途上胚性マウス心臓弁地域からのタンパク質の単離

The analysis of protein expression in young embryonic mouse valves has been hampered by the limited tissue available. This manuscript provides a protocol for preparing protein from developing embryonic mouse valve regions for western blot analysis.

Western blot analysis is a commonly employed technique for detecting and quantifying protein levels. However, for small tissue samples, this analysis method may not be sufficiently sensitive to detect a protein of interest. To overcome these difficulties, we examined protocols for obtaining protein from adult human cardiac valves and modified these protocols for the developing early embryonic mouse counterparts. In brief, the mouse embryonic aortic valve regions, including the aortic valve and surrounding aortic wall, are collected in the minimal possible volume of a Tris-based lysis buffer with protease inhibitors. If required based on the breeding strategy, embryos are genotyped prior to pooling four embryonic aortic valve regions for homogenization. After homogenization, an SDS-based sample buffer is used to denature the sample for running on an SDS-PAGE gel and subsequent western blot analysis. Although the protein concentration remains too low to quantify using spectrophotometric protein quantification assays and have sample remaining for subsequent analyses, this technique can be used to successfully detect and semi-quantify phosphorylated proteins via western blot from pooled samples of four embryonic day 13.5 mouse aortic valve regions, each of which yields approximately 1 μg of protein. This technique will be of benefit for studying cell signaling pathway activation and protein expression levels during early embryonic mouse valve development.

タンパク質発現レベルを同定および定量化することができることは、動物 - 、および細胞ベースの実験のための標準的な技術である。しかし、開発中にこの特定の組織におけるタンパク質発現を評価し、初期胚心臓弁の開発における長年の関心にもかかわらず、現在、ヒヨコとマウス^1,2の両方で免疫組織に限定されている。ほとんどのモデル生物（ 例えば 、ニワトリおよびマウス）の現像バルブにおけるタンパク質発現を定量化することの難しさの一部を得ることができるタンパク質の量を制限するバルブのサイズが小さいことである。このように、定量分析のために、研究者は、一般的に、その後の定量的PCRやマイクロアレイ解析^2-5 RNA抽出と増幅に依存しています。しかし、RNAおよびタンパク質発現レベルが⁶完全相関ではないため、RNA発現に焦点を当てたことは、任意のシグナル伝達に発生する多数の変更を厳密にアカウントを提供することはできません開発中のさまざまな時間での経路。現在利用可能な方法でこの制限に基づいて、この手順の目的は、確実に重要であるさまざまなシグナル伝達経路に発生する変化の定量分析のための現像マウス胎児心臓弁領域からのタンパク質の十分な量を得るためのプロトコルを開発することであったこの組織の成熟。

胚弁はすでに一般的にRNAの単離およびその後の遺伝子発現解析^2-5マウスから解剖されています。しかし、これらの研究は、下流のシグナル伝達に影響を与える可能性が翻訳後タンパク質修飾を検出する検出を許可していない経路の活性化をシグナル伝達の読み出しなどの遺伝子発現を使用することに限定されている。出発点として、RNA単離技術を用いて、関心領域を解剖始まった。私たちの関心は、パットのシグナルを示していたリン酸化タンパク質を検出したため大動脈弁の開発（E13.5-14.5）の特定の期間にhway活性は、私たちはリン酸塩を含まないトリス緩衝液内のすべての解剖を実施し、ホスファターゼおよびプロテアーゼ阻害剤を用いたトリスベースの溶解緩衝液中でバルブを集めた。私たちの特定の場合において、唯一の大動脈弁領域は、収集されたが、肺動脈弁領域を容易に同時に得ることができた。弁領域は、その後、現在成人の心臓弁⁷におけるタンパク質発現を研究するために使用されるサンプル緩衝液でホモジナイズした後、混合した。少量の試料（ 例えば 、2μl）を使用し、同じ遺伝子型を持つ胚からバルブ領域をプールすることで、私たちは胎生13.5 ⁸でリン酸化および非リン酸化タンパク質を検出することができた。弁領域が凍結し、溶解緩衝液中で保存することができるので、プールする前に、必要に応じて、胚を遺伝子型を決定することができる。

この技術は、細胞signalinを評価するための利用可能なツールのセットを広げるグラム開発中の経路とは、具体的には発展途上心臓弁のために、免疫組織化学への定量的な賛辞を提供しています。この技術は発達心臓専門医にも限定された組織が含まれていた領域に興味を持っている初期段階の胚を扱うすべての発達生物学者のみならず有益である必要があります。

注：全ての実験は、ノースカロライナ大学チャペルヒル校で施設内動物管理使用委員会によって承認された。

1消費税大動脈弁

1. 興味のある胚の段階のために承認された安楽死の技術を使用して、開発の目的の胚日（E）で子犬を妊娠マウスを安楽死させる。
2. 妊娠中の女性の腹部を滅菌する70％エタノールを使用してください。下腹部の皮膚と筋肉を持ち上げ、離れて内臓から、および子宮角へのアクセスを許可するように、女性の下腹部キャビティを開い解剖。
3. 子宮角を取得するには、鉗子の鉗子で子宮頸部、慎重にカット尾を開催しています。所定の位置にホーンを保持し、任意の結合組織を切断、子宮角を持ち上げ、卵管と子宮角の接合部を切断して削除を完了。
4. コルを含むペトリ皿に解剖子宮角を置きdは、0.1Mトリス緩衝液（pH7.6）で、必要に応じてすすぎます。その後、胚嚢を露出するために子宮角開放長さ方向をカット。
5. 胚を公開するには、胎盤や胚の接合部での胚嚢を開いてカットし、胚を解放するために臍帯血管を切った。冷たい0.1Mトリス緩衝液で二ペトリ皿に解剖した胚を置きます。次の胚の準備ができるまで氷に残りundissected胚を持つ最初のペトリ皿を返します。
6. 胚内の胸壁へのアクセスを改善するために、胚を首を切る。遺伝子型決定が必要な場合は、削除し、氷上に置いエッペンドルフチュー​​ブに余分な組織片を保存する。
7. その背中に胚を置き、前肢の近くで、胸郭の側面に沿って垂直に胸壁をカットし、水平方向に振動板の上に心を視覚化する。その後、心臓を露出させ、胸壁を開きます。
8. 大血管に沿って高く保持するために鉗子を使用して、鉗子を用いて心臓を持ち上げ、下の血管を切る。ザ·nは、心を解放するために鉗子の上にカット。肺血管が切断されていない残っている場合、肺は心で除去してもよいし、続行する前に削除する必要があります。
9. カットし、バルブのレベル以上の肺動脈を取り除く。明細書に記載の胚の段階で、肺動脈弁領域からその区別に役立つ、これわずかに不透明である。肉柱心室筋を避け、単に肺動脈弁の下にカットし、ステップ1.10で説明したように、この領域に関心がある場合にも収集しています。ここで、次のステップで、離れて溶解緩衝液中に収集する前に、関心領域からの過剰のトリス緩衝液を描画するために毛管作用を使用。
10. 慎重にちょうどバルブのレベルを超えて、大動脈弁に大動脈遠位を削除。肺動脈のように、大動脈はその除去を助ける、これらの胚の段階でわずかに不透明のまま。再び肉柱心室筋を避け、ちょうど大動脈弁の下にカットして、転送する氷上でプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を含む（材料表に記載）を2μlの溶解緩衝液をエッペンドルフチュー​​ブに鉗子を使用してバルブ。
11. バルブは別個のエッペンドルフチュー​​ブに各バルブを集め、すべての胚から切除されるまで繰り返します1.6から1.10を繰り返します。すべての胚が同じ遺伝子型を持っている場合は、すべてのバルブは、単一のエッペンドルフチュー​​ブに収集することができる。
12. 遺伝子型決定は、一緒にプールするバルブかを決定するために実行される場合には、直ちにさらなる使用まで-80℃で溶解緩衝液中に試料を置く。次に、試料を（ステップ2.1.1）を遺伝子型決定した後にプールすることができる。

2タンパク質抽出

1. チューブの底に溶解緩衝液中で組織を収集するために1分間13,100×gで遠心し、氷上に採取した組織を解凍する。
   1. 胚を遺伝子型決定した場合は、ゆっくりと類似の遺伝子型を持つ胚からバルブ領域を含有する溶解緩衝液を収集し、プールするために、ピペットを使用しています。強いBを確実にするために、そして、サンプルあたりE13.5胚から3-​​4バルブ領域をプールすることをお勧めします。
   2. すべての胚が同じ遺伝子型のものであり、すべてのバルブ領域がステップ1.10で一緒に収集された場合は、ステップ2.2で説明したように、サンプル全体を溶解。
2. 結果としてプールされた試料の体積をチェックして、40μlの全量を溶解バッファーを追加します。次に、エッペンドルフチュー​​ブ5mmのステンレススチールビーズを用いて試料を破壊し、均質化する。メーカーの指示に従って、50 Hzで2〜4分間Lyser装置を操作します。不溶性の残骸を残す新しいチューブに短時間スピンチューブ、（1分間〜13,100×g）で、転写サンプル。
3. そのようなEslami ら ⁹などのプロトコルに従って、その後のウエスタンブロット分析のために準備し、SDS-PAGEおよび転送のための独立したサンプル。ローディング対照タンパク質をブロッティングするタンパク質定量のために必須である。

この調製技術を用いて、E13.5胚からの単一の大動脈弁の領域にリン酸化されたSmad ^{1,5,8（pSmad）}を検出することができた。 図1Aに示すように、単一の弁領域から単離されたタンパク質は、かすかなpSmadバンドを検出するのに十分である。信号強度は、プールされ、弁領域の数に比例して増加する。重要なことは、pSmad /βアクチン比率が異なるサンプルサイズ（ 図1C）間でほぼ一定のままである。 、利用可能なタンパク質の低レベルに、同じブロットを剥離することができず、合計のSmadのために再プローブ。しかし、独立した合計のSmad 1を示すブロットおよびβ-アクチンが同じ発現パターン（ 図1B）を示す。

これらの弁領域は、心室心筋の汚染ほぼ完全に欠いている。右心室のサンプルと組み合わせてこの調製技術を用いて、ventricを検出することができなかったウラル大動脈弁領域における心筋マーカーANP、このマーカーは容易に心室（ 図2）で検出されたのに対し。さらに、心室の心筋マーカーミオシン軽鎖2Vも容易に心室試料中で検出されたが、大動脈弁の領域でほとんど検出されている。これらの結果は、解剖の正確さをサポートしています。

胚の大動脈弁の領域における図1のSmadのリン酸化。サンプルを1サンプルあたり4弁領域の範囲に、プールされた胚性マウス大動脈弁領域の数の増加を調製した。各サンプルは、25〜28μlの総容積全体弁領域（単数または複数）から単離された全てのタンパク質を含む。調製した組織は、その後、リン酸化Smad1,5,8（pSmad）（Aためにウェスタンブロット分析に供した）、全酸化Smad1（C）、およびβ-アクチン（A、C）。タンパク質はルミジェンECLウルトラを用いて検出し、UVMはVisionWorksソフトウェアで画像化した。 pSmadおよびβ-アクチンのバンド強度をImageJソフトウェアを使用して、（B）において定量されるように、出発物質の量に比例する。提示されたデータは、平均値と2つの独立したブロットの標準偏差である。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2大動脈弁領域は、心室心筋マーカーを発現しない。サンプルは、またはで1からの試料あたり4弁領域の範囲に、プールされた胚性マウス大動脈弁領域の数の増加を調製した右心室のサンプル。試料は、 図1で説明したように処理され、心室心筋マーカーANP（A）およびミオシン軽鎖（MLC）-2V（B）についてブロットした。 ANPは完全心室サンプルに制限され、MLC-2vの心室サンプルに比べて非常に低いレベルで発現される。 β-アクチンをローディング対照として示す。

初期胚のマウスとニワトリの心臓弁領域中のタンパク質レベルを定量化する能力は、バルブの開発のための重要な細胞シグナル伝達事象を理解するための追加のツールを提供しています。明細書に記載の当社のプロトコルは、標準的なタンパク質単離手順から大きく異なるものではない。しかし、いくつかの重要な手順を変更することによって、私たちは非常に小さなサンプルサイズからリン酸化タンパク質を得ることに成功しました。この結果を達成するために、以下の手順が特に重要である。その品質のタンパク質が得られることを確認するためには、氷の上またはプロテアーゼの存在と、必要に応じて、ホスファターゼ阻害剤で、氷のように冷たいバッファを使っているかどうか、チルドサンプルを維持することが重要です。さらに、少量の試料を処理するように設計されたデバイスとの均質化が十分に細胞膜を破壊するために不可欠である。でも、これらの注意事項、タンパク質の得られた収率は、分光光度計で、ブラッドフォードアッセイによって検出できないほど低いことがあるまたは静止タンパク質定量キットとは、その後の分析のために利用可能なサンプルを持っている。私たちは、それぞれの大動脈弁領域は7大動脈弁領域をプールし、定量化のために、サンプル全体を使用することにより、約1μgのタンパク質の含まれていることを決定することができた。前の定量化の欠如は、ローディングコントロールが不可欠になるものの、この制限にもかかわらず、十分なタンパク質は、リン酸化および非リン酸化タンパク質を検出するために得られる。それは私たちでさえ、膜を何度も剥離した後にそれを検出することができ、高存在量のタンパク質が、あるので、私たちは、具体的には、β-アクチンを利用した。その分子量は、対象の私達のタンパク質異なっ;それは普遍的に発現されている。プールされたサンプル数の異なる裁判ウェスタンブロットは、開発の他の段階で、または関心のある他の小さな組織のための胚の心臓弁領域のいずれかのためにプールしなければならないか、多くの組織を決定することをお勧めします。また、私たちは、少なくとも3つのtはプーリングお勧め各タンパク質サンプルの発行サンプルは、解剖組織の大きさ、ならびに各胚を解剖前に氷上​​に座った時間の長さの変動を考慮する。目的のタンパク質は偶数サンプルをプールした後にウェスタンブロットによって検出することができない場合は、試料体積を減少させ、すべての潜在的なタンパク質は、検出のために使用可能であることを保証するために均質化時間を増加させることをお勧めします。さらに、プロテアーゼ阻害剤はまた、不安定なまたは容易に分解されたタンパク質のための解剖中に氷冷したトリス緩衝液に添加してもよい。目的のタンパク質を低レベルで発現される場合、実験のウェスタンブロット部分の間に追加のトラブルシューティング、一次抗体インキュベーションまたは基板検出調整方法として、視覚化を助けることができる。

証拠（ 例えば 、免疫組織化学またはin situハイブリダイゼーション ） は、目的のタンパク質は、心臓弁およびsurrouの両方で発現していることを示唆している場合心筋をnding、大動脈や肺動脈心筋でもE12.5胚⁵からのバルブから、タングステン針をそっと離れてからかったことができます。この追加のステップは解剖の時間を長くし、重要な技術的難易度が追加されますので、必要な場合にのみ、私たちはそれを利用することをお勧めします。当社独自の研究では、Smadのリン酸化が唯一の弁間葉で変更されたことを示した免疫組織化学的分析から始まった。こうして、私たちは、ウエスタンブロットを介して観察違いがバルブ間充織⁸における発現の変化によるものであったことを確信しました。発展途上流出路弁はそのようなANPまたはMLC-2vの心室の心筋特異的抗体を用いて、心室汚染の制御ブロットを行って、大血管および心室の接合部に座っているのでさらに、お勧めします。

バルブは彼らの開発中に劇的な再編成を受けているため、私たちは次の段階特異Rを提供していますクッション/バルブとその周囲の組織のためのecommendations。初期のクッション（E9.5-11.5）の場合は、流出路と房室クッションの両方が簡単に起因する心筋¹⁰の半透明に可視化し、解剖;しかし、これらの胚は、小さな、そして解剖針は鉗子とmicroscissorsするのではなく、推奨されている。中段分化^{（E12.5-14.5）10}については、半月弁（ すなわち 、大動脈と肺動脈弁）は、より容易にアクセス可能房室弁（ すなわち 、僧帽弁および三尖弁）よりとなります。大動脈と肺動脈がseptatingとこの時間枠^11,12の間に回転しているので、半月弁は慎重に解剖しなければなりません。慎重な注意が大動脈および肺動脈の基部の回転に与えられるべきであり、これらの動脈の中点を一貫して識別されるべきである。バルブの成熟と凝縮（の後期の段階でE15.5以降^）10、僧帽弁および三尖弁離れ心室内部からからかわすることができます。しかし、半月弁は、より簡単にアクセスできる必要があります。

ウェスタンブロット分析は、生検サイズが大きい大人の心臓弁¹³におけるタンパク質発現レベルを定量するための長年の技術である。対照的に、無料の初期胚の分析は、単離されたmRNAの小出発量の分析の前に増幅することができる転写PCRを、タンパク質発現を検出するか、または逆転させる非定量的免疫組織化学のどちらかに焦点を当てている。これらの現在用いられている技法は、シグナル伝達および遺伝子発現の変化に関するいくつかの適切な情報を提供するが、定量的にタンパク質レベルを評価する能力を欠いている。このプロトコルにより、当社は現在、定量的mRNA発現データおよび免疫組織化学的分析と相関することが定量的なタンパク質発現データを追加することができます。

このプロトコルの賛辞は、胚心臓弁および撮像タンパク質発現からmRNAを単離する技術を確立しました。このように、これらの技術を組み合わせることmRNAからの翻訳後タンパク質修飾に、上方のより完全な分析のために、およびダウンレギュレーションシグナル伝達経路を可能にする。さらに、この技術は、現在利用され、免疫組織化学技術を強化するタンパク質の発現の定量を可能にする。一緒に、私たちは、この技術が心臓弁に興味または定量的ウェスタンブロット解析のために、他の、特に小さな組織外植片を準備するあらゆる研究者のために興味を持ってもらえるでしょうと信じています。

The authors have nothing to disclose.

We would like to thank Andrea Portbury and Davin Townley-Tilson for critical reading of the manuscript and the NIH (grant # R01HL061656) for funding support.