生长实验，以评估在酵母中的多聚谷氨酰胺毒性

这手稿描述了三个评估毒性的多聚谷氨酰胺（polyQ蛋白）扩张蛋白在酵母的补充协议酿酒酵母。这些协议可以很容易地进行修改，以监察在酵母中错误折叠的蛋白质的毒性。

蛋白质错误折叠与人类的许多疾病，特别是神经退行性疾病，如阿尔茨海默氏症，帕金森氏病，亨廷顿氏病^1。亨廷顿氏病（HD），是由异常扩张的多聚谷氨酰胺（polyQ蛋白）区域内的蛋白质亨廷顿。亨廷顿蛋白质的polyQ蛋白膨胀达到异常的构象（即它错误折叠），并导致细胞毒性^2。至少有八个进一步的神经退行性疾病造成polyQ蛋白的扩展，包括脊髓小脑性共济失调和肯尼迪的疾病^3。

模式生物酵母促进polyQ蛋白毒性的细胞和分子基础的重要见解，包括polyQ蛋白毒性内和分子间的因素的影响，并在细胞受损的细胞通路的识别表达polyQ蛋白膨胀蛋白质^3-8。重要polyQ蛋白毒性在酵母中发现的许多方面，LY，复制在其他的实验系统，并一定程度上在血液透析病人的样本，从而表明polyQ蛋白毒性支撑的基本机制的发现酵母模型的意义。

直接和相对简单的方法来确定polyQ蛋白在酵母毒性是衡量表达polyQ蛋白膨胀蛋白质的酵母细胞的生长缺陷。这手稿描述了三种互补的实验方法，确定酵母测量表达polyQ蛋白膨胀蛋白质的酵母细胞的生长，polyQ蛋白毒性。前两个实验方法监测酵母的生长，对板的第三种方法监测液体酵母文化使用BioscreenC文书的增长。

此外，这个手稿描述实验处理酵母polyQ蛋白模型时可能出现的困难，并概述了战略，这将有助于避免或最大限度地减少这些困难。这里所描述的协议，可以用来识别和特征的遗传途径和调节polyQ蛋白毒性的小分子。此外，所述的检测可以作为模板在酵母模型由其他疾病相关的错误折叠的蛋白质引起的毒性的准确分析。

1。 polyQ蛋白膨胀有毒蛋白在酵母中的表达

系统分析建立了一个polyQ蛋白膨胀蛋白所必需的生产在酵母中的毒性⁷精确的氨基酸序列。这种有毒的polyQ蛋白膨胀蛋白包含一个氨基末端的标志，标签从原始序列的亨廷顿蛋白质，polyQ蛋白地区和羧基端融合荧光蛋白（GFP或CFP资格由17个氨基酸，见图1 A）。表达的蛋白质与polyQ蛋白46 glutamines或更多扩展（例如72和103 glutamines的）生产酵母中的毒性控制下的诱导和相对强GAL1启动^7，9时表示。

如前所述，polyQ蛋白在酵母中的毒性是唯一明显的细胞携带的朊蛋白构象的蛋白质Rnq1p [RNQ +]，如酵母菌株W303 ^9。有毒polyQ蛋白膨胀蛋白ŕecapitulates中央polyQ蛋白在酵母细胞生物学方面的，如polyQ蛋白长度依赖毒性（见下文）和聚集（图1）。值得注意的是，有毒polyQ蛋白膨胀蛋白不杀死酵母细胞立即而不是削弱或逮捕的细胞周期和细胞及试产，从而减缓或抑制酵母片或液体培养（未发表资料）殖民地的增长。

2。对有毒polyQ蛋白膨胀蛋白与酵母细胞的潜在问题

polyQ蛋白扩张，否则有毒蛋白质的酵母细胞中表达，可能不会显示任何增长的缺陷^9。这些抑制器polyQ蛋白毒性的遗传性质，不会出现简单的孟德尔遗传突变的基础上，从而可以发生的频率比较高（未公布结果）。我们推测，这些自发的抑制是造成类似[RNQ]在确定polyQ蛋白toxicity.Thes功能不明的朊病毒固化polyQ蛋白毒性的é自发抑制器可危及任何实验，旨在刻画polyQ蛋白毒性或识别和描述polyQ蛋白的毒性修饰符取得圆满成功。

为了避免这些自发抑制频繁发生，请按照下述的预防措施，这已被证明是非常有效的：

1. 使用鲜酵母细胞毒性实验。不要长时间储存​​的酵母。经常从冷冻股票检索鲜酵母殖民地。
2. 经常监测荧光显微镜有毒polyQ蛋白膨胀蛋白的表达和聚集。
3. 保持在镇压开始前任何毒性测量polyQ蛋白的毒性在所有时代的毒性（即含葡萄糖为唯一碳源的选择性培养基）的表达媒体的酵母细胞。
4. 每个polyQ蛋白毒性实验中使用的至少有三个独立的转化。

3。生长实验

1. 对于每个实验条件下，接种一个殖民地polyQ蛋白膨胀在3毫升选择性酵母媒体有毒蛋白细胞窝藏葡萄糖作为唯一碳源的酵母从三个独立的转化。
2. 这些文化过夜孵育30°C。在这些条件下，细胞不表达polyQ蛋白膨胀蛋白，因为葡萄糖在中期抑制其表达。不要让这些文化长满;保持外径_600（600 nm波长的光吸收）低于1隔夜文化。
3. 我们经常使用三种不同的化验，以监察表达有毒polyQ蛋白膨胀蛋白的酵母细胞的生长缺陷：

3.1平板上的生长

1. 选择性稀释隔夜酵母培养（220转震动成长_）600 0.0005 OD（即一个OD600值= 0.5文化1:1000稀释）直径⁷含葡萄糖。
2. 均匀地涂抹上含有葡萄糖为唯一碳源的选择性介质和含半乳糖为唯一碳源的选择性培养基板一板（直径10厘米）50μl各摊薄文化的（CA 700菌落每盘）。
3. 在30°C孵育三到四天的板孵化后，每块板的照片和葡萄糖和半乳糖板菌落数菌落计数的数量。在理想的条件下，应该没有或只有很少的殖民地上的半乳糖板时，利用酵母细胞表达一种剧毒polyQ蛋白膨胀蛋白（103Q，图2a）。

3.2合模分析

此法比电镀法上面介绍更多的定量，从而可以揭示polyQ蛋白毒性哪怕是细微的差异与同一板块上的相同的实验。

1. 稀释的overn生长在培养基葡萄糖0.1的外径₆₀₀的飞行文化。
2. 吸取200μL无菌96孔板和这些摊薄文化的准备五个五倍串行无菌水稀释，使用多通道移液器。
3. 用青蛙过河（也称为去污剂与8×6针细胞悬液转移）转移到选择性培养基含葡萄糖作为唯一碳源和含半乳糖为唯一碳源的选择性培养基平板板的细胞悬液。
4. 允许板晾干后方可孵化30°Ç三到四天。
5. 孵化后，每块板的照片（图2b）。

3.3。监测polyQ蛋白在酵母中的毒性液体培养的生长

此协议是最定量这里描述的三个实验（OD600值的数字），甚至可以检测polyQ蛋白的毒性非常细微的差别。上述业主立案法团然而，自发抑制currence，可能产生误导的结果。因此，我建议至少有一个以上所述的两个电镀检测相结合的检测。我们建议使用这些实验BioscreenC仪器。 BioscreenC是仪器自动测量光密度在100孔板酵母培养，而培养与定义搅拌定义的温度。日益增长的酵母细胞，并测量其光密度等方法也可申请。

1. 从最小的媒体含有葡萄糖作为唯一碳源，在3毫升无菌水三次洗的酵母细胞。
2. 稀释与半乳糖的外径₆₀₀ 0.1在培养基上生长的过夜培养。
3. 填补300μl酵母菌文化的每个井，100井BioscreenC板。
4. 打开简易BIOSCREEN实验方案。确定要监视（包括空白和中唯一的样本数量控制），设定温度至30°C，设置实验的长度为3天，设置了测量时间间隔为15分钟，设置过滤器以600海里/布朗，并设置每次测量前15秒震动模式中等强度。
5. 的BioscreenC文书和所附的软件会产生在实验过程中所采取的每个数据点的Excel电子表格。
6. 准备与Excel的生长曲线，每个样品和比较不同样本（图2c）的增长。 ^10日前已提供BioscreenC实验产生的数据进行分析的详细描述。

4。代表结果

图1。 polyQ蛋白酵母模型。荧光显微镜一）有毒polyQ蛋白膨胀的蛋白质，B的示意图），显示酵母细胞中表达了一个简短的，无毒的polyQ蛋白扩张蛋白（25Q，左侧面板）和酵母细胞长，有毒polyQ蛋白膨胀蛋白（103Q，右图）。

图2。代表表达polyQ蛋白膨胀蛋白质的酵母细胞的生长实验结果。一）电镀法。约700个酵母细胞伸长平板上，三天在30℃孵育上游面板显示板含葡萄糖培养基，即有毒polyQ蛋白膨胀蛋白（103Q）的表达， 不诱导。较低的面板显示含有半乳糖培养基酵母片，即有毒polyQ蛋白膨胀蛋白表达诱导 。请注意，这里显示实验中，没有发生自发抑制B）合模试验。五串行5倍稀释的酵母细胞，窝藏一个无毒polyQ蛋白蛋白（25Q）或有毒polyQ蛋白膨胀proteiN（103Q）被发现葡萄糖板压制表达蛋白（左侧面板）或半乳糖诱导其表达的板块。板，然后孵育3天30°C。C）BioscreenC实验。酵母细胞中表达一个无毒polyQ蛋白蛋白（25Q）或有毒polyQ蛋白膨胀蛋白（103Q）文化的增长，由监察BioscreenC仪器。在主文本描述的实验条件和分析的BioscreenC实验。

这手稿概述了三种互补的实验方法来衡量polyQ蛋白表达有毒polyQ蛋白膨胀蛋白的酵母细胞减少增长的基础上在模式生物酵母毒性。在酵母中的工作提供了深刻的见解成蛋白质错误折叠的基本细胞和分子机制及其随后的毒性，包括错误折叠和毒性polyQ蛋白膨胀蛋白^9,11,12。在这里提出的协议为基础的实验已经帮助识别和描述polyQ蛋白毒性增强或抑制基因，polyQ蛋白毒性的小分子调节剂和细胞机制支撑polyQ蛋白毒性^5-8,13,14。

所提出的协议，可以很容易地适应探讨polyQ蛋白的毒性，如不同的生长条件或基因突变，要么减少或加剧polyQ蛋白毒性的其他修饰符。此外，所提出的实验方案可以很容易地被调整到其他有毒在酵母中错误折叠的蛋白质的毒性测试。

没有利益冲突的声明。

衰老研究（远方），遗传性疾病基金会（高密度纤维板）和威廉·伍德基金会从美国联邦赠款支持在Duennwald实验室工作。