成長アッセイ酵母におけるポリグルタミン毒性を評価する

本稿ではポリグルタミンの毒性を評価するための3つの相補的なプロトコル（polyQ）拡張酵母のタンパク質について説明します。サッカロマイセスセレビシエ。これらのプロトコルは、簡単に酵母内の他のミスフォールドタンパク質の毒性を監視するために変更することができます。

タンパク質の折り畳みは、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病¹など多くのヒトの疾患、特に神経変性疾患、関連付けられています。ハンチントン病（HD）は、タンパク質ハンチンチン内のポリグルタミン（polyQ）領域の異常な拡大によって引き起こされます。 polyQ -拡張ハンチンチンタンパク質が異常なコンフォメーション（つまりmisfolds）を達成し、細胞毒性^2を発生します。少なくとも8つの更なる神経変性疾患は、脊髄小脳性運動失調とケネディ病^3を含むpolyQ -拡張によって引き起こされる。

モデル生物の酵母の影響内および分子間polyQ毒性の要因とpolyQ膨張を発現する細胞で損なわれている細胞経路の識別を含む、polyQ毒性の細胞および分子基盤に重要な洞察を容易にしましたタンパク質^3-8。重要なLYは、酵母で発見されたpolyQ毒性の多くの側面は、このようにpolyQ毒性を支える基本的なメカニズムの発見のための酵母モデルの意義を実証し、他の実験システムやHD患者からのサンプルである程度再現された。

酵母でpolyQ毒性を決定するために直接、比較的簡単な方法は、polyQ膨張タンパク質を発現する酵母細胞の増殖の欠陥を測定することです。本稿ではpolyQ膨張タンパク質を発現する酵母細胞の増殖を測定することにより、酵母でpolyQ毒性を決定するために3つの相補的な実験的アプローチを説明しています。最初の二つの実験的アプローチは、プレート上で酵母の増殖を監視し、第三のアプローチはBioscreenC楽器を用いた液体酵母培養物の増殖を監視します。

さらに、この原稿は、酵母polyQモデルを扱うときに発生する可能性のある実験的な難しさを説明し、または回避するのに役立ちます戦略を概説しこれらの問題を最小限に抑えることができます。ここで説明したプロトコルが識別するために、遺伝的経路とpolyQ毒性を調節する小分子を特徴付けるために使用することができます。また、記載のアッセイは、酵母のモデル内の他の疾患に関連したミスフォールドタンパク質によって引き起こされる毒性の正確な分析のためのテンプレートとして機能する可能性があります。

1。酵母における有毒PolyQ膨張タンパク質の発現

体系的な分析は、酵母⁷で毒性を生成するために必要とされるpolyQ膨張タンパク質の正確なアミノ酸配列を確立しています。この有毒polyQ膨張タンパク質は、図を参照して、ハンチンチンタンパク質、polyQ領域、およびカルボキシ末端融合の元の配列からの蛍光タンパク質（GFPまたはCFPのいずれかに17個のアミノ酸に続いて、アミノ末端FLAG-タグが含まれています。 1）。誘導性と相対的な強力なGAL1プロモーター^7、9の制御下で発現した場合46グルタミン以上のpolyQ膨張を有するタンパク質の発現は、（72と103グルタミンなど）酵母の毒性を生成します。

前述のように、酵母でpolyQの毒性は、そのプリオンの立体構造のタンパク質Rnq1pを運ぶ細胞でのみ明らかである、[RNQ +]例えば、酵母菌株W303 ^9。毒性polyQ膨張蛋白質RecapitulatesなどpolyQ長さに依存した毒性（下記参照）と集約（図1 b）のように酵母でpolyQ - 生物学の中心的な側面を、。特に、毒性polyQ膨張タンパク質は、すぐに酵母細胞を死滅させず、むしろ損なうまたは細胞周期や細胞ディビジョンを逮捕することにより、プレートまたは液体培養（未発表データ）上に酵母のコロニーの成長を減速または阻害する。

2。酵母細胞の潜在的な問題は有毒PolyQ膨張タンパク質を発現する

そうでなければ毒性polyQ膨張タンパク質を発現する酵母細胞は、任意の成長欠陥^9を表示しない場合があります。 polyQ毒性のこれらの抑制の遺伝的性質は、単純なメンデルの変異に基づいてされていないようですので、比較的高い周波数（我々の未発表の結果）で発生することができます。我々は、これらの自発的な抑制は、同様に[RNQ +] polyQ toxicity.Thesを決定する際に機能する正体不明のプリオンの硬化によって引き起こされると推測しているpolyQ毒性の電子自発的な抑制は、polyQ毒性を特徴付けるために、またはpolyQ毒性の修飾子を識別し、特徴づけることを目指して、任意の実験の成功を危うくすることができます。

これらの自発的な抑制の頻発を避けるために、非常に効果的であることが実証されている以下に示す予防策を、次のとおりです。

1. 毒性実験のために新鮮な酵母細胞を使用しています。長時間酵母を保管しないでください。頻繁に凍結ストックから、新鮮な酵母のコロニーを取得します。
2. 頻繁に蛍光顕微鏡で毒性polyQ膨張タンパク質の発現および集計を監視します。
3. 任意の毒性の測定を開始する前にすべての回で毒性polyQ毒性（唯一の炭素源としてグルコースを含有する選択培地でIE）の発現を抑制する培地中で酵母細胞を保持します。
4. 各polyQ毒性実験のために少なくとも3つの独立した形質転換体を使用しています。

3。成長アッセイ

1. 各実験条件については、唯一の炭素源としてグルコースと酵母の選択培地3 mlの毒性polyQ膨張タンパク質を保有する酵母細胞の3つの独立した形質転換体から各コロニーを接種する。
2. 30℃で一晩これらの培養物をインキュベート℃に培地中のグルコースは、それらの発現を抑制するので、これらの条件下で、細胞がpolyQ膨張タンパク質を発現されていません。これらの培養物の生い茂るさせてはいけません。1以下の一晩培養物のOD _600（600 nmの波長の光の吸光度）を保持します。
3. 我々は日常的に有毒なpolyQ膨張タンパク質を発現する酵母細胞の増殖の欠陥を監視するための3つの異なるアッセイを使用します。

プレート上で3.1成長

1. 私は選択的に0.0005のOD _600（すなわち、OD600 = 0.5文化の1:1000希釈）に一晩酵母培養（220 rpmの振盪しながら成長した）で希釈グルコースを含む直径^7。
2. 均等に選択的な唯一の炭素源としてグルコースを含む培地と、唯一の炭素源としてガラクトースを含有する選択培地で1皿で1皿（直径10cm）にそれぞれ希釈した培養液50μlを（CAが得プレート当たり700コロニー）に広がる。
3. 30℃で3〜4日のためにプレートをインキュベートインキュベーション後、各プレートの写真を撮ると、グルコースとガラクトースプレート上のコロニー数のコロニー数をカウントします。非常に有毒polyQ膨張タンパク質（103Q、図2a）を発現する酵母細胞を使用する場合は、理想的な条件下では、ガラクトースプレート上にないか、ごく少数のコロニーがあってはならない。

3.2スポッティングアッセイ

このアッセイは、メッキアッセイは、上記よりも定量的であり、したがって、同じプレート上で同じ実験とpolyQ毒性でも微妙な違いを明らかにすることができます。

1. overnを希釈IGHT文化は、0.1のOD ₆₀₀にグルコースを含む培地で増殖させた。
2. 滅菌96ウェルプレートに、これらの希釈培養の200μlのピペットおよびマルチチャンネルピペットを用いて滅菌水で5つの五倍希釈系列を調製する。
3. 、フロッガーを使用して（また、細胞懸濁液を転送するための8×6ピンで、スポッターと呼ばれる）を唯一の炭素源と唯一の炭素源としてガラクトースと選択培地を含むプレートとしてグルコースと選択培地を含むプレートに細胞懸濁液を転送します。
4. プレートは三から四日間30℃で、それらをインキュベートする前に乾燥することができます。
5. インキュベーション後、各プレートの写真（図2b）を取る。

3.3。液体培養物の増殖によって、酵母のpolyQ毒性を監視する

このプロトコルは、ここで説明した3つのアッセイ（OD600番号）が最も定量的であるとさえpolyQ毒性の非常に微妙な違いを検出することができます。前述のOC自発的抑制のcurrenceしかし、潜在的に誤解を招くような結果を生むことができます。従って私は上述した二つのメッキアッセイの少なくともいずれかで、このアッセイを組み合わせることをお勧めします。我々は、これらの実験のためにBioscreenCインストゥルメントを使用することを提案する。 BioscreenCは、定義された撹拌を使用して定義された温度で培養しながら、自動的に100ウェルプレートで酵母培養液の光学密度を測定する計器です。酵母細胞の成長とその光学密度を測定するための他の方法も適用される場合があります。

1. 唯一の炭素源として3 mlの滅菌水で3回グルコースを含む最少培地から酵母細胞を洗浄します。
2. 0.1のOD ₆₀₀にガラクトースを含む培地で増殖させた一晩培養物を希釈します。
3. 酵母培養の300μlの100ウェルBioscreenCプレートの各ウェルを記入してください。
4. 簡単Bioscreen実験プログラムを開きます。あなたは（空白と培地のみを含む監視するサンプル数を決定するコントロール）は、30℃に温度を設定し、3日に実験の長さを設定、15分に測定間隔を設定し、600 nmのフィルター/ブラウン設定し、で、各測定の前に15秒の揺れのモードを設定中強度。
5. BioscreenC楽器と付属のソフトウェアは、実験中に撮影し、各データポイントのExcelスプレッドシートを生成します。
6. 各サンプルのExcelでの成長曲線を準備し、別のサンプル（図2c）の成長を比較します。 BioscreenC実験によって生成されたデータの分析の詳細な説明は^、10の前に提供されています。

4。代表的な結果

図1。酵母polyQモデル。短い、非毒性polyQを発現する酵母細胞を示す毒性polyQ膨張タンパク質bのa）の模式図）蛍光顕微鏡拡張タンパク質（25Q、左パネル）および酵母細胞は長い間、毒性polyQ膨張タンパク質（103Q、右のパネル）を発現する。

図2。 polyQ膨張タンパク質を発現する酵母細胞の増殖アッセイの代表的な結果。 1）めっきアッセイ約700酵母細胞がプレート上に広げ、30℃で三日間℃でインキュベートした。上部パネルは、グルコース培地を含むプレートを示し、毒性polyQ膨張タンパク質の発現（103Q）が誘導されない 、すなわち。下のパネルには、ガラクトースを含む培地酵母プレートを示し、毒性polyQ膨張タンパク質の発現が誘導される、すなわち。 B）スポッティングアッセイは、ここに示されている実験では、全く自発的な抑制が発生していないことに注意してください。いずれかの非毒性polyQタンパク質（25Q）または毒性polyQ膨張proteiを保有する酵母細胞の5つのシリアル5倍希釈では、N（103Q）は、タンパク質の発現を抑制するグルコースプレート（左パネル）またはそれらの発現を誘導し、ガラクトースプレート上にスポットした。次いで、プレート℃のC）BioscreenC実験を行った。どちらに非毒性polyQタンパク質（25Q）または毒性polyQ膨張タンパク質を発現する酵母細胞の培養物の成長が（103Q）によって監視された30℃で3日間インキュベートした。 BioscreenC楽器。実験条件とBioscreenC実験の解析は、メインテキストに記載されています。

この原稿は有毒polyQ膨張タンパク質を発現する酵母細胞の減少成長に基づいて、モデル生物の酵母でpolyQ毒性を測定する3つの相補的な実験的アプローチについて概説します。酵母での作業は、polyQ膨張タンパク質^9,11,12の折り畳みおよび毒性を含む、タンパク質のミスフォールディングとその後の毒性の基本的な細胞および分子メカニズムに深い洞察を提供してきました。ここで提示されたプロトコルに基づいた実験では、すでにpolyQ毒性^5-8,13,14を支える遺伝子のエンハンサーまたは抑制polyQ毒性の、polyQ毒性の小分子修飾、および細胞メカニズムを識別し、特徴付けるために役立っています。

提示されたプロトコルは、簡単にそのような異なる成長条件またはいずれかpolyQ毒性を減らすか、または悪化させる遺伝子変異としてpolyQ毒性の他の修飾子を探索するように適合させることができます。さらに、提示した実験プロトコル簡単に酵母内の他の有毒なミスフォールドタンパク質の毒性をテストするために調整することができます。

利害の衝突が宣言されません。

Duennwald実験室での作業は、老化研究（遠く）、遺伝病財団（HDF）、ウィリアム·ウッド財団のためのアメリカ連合からの助成金によってサポートされています。