometro.
6. Filtrare ogni soluzione conuna unità di 0,22 micron di vuoto filtro, e conservare a 4 ° C.
   NOTA: a causa di lievi variazioni nella quantità di acqua RO utilizzato per regolare osmolalità, variare le concentrazioni di media finali all'interno di un intervallo del 5%, con PBW trattata + concentrazioni dei media al 56%, 44%, 29% e 16,5% e CuO-NP trattati concentrazioni pbw + supporti al 53%, 45%, 30% e 17%.

Viabilità 6. cellulare

NOTA: Dato che reni e fegato sono gli organi bersaglio della tossicità dei metalli pesanti, impiegano renali embrionali umane (HEK293), le cellule in coltura (HEK) e carcinoma epatocellulare umano (HepG2) cellule (HEP) metodi di prova ^24-26.

1. Preparare una coltura di cellule HEK e HEP 2-3 giorni prima placcatura le piastre a 96 pozzetti utilizzati nell'esperimento le istruzioni del produttore.
2. Misurare la vitalità cellulare utilizzando 3- [4, 5-dimetiltiazol-2-il] -2, 5-diphenyltetrazolium bromuro (MTT).
   NOTA: Il protocollo del saggio MTT è stato modificato da Meerloo et al. (2011) ^27.
   1. Ottenere MTT in polvere. Aggiungere tampone fosfato (PBS) per costituire una concentrazione magazzino di 50 mg / ml. Agitare la soluzione per 2 ore e poi filtrare con un filtro siringa da 0,45 micron e aliquota in 1,5 ml congelatore tubi sicure. Proteggere i tubi di luce e conservare a 4 ° C.
3. Rimuovere le cellule HEK e HEP dai loro piatti di coltura utilizzando tripsina, centrifugare a 1000 xg per 5 minuti e decantare la tripsina. Aggiungere 5 ml di PBS e mescolare le cellule per ottenere una soluzione singola cellula. Quindi, applicare 20 microlitri della soluzione di cellule singolo ad un emocitometro per ottenere un numero di cellule per millilitro di soluzione. Centrifugare le cellule di nuovo a 1000 xg per 5 minuti e decantare il PBS usato per sciacquare le cellule. Aggiungere la quantità appropriata di EMEM-1x per regolare la concentrazione di cellule di 500 cellule / 100 ml (100 ml / pozzetto).
4. Riempire i pozzetti perimetrali della piastra con 200 l di PBS per controllare l'evaporazione.
5. Cell Seeds ad una densità di 500 cellule / pozzetto aggiungendo 100 microlitri in ciascun pozzetto, ad eccezione dei pozzetti perimetrali (che non sono placcati con cellule).
   NOTA: densità di semina per cellule HEK e HEP è basato sulle curve di crescita sperimentali che consentono il picco di crescita si verifica intorno ai giorni 4-5. Preparare curve di crescita per tutte le linee cellulari di stimare la densità di semina.
6. Incubare le cellule per 24 ore a 37 ° C che permette loro di recuperare (modulo adesioni stretti alla piastra) prima di effettuare le letture di base MTT di densità delle cellule.
7. Eseguire letture MTT basali di densità cellulare rimuovendo il materiale di semina dalla prima colonna (escluso il perimetro) e aggiungendo 100 ml di MTT (5 mg / ml in media) ai pozzetti per 1 ora.
8. Dopo un'ora, togliere il MTT e aggiungere 100 ml di dimetilsolfossido (DMSO) per sciogliere il MTT-formazan prodotto da cellule vitali (20 min).
9. Leggere la densità ottica (OD) della prima colonna ad una lunghezza d'onda di assorbimento di 570 nm per ottenere una baselettura di riga.
   1. Utilizzare le letture di base al fine di garantire tutte le lastre sono state seminate in modo corretto e che le cellule sono in crescita costante tra le piastre. Rimuovere il DMSO dalla colonna in fase di sperimentazione prima di incubazione per le prossime 24 ore.
      NOTA: Se DMSO viene lasciato nella piastra notte tira l'umidità dalla colonna adiacente, causando una riduzione del volume del supporto.
10. Riscaldare le soluzioni (cioè, il EMEM-1x, RO, PBW greggia e soluzioni PBW multimediali CuO-NP-trattati) a 37 ° C in un bagno d'acqua.
11. Rimuovere il supporto semina dal resto della piastra (escluso il perimetro o la prima colonna che è stato utilizzato per la lettura basale) e sostituito con 100 ml di EMEM-1x, RO + multimediali, pbw greggia + supporti concentrazioni o CuO-NP PBW -treated + concentrazione dei media (una soluzione per piastra). Incubare le cellule nelle loro concentrazioni di prova o soluzioni di controllo per un totale di sette giorni (giorni 2-8).
    NOTA: 10 piatti totale: 1 EMEM-1x, 1 RO + media, 1 di ogni trattato concentrazione PBW + mezzi (56%, 44%, 29% e 16,5%) e un piatto di ciascuna concentrazione pbw + supporti CuO-NP-trattati (53%, 45% , 30% e 17%) per ogni esperimento per linea di cellule.
12. Ogni giorno successivo al basale lettura MTT, rimuovere le soluzioni di controllo e di prova (elencati nella nota sotto 6.11) dalla colonna successiva della loro rispettiva piastra (es Day 2 mezzi di prova e di controllo vengono rimossi dalla riga 3, pozzi BG; 3 ° giorno: fila 4, pozzi BG ecc) e ripetere il protocollo MTT come descritto nei passaggi 6,7-6,9 sopra.
13. Ripetere il protocollo ogni giorno per sette giorni. Calcolare la media dei risultati di OD per ogni riga (6 pozzi) e riportati contro il tempo per generare una curva di crescita di sette giorni.
14. Per valutare l'effetto della chelazione rame sulla vitalità cellulare in PBW CuO-NP-trattati + supporti seguire la stessa procedura come sopra, tranne aggiungere 100 mM di D-penicillamina controllare e soluzioni di prova prima di aggiungere le soluzioni alle loro rispettive piastre. Eseguire anale datiYsis utilizzando software grafici scientifici.

7. Modellazione geochimica

1. Scarica la versione di Visual Minteq 3.0 / 3.1 un freeware dal seguente sito web http://www2.lwr.kth.se/English/Oursoftware/vminteq/ .
   Nota: Visual Minteq è un modello di equilibrio chimico freeware per il calcolo di speciazione metallo, equilibri di solubilità, assorbimento ecc per le acque naturali. Inoltre è utilizzato per prevedere speciazione ioni, le attività di ioni, complessi di ioni e gli indici di saturazione che viene confrontato con la concentrazione di elementi prima e dopo il trattamento (risultati spettroscopia di massa) per esaminare possibili meccanismi di rimozione dell'elemento ^28.
2. Aprite il programma e inserire i dati di spettroscopia di massa dal punto 4, tra cui il pH, l'alcalinità e le concentrazioni di diversi elementi, nel programma.
   NOTA: Dato che le acque sotterranee si ossida durante in situ Uranium processo di estrazione, utilizzare specie ossidate di arsenico, vanadio e uranio per l'ingresso.

8. inibitorio Concentrazione 50 (IC ₅₀₎

1. Calcolare la _IC50 per le concentrazioni PBW + supporti non trattati e CuO-NP-trattati con prima media la redditività (medie OD) il giorno 5 di tre sessioni di analisi separate.
2. Sottrarre giorno cinque medie redditività delle PBW + multimediali concentrazioni non trattati e CuO-NP trattati dal giorno cinque medie vitalità di EMEM-1x per calcolare le differenze di vitalità. Poi dividere le differenze di vitalità da parte della redditività media al giorno 5 negli EMEM, e moltiplicare per 100 per ottenere per cento di inibizione.
3. Sottrarre la percentuale di inibizione da 100 (EMEM-1x fattibilità) per ottenere la sostenibilità per cento per ogni PBW + concentrazione dei media non trattati e CuO-NP-trattata.
4. Input in software grafici scientifica modificando EMEM-1x ad una concentrazione di uno e una vitalità percentuale di 100; trasformare tutte le concentrazioni in logscala (X = log (x)) ed eseguire la regressione lineare con minimo analisi in forma quadrata.

Analisi 9. Dati

1. Confronta le concentrazioni di elementi in non trattati e CuO-NP-trattati PBW con due code, in coppia, Student T-test.
2. Calcolare le aree sotto la curva (AUC), utilizzando i dati della curva della crescita raccolti in sette giorni e analizzare la varianza con ripetute analisi misure della varianza (ANOVA), seguita da post hoc di Tukey confronto tra tutti i gruppi (n = 3).
3. Calcola il _IC50 utilizzando dati provenienti da cinque giorni della curva di crescita sia per le soluzioni multimediali (di cui sopra) PBW + non trattati e CuO-NP-trattata. Valori di p <0,05 sono considerati significativi.
   NOTA: ai fini di analisi statistiche, i valori di spettroscopia di massa della metà del limite di rilevazione è stato assegnato a ioni concentrazioni livelli di sotto di tale limite ^29.

Concentrazioni dei componenti pbw e pH in greggia e CuO-NP-trattati PBW sono riportati in Tabella 1. Martinson e Reddy (2009), hanno riferito che il punto di carica zero del CuO-NP è stimato a 9.4 ± 0.4. Dato che il pH della PBW era 7,2-7,4, in queste condizioni, l'acqua dona protoni CuO-NP, causando la superficie delle nanoparticelle da caricare positivamente consentendo l'assorbimento di specie cariche negativamente. Trattamento CuO-NP rimosse contaminanti prioritari da PBW, tra l'arsenico, selenio, uranio e vanadio (Tabella 1). La concentrazione media di arsenico è stato ridotto del 87% [,0175-,002 mg / L (due code t-test per dati appaiati, p <0,0001)]. Trattamento CuO-NP anche selenio significativamente ridotto (30%), uranio (78%), vanadio (92%), e fosfato (85%) (p <0,05).

Risultati della modellizzazione speciazione, riportati nella tabella 2, sostenere i risultati analitici: il 99% di atal arsenico disciolto in PBW è presente come Haso ₄ ^{a 2} e H ₂ AsO ₄ ^- e il 94% di selenio totale disciolto in PBW è presente come SEO ₄ ^2-. Queste specie sono negativamente pagano, e quindi in grado di adsorbimento a CuO-NP. Modellazione speciazione ha previsto che il 99% delle specie di vanadio in PBW sono carica negativa, promuovendo anche l'assorbimento di CuO-NP. Tuttavia, la modellazione speciazione prevede solo 35,5% dell'uranio specie sono caricate negativamente, che limiterebbe adsorbimento a CuO-NP. Analisi degli indici di saturazione previsto che nessuna specie di arsenico, selenio, uranium- o minerali contenenti vanadio erano vicini di saturazione (ad esempio, la precipitazione minerale) livelli, adsorbimento di sostegno per CuO-NP, contro precipitazioni.

Per valutare se la concentrazione previsti dei contaminanti prioritari sono i media a base di trattati e CuO-NP trattati PBW, campioni di supporti di controllo non diluito (EMEM-1x), il 56%pbw + supporti non trattati e la PBW CuO-NP-trattati con 53% + supporti sono stati analizzati mediante ICP-MS. Mezzi di controllo non diluito (EMEM-1x) è un prodotto commerciale fornito con L-glutammina e bicarbonato di sodio (pre-aggiunto). Le concentrazioni di rame e selenio nel controllo EMEM-1x erano leggermente elevati come previsto perché sono essenziali per la crescita cellulare, ma l'arsenico, l'uranio e vanadio sono state trascurabili, riportati nella tabella 3. Studi preliminari hanno mostrato che, l'arsenico, le concentrazioni di selenio e vanadio sono stati ridotti di trattamento CuO-NP e che la diminuzione è rappresentata nelle concentrazioni nel PBW CuO-NP-trattati + media. La concentrazione misurata di uranio nel PBW CuO-NP-trattati con + supporto è stato diminuito rispetto ai non trattati PBW, e questo calo è stato più pronunciato di quanto previsto da Visual modellazione Mintec v.3. I livelli di rame sono aumentati nei media CuO-NP trattati come previsto.

Per determinare la capacità di trattamento CuO-NP per migliorare citotossicità PBW su mammifericellule, la vitalità è stata valutata in cellule esposte a soluzioni PBW + supporto prima e dopo il trattamento CuO-NP. Sia le cellule HEK (Figura 1A) e HEP (Figura 1B) sono stati esposti a diverse concentrazioni di PBW trattati o trattati + supporto per fino a sette giorni. Nelle cellule coltivate in PBW trattata + media, la redditività è stata compromessa in modo concentrazione-dipendente, mentre il trattamento CuO-NP ha migliorato la vitalità cellulare in entrambe le linee cellulari. L'AUC integrato nella Figura 1C mostra che PBW cellule HEK coltivate in CuO-NP-trattati + media erano più praticabile rispetto ai non trattati PBW + supporto alle tre concentrazioni più alte (29%, 44% e 56%). Cellule HEP mostrato leggermente diversa redditività: solo i due più alte concentrazioni di PBW trattata + mezzi (44% e 56%) hanno mostrato vitalità ridotta rispetto al PBW CuO-NP-trattati con + supporto (Figura 1D). Le concentrazioni più diluite di PBW erano meno tossici per le cellule HEP e vitalità cellulare meno influenzati dal trattamento. Ilvitalità di entrambe le cellule HEK e HEP coltivate nel 16,5% PBW greggia + media non era significativamente differente da cellule cresciute in PBW 53% CuO-NP-trattati + supporto (p <0,05). Quindi, il trattamento CuO-NP sembrava migliorare la citotossicità di PBW, con viabilità nei pressi di livelli di controllo. Come discusso sopra, il trattamento CuO-NP di PBW è associato ad un aumento delle concentrazioni di rame. L'aumento è stato previsto, sulla base dei risultati precedenti di Reddy e Roth (2012), in cui hanno usato CuO-NP per rimuovere l'arsenico dalle acque sotterranee. L'aumento del rame dipende dalla chimica dell'acqua specifico della PBW, ma rimasto inferiore EPA MCL di 1,3 mg / L. Tuttavia, era importante escludere che l'aumento delle concentrazioni di rame, contribuito ad accrescere la redditività (cioè, in aggiunta o al posto di, la diminuzione contaminanti prioritari). Di conseguenza, il chelante del rame D-penicillamina è stato aggiunto al controllo EMEM-1x, RO controllo + media, soluzioni pbw + supporti non trattati e CuO-NP-trattati, e then MTT curva di crescita vitalità sono stati generati, come descritto sopra. Copper chelazione non ha significativo effetto vitalità delle cellule HEK sia o HEP incubati in RO controllo + media, PBW non trattati e CuO-NP-trattati con + mezzi (risultati non mostrati).

La metà massima concentrazione inibente (IC ₅₀₎ è stata calcolata dal giorno cinque crescita delle cellule HEK e HEP coltivate in PBW trattata + supporto (Tabella 4A) e PBW CuO-NP-trattati con + supporto (Tabella 4B). Per le cellule HEK coltivate in PBW trattata + media, il valore _IC50 era 1.264 (log% PBW). Così, i + mezzi PBW trattati dovrebbero essere diluito al 18,38% per arrivare a una riduzione del 50% della vitalità. Per le cellule HEK coltivate in PBW + mezzi CuO-NP-trattati, il valore _IC50 era 2.744 (log% PBW). Questo risultato suggerisce che teoricamente la citotossicità della soluzione è stato ridotto nella misura in cui trattate PBW + supporti dovrebbero essere concentrato da 500% (log% PBW = 2.744) per produrre un simile 50% depiega della vitalità. Per le cellule coltivate in HEP PBW trattata + media, la IC ₅₀ è 1.243 (log% PBW). Ciò richiederebbe una diluizione del PBW + supporto al 17,5% per produrre una diminuzione del 50% della vitalità. Al contrario, le cellule coltivate in HEP PBW + supporti CuO-NP-trattati, l'IC ₅₀ è 5,327 (log% PBW). Questo valore probabilmente era così grande, perché la vitalità delle cellule in PBW CuO-NP trattati + media non era significativamente diversa da cellule coltivate in EMEM-1x (controllo). Immagini in campo chiaro, illustrata in figura 2, sia crescita cellulare HEK e HEP quinto giorno. Numero di cellulare e l'attaccamento nei PBW + supporto CuO-NP-trattati (Figura 2E, F) sono stati migliorati rispetto ai non trattati PBW + supporto (Figura 2C, D).

Figura 1: Curve di crescita. Curve di crescita sono stati usati per valutare la fattibilità e gRESCITA delle culture durante il trattamento. Le curve di crescita per HEK (A) e HEP (B), le cellule coltivate in quattro diluizioni di PBW + supporti rispetto al 53% PBW CuO-NP-trattati + supporti (pannelli superiori). Controllo EMEM-1x (EMEM) , RO , 53% CuO-NP-trattati , Il 16,5% non trattati PBW , Il 29% non trattati PBW , Il 44% non trattati PBW , Il 56% non trattati PBW . Area sotto la analisi della curva (AUC) di HEK (C) e HEP (D) i dati della curva di crescita del 7 giorno (pannelli inferiori). * P <0,05 rispetto al controllo EMEM, #p <0,05 rispetto al controllo RO, §p <0,05 rispetto al 53% CuO NP-trattati PBW-media. (Rispetto utilizzando una ANOVA a due coda conL'analisi di Tukey post hoc, n = 3)

Figura 2:. Morfologia cellulare prima e dopo il trattamento CuO-NP microscopia in campo Bright (20X) di HEK (colonna di sinistra) e HEP (colonna di destra) cellule a giorno 5, coltivato in: controllo EMEM-1x (EMEM) (A, B ), il 56% PBW trattata + supporti (C, D) e 53% PBW CuO-NP-trattati con + supporto (E, F) è stato utilizzato per esaminare la morfologia cellulare. Cellule HEK e HEP coltivate in controllo EMEM-1x (EMEM) (A, B) mostrano una crescita sana e quasi confluenti. Cellule HEK e HEP coltivate in PBW trattata + media hanno ridotto il numero e appaiono distaccato (C, D). Cellule HEK e HEP coltivate in PBW + mezzi CuO-NP trattati mostrano meglio l'attaccamento e le cellule sane, più confluenti (E , F).

Tabella 1:. Analisi di cationi e anioni prima e dopo il trattamento CuO-NP medio concentrazioni degli elementi, prima e dopo il trattamento con CuO-NP. Importanza tra la concentrazione di CuO-NP-trattati e non trattati PBW sono designate * = p <0.05, ** = p <0,01 e *** = p <0.001. Una cella vuota indica alcuna differenza significativa. Le concentrazioni di cloruro variava tra 46,5 ± 0,707 e 55,25 ± 8.180. Alluminio, boro e molibdeno concentrazioni erano bassi e non ha mostrato alcun cambiamento significativo a causa di trattamento CuO-NP. Le concentrazioni di manganese non erano coerenti.

Tabella 2: Specie modellazione utilizzando Visual Minteq ver. Software 3.0. Di Visual Minteq ver. Software 3.0 (KTH Reale Institute of Technology, Valhallavägen, Svezia) è stato utilizzato per calcolare speciazione metallico dei componenti pbw elencati nella tabella 1. (Aq) = acquosa in contrapposizione alla forma solida di tale specie.

Tabella 3:. Le concentrazioni dei contaminanti in mezzi concentrazioni dei contaminanti prioritari (mg / L) nel controllo EMEM-1x (EMEM), non trattata PBW, CuO-NP trattati PBW, PBW non trattato + media e PBW + supporti CuO-NP-trattati dopo l'aggiunta di componenti multimediali (n = 3) sono stati valutati per garantire cambiamenti nella concentrazione di contaminanti a causa di trattamento sono stati rappresentati in PBW + supporti non trattati e PBW CuO-NP-trattati con + supporti applicati a cells.

Tabella 4: Calcolo di IC _50. La IC ₅₀ rappresenta la concentrazione di PBW greggia + supporti o PBW CuO-NP-trattati + supporti necessari per una inibizione del 50% della redditività.   La vitalità percentuale nel giorno 5 per cellule HEK e HEP esposte a diluizioni di greggia PBW + supporto (A) o CuO-NP-trattati PBW + supporto (B) sono stati utilizzati per calcolare la concentrazione di inibizione metà massimale (IC _50).

Precedenti studi hanno segnalato che CuO-NP rimosso l'arsenico dalle acque sotterranee ^11,13,30,31. Questo studio supporta questi risultati precedenti e anche rapporti che CuO-NP rimuovere i contaminanti aggiuntivi da PBW. Questo studio conferma anche precedenti relazioni che CuO-NP sono efficaci a rimozione dell'arsenico, nonostante la presenza di altri contaminanti e potenziali ioni concorrenti ^11. Modellazione speciazione ha previsto che il 97% delle specie di vanadio in PBW sono a carica negativa, permettendo per assorbimento di CuO-NP, e il trattamento dei lotti rimosso il 92% di vanadio.

Questo è il primo studio per studiare gli effetti di rimozione di contaminanti specifici da PBW utilizzando CuO-NP, e poi valutare le modifiche citotossicità associate alla rimozione. I risultati dimostrano che indagare le variazioni di citotossicità di miscele complesse utilizzando un approccio in vitro può essere possibile, ma questi metodi non sono senza limiti. PBW non poteva essere utilizzato fforza ull sulle cellule, perché per sopravvivere, cellule coltivate richiede un supporto di crescita definita e osmolalità specifico. Supporti pbw + non potrebbero anche essere utilizzati sulle cellule senza regolazione del pH. Il pH della PBW era 7,31 prima e 7,36 dopo il trattamento tuttavia; l'aggiunta di componenti terreni di crescita ridotto il pH a circa 6,8, a seconda della diluizione. La regolazione del pH è un passo normale nella preparazione di colture cellulari tuttavia; la regolazione del pH delle pbw + supporto può aver alterato le interazioni molecolari delle specie elementi con i componenti Media. Non trattata e CuO-NP trattati PBW sono stati combinati con terreni di crescita EMEM-10X concentrata in varie proporzioni per ottenere le soluzioni di prova (PBW + media). Analisi ICP-MS è stata eseguita su supporti di prova per verificare che le concentrazioni di metalli colpite dagli CuO-NP-trattamento (arsenico, rame, selenio, uranio, vanadio) erano a concentrazioni previste dopo diluizione da componenti media e regolazione osmolalità. La diminuzionein arsenico, selenio e vanadio dopo CuO-NP-trattamento si riflette nelle differenze di concentrazione tra PBW non trattato + media e la PBW CuO-NP-trattati con + media. Le concentrazioni di uranio sono più alti nel PBW CuO-NP-trattati con + supporto del previsto. Dati ICP-MS (Tabella 1) suggerisce che più l'uranio è stato rimosso dalla PBW durante il trattamento CuO-NP quanto previsto da modelli. Modellazione Speciation (Tabella 2) prevede che a pH 7,3, solo 35,5% delle specie di uranio sono caricate negativamente. Il modello prevede che la specie principali di uranio, uranil carbonato di calcio (Ca ₂ UO ₂ (CO _{3) 3),} è neutrale.

La rimozione osservata 78% di uranio è probabilmente dovuto ad una combinazione di adsorbimento uranio e precipitazioni (come carbonato di minerale di uranile calcio). Sulla base della modellazione geochimica, la percentuale di uranio rimosso per adsorbimento è inferiore calcolato consentendo una maggiore concentrazione nel CuO-NPPBW -treated + media. Il meccanismo di rimozione dell'uranio da CuO-NP-trattamento non è chiara e non richiede ulteriori indagini. Un aumento della concentrazione di calcio, potassio e magnesio è stato previsto quando PBW inserito EMEM-10x tuttavia; CuO-NP-trattamento non ha prodotto un cambiamento significativo di questi elementi in modo nessuna differenza è stata osservata in non trattati vs PBW CuO-NP-trattati con + media. La tecnica di combinare l'attuale ambientale con i componenti Media è riuscito a rappresentare i cambiamenti osservati in concentrazioni degli elementi a causa di un trattamento; tuttavia la natura ossidata del PBW limitato come potrebbero essere fatte le PBW + media. Nel tentativo di aumentare la concentrazione massima degli elementi in mezzi di test, polvere mezzi di coltura delle cellule è stato originariamente mescolato con greggia e CuO-NP-trattati PBW fare PBW + supporto. I media in polvere spesso determinato la precipitazione di sali di calcio e aumentato la sull'osmolalità del PBW + mezzi che ha richiesto una maggiore diluizione con acqua RO, producendo concenzioni vicini a quelli ottenuti con 10x liquidi. Questi problemi sono molto probabilmente PBW specifico per il suo stato ossidativo e non può essere un problema con altre miscele meno sensibili.

Il saggio MTT è stato scelto per valutare citotossicità perché è una riconosciuta saggio ad alta prestazione standard che valuta la salute generale delle cellule misurando l'attività mitocondriale. Questo metodo presenta vantaggi e svantaggi. Il formato a 96 pozzetti è utile per ottenere più punti dati tuttavia; la maggior parte delle cellule al giorno 5 erano malsano cercando, arrotondato e non più collegato alla piastra. Le foto in figura 2 sono state prese prima che il supporto è stato rimosso con un aspirapolvere; l'aspirazione al largo i mezzi di comunicazione, e poi aggiungendo la soluzione MTT potrebbe aver rimosso le cellule senza legami o distaccato cellule scarsamente aderenti, contribuendo al pianoro complessiva del segnale MTT dopo Day Two visto con trattata PBW. Il presupposto è che le cellule flottanti sono morti o moribondi e oolo le cellule attaccate sono valutate utilizzando questo metodo. E 'anche importante considerare i limiti del saggio MTT rispetto a studi usando nanoparticelle.

Precedenti studi hanno segnalato che, quando direttamente applicato a cellule in coltura, le nanoparticelle possono avere tossicità intrinseca, al di là di loro proprietà chimiche di base, a seconda delle loro caratteristiche fisiche uniche, come le dimensioni e la forma ^32,33. In questo studio, non abbiamo applichiamo la CuO-NP direttamente sulle celle. Invece, le cellule sono state esposte a PBW che erano stati precedentemente trattati con CuO-NP, centrifugato per rimuovere la maggior parte del CuO-NP e poi filtrato due volte per rimuovere più CuO-NP prima della PBW è stato utilizzato per preparare PBW + supporto. I risultati MS hanno mostrato un aumento del rame dopo il trattamento. Questo potrebbe essere ioni di rame che sono stati disciolti dalle nanoparticelle durante il trattamento o CuO-NP che possono essere passati attraverso le fasi di centrifugazione / filtrazione a rimanere nel trattato PBW used per rendere il PBW + media. CuO-NP variare nel formato da 12-18 nm con una BET misurata superficie di 85 ± 1 m ² / g ¹¹ ma sono noti per aggregare e basato sul minimo aumento delle concentrazioni di rame nel PBW trattata, la maggior parte del rame indipendentemente della sorgente viene rimosso dopo centrifugazione e filtrazione. La conferma visiva di salute delle cellule migliorata e confluenza supporta i risultati del saggio MTT di migliorata viabilità dovuti al trattamento CuO-NP della PBW (Figura 2). Futuri studi che utilizzano altri metodi in grado di valutare (o caratterizzare) effetti confondenti simili causati da CuO-NP.

Cellule renali embrionali umane (HEK 293) e Human carcinoma epatocellulare (HEP G2) sono stati scelti per i test di tossicità. Queste sono linee cellulari standard che sono clinicamente rilevanti per metallo pesante tossicità d'organo ^24,25,34-40. Una bassa densità di semina è stata utilizzata per i saggi MTT. Le cellule sono state seminate a 500 cellule / pozzetto, permesso di recuperarneper 24 ore, e quindi esposto ai mezzi di prova. La bassa densità di semina è stato necessario per ottenere una curva di crescita con una fase di log in giro giorno 5, prima di diventare over-confluenti e fissi il giorno 6 o 7. Chakraborty et al. (2010) ha riferito che in uno studio della tossicità del cadmio su reni coltivate le cellule del tubulo prossimale (PTC), confluenza e lo stato di proliferazione (proliferazione vs. riposo) interessato la risposta all'esposizione al cadmio: cellule sub-confluenti proliferanti mostrato più di citotossicità confluenti (quiescenti), le cellule. Cellule HEP e HEK esposti a PBW ad un concentrazioni più elevate (maggiori di confluenza) simili a quelli utilizzati per altri test (risultati non mostrati) non mostrano robusti mutata morfologia visto con il saggio MTT. Sono necessarie ulteriori indagini sulle variazioni di citotossicità utilizzando linee cellulari non aderenti o protocolli che raccolgono e raccolgono tutte le cellule (ad esempio Citometria a flusso).

Un'altra limitazione del metodo MTT in studi americaninanoparticelle zione è che alcuni tipi di nanoparticelle possono interferire con la nutrizione cellulare. Terreni di coltura cellulare in genere contengono fonti proteiche aggiunto, come siero fetale bovino (FBS), per integrare la crescita cellulare. Studi hanno dimostrato che l'ossido di metallo nanoparticelle possono esaurire importanti componenti della crescita in FBS, a causa della maggiore capacità di assorbimento delle nanoparticelle. Nanoparticelle di ossido di metallo hanno dimostrato di collegamento a FBS attraverso un'interazione con calcio ^41. A seconda del pH della soluzione, nanoparticelle metalliche possono portare una carica positiva o negativa. Studi di citotossicità hanno dimostrato che nanoparticelle metalliche aggiunte colture cellulari assorbono cationi, tra cui Ca ^2+, e quindi rimuovere FBS / albumina sierica attraverso il legame del complesso NP-Ca ²⁺ al siti proteine ​​nel FBS legame calcio. Questo diminuisce la concentrazione di Ca ²⁺ e FBS dal supporto, essenzialmente fame le cellule e aumentare la citotossicità attribuito al nananoparticelle di ^41. Inoltre, pre-esposizione di nanoparticelle a FBS / Ca ²⁺ ricoperto le nanoparticelle, diminuendo il loro effetto citotossico. Tuttavia, non abbiamo esporre direttamente i mezzi di comunicazione di CuO-NP. Inoltre, nessuna diminuzione significativa di Ca ²⁺ concentrazioni sono stati osservati in PBW dopo il trattamento con CuO-NP, indica nessun assorbimento significativo di Ca ²⁺ sulla CuO-NP li adescamento di legarsi con il FBS. Tuttavia, la concentrazione di calcio nel PBW è abbastanza alto che una diminuzione nanoparticelle indotta può non essere evidente. E 'ancora poco probabile che il CuO-NP utilizzato in questo studio sono assorbendo grandi quantità di calcio durante la lavorazione, perché non c'era alcuna diminuzione nelle capacità di assorbimento di arsenico di CuO-NP in PBW, che contiene alti livelli di calcio rispetto a studi precedenti con le acque sotterranee con un calcio minori concentrazioni ^13.

I dati dimostrano che CuO-NP rimuovere l'arsenico, selenio e di vanadio uranio, e questo è associato con una migliore vitalità cellulare HEK e HEP nel saggio MTT. Il meccanismo di (s) con cui redditività è migliorata deve essere ancora determinato, ma potrebbe essere dovuto alla rimozione dei contaminanti prioritari da CuO-NP, tra gli altri meccanismi. L'attuale studio dimostra anche che i metodi di coltura cellulare standard possono essere utilizzati per valutare l'efficacia di un metodo di trattamento delle acque di nanoparticelle ISR, consentendo potenzialmente una serie di studi meccanicistici da completare, prima di trasferirsi negli studi su animali in vivo più costose e che richiedono molto tempo in . Inoltre, CuO-NP può rivelarsi più versatile per i processi di estrazione e per il trattamento di miscele di metallo rispetto adsorbenti convenzionali, come gli ossidi di alluminio, ferro, titanio e manganese, poiché CuO-NP non richiedono la regolazione del pH o ossidazione di acqua per la rimozione arsenico e CuO-NP rimuovere sia arsenito e arseniato in presenza della competizione anioni fosfato, silicato e solfato. Inoltre, CuO-NP può essere rigenerato e ri: utilizzato, riducendo i costi dei reagenti e la quantità di sottoprodotti speso rifiuti trattamento che necessitano di smaltimento ^12.

I potenziali limiti del protocollo MTT sono la bassa densità delle cellule al momento di esposizione, il distacco delle cellule e perdita di segnale, la fame delle cellule e l'esposizione diretta delle cellule alla CuO-NP alterazione MTT reattività. Densità cellulare e problemi di distacco possono essere risolti utilizzando un test alternativo come la citometria a flusso, che consente densità di semina elevate nonché la raccolta di tutte le cellule (cioè, sia galleggianti e allegato). Domande fame cellulare potrebbero essere valutati misurando le concentrazioni di fattore di crescita nei media periodicamente durante il trattamento. I lavori futuri si concentreranno su come applicare l'attuale protocollo di diversi saggi di citotossicità, che affronterà, se possibile, CuO-NP esposizione alterata attività dosaggio, misure di inedia cellule durante il trattamento e testare anche la capacità di CuO-NP per rimuovere contaminazionenti e influenzano la citotossicità di altri tipi di miscele complesse, come i rifiuti dai siti Superfund e stagni di smaltimento dei rifiuti. Tali studi potrebbero anche affrontare se i metodi erano robusti in varie impostazioni.

The authors have nothing to disclose.

We thank Dr. Roger Hopper and the Wyoming Department of Agriculture, Analytical Services Lab for the mass spectroscopy analysis of our samples. We would like to express our gratitude to the University of Wyoming, School of Pharmacy for allowing us to video this protocol in their laboratories. We would also like to thank the Theodore O. and Dorothy S. King Endowed Professorship Agreement for their graduate assistantship (SC), the University of Wyoming for the Graduate Assistantship support (JRS), and the Science Posse (NSF GK-12 Project # 084129) for the teaching fellowship (JRS). We would also like to thank Uranium One for allowing us to obtain samples and assisting us with questions. This work was supported by the School of Energy Resources, University of Wyoming.