一次運動とエレクトロポリ- L -乳酸ナノファイバー足場上で定義されているメディアの感覚ニューロンの文化

整列エレクトロスピニングの繊維は、in vitroで神経細胞の成長を指示し、神経再生の足場の潜在的なコンポーネントです。我々は、エレクトロスピニングの繊維基材と初代ラットE15感覚（DRG）と運動ニューロンの無血清培養を調製するための手順を説明します。免疫細胞による神経細胞の可視化も含まれています。

エレクトロスピニングは、ナノスケールの繊維のマイクロに生成するためのテクニックです。繊維は非常に完全にランダムに整列から、アライメントの程度の差でエレクトロスピニングすることができます。さらに、繊維は、ポリ- L -乳酸（PLLA）のような生分解性ポリマーを含む様々な材料、から紡糸することができます。これらの特性は、組織工学における足場の様々なアプリケーションに適したエレクトロスピニングの繊維を作る。我々の焦点は、神経再生のための整列エレクトロ繊維の使用になります。我々は以前にアラインエレクトロPLLA繊維は、in vitroの両方の一次感覚と運動ニューロンの突起伸長を指示することを示している。我々はできるかぎり生体に見られるモデル実際の神経細胞への生体材料を評価する際に、初代培養細胞系の使用が不可欠であることを維持する。ここで、我々は、エレクトロスピニングの足場に、繊維状の足場と文化背根神経節の外植片だけでなく、解離性感覚および運動ニューロンをelectrospinする我々の研究室で使用される技術について説明します。しかし、エレクトロスピニングおよび/または文化ここに示す手法は、容易に他のアプリケーションでの使用に適合している。

1。ソリューションをスピニングポリ- L -乳酸（PLLA）

1. 弱火で攪拌することにより9mLをクロロホルムで0.4グラムPLLAを溶かす。
2. DMF 9:1（v / v）の：クロロホルム、4％PLLA（w / v）の溶液の最終濃度をもたらす、ソリューションに1 mLのジメチルホルムアミドを追加。
3. 鈍23ga先端に金属の付いたポリプロピレンまたはガラス製注射器内の溶液を置きます。

2。基板の準備^{1スピニング}

1. 弱火で撹拌することにより、クロロホルムの85:15 PLGA（ポリ乳酸 - コ - グリコール酸）の8％（w / v）溶液を加えます。
2. PLGA溶液をそれぞれカバーガラスの表面を覆うことによりコートPLGAで清浄なガラスのカバースリップを。 PLGAは、薄膜（約30分）に乾燥することができます。

3。エレクトロスピニング²

1. 導電性カーボンテープでコレクタにPLGAコーティングされたガラスのカバースリップを固定します。整列繊維の場合、コレクタは、モータ駆動輪です。ランダム繊維の場合、コレクタは固定プレートです。
2. コレクターの輪から先端部20 cmのポンプの場所の注射器。約2mL / hrにポンプを設定し、ホイールを使用して、300から400 RPMにモーターを設定した場合。可能であれば、コレクタと金属の先端〜+15 kVのに-2 kVのDCバイアスを印加。バイポーラ電源へのアクセスがない状態で、コレクタを接地してください。
3. 繊維は、シリンジの先端からジェット、回転する輪に収集します。繊維の所望の密度が得られるまで回転を続けます。スワイプ先端で目詰まりを防ぐために定期的に非導電性ロッドに固定されたペーパータオルで金属チップ。

4。 ¹ Moating

1. 以下の紡績、カバースリップの周囲PLGAのラインをピペッティングにより"堀"エレクトロのサンプルを。 PLGAは乾燥することができます。これは、培養中の繊維の配向を維持します。

5。タンパク質のコーティング

1. エレクトロ繊維とガラスのコントロールは前の細胞培養へのタンパク質でコーティングする必要があります。少なくとも1時間のためのタンパク質溶液に基板をカバーし、過剰の溶液を吸引除去し、基質が乾燥しているまで、吸引続けます。可能なタンパク質溶液は、次のとおりです。PLL（ポリ- _L -リジン）（100μg/ mL）を、ラミニン（25μg/ mLの）またはフィブロネクチン（50μg/ mL）を。 PLLが使用されている場合は、基材は滅菌水で洗浄し、初期コーティングに続く二回乾燥させる。

6。 E15ラット胚^3を入手する

動物の使用や保管場所についてミシガン委員会の大学で承認されたとして、*全ての実験は、実験動物の管理と利用のためのNIHのガイドに従って行われた。

1. 準備：動物が妊娠しているか確認してください。 3 mLのトリプシン、3 mLのFBSとL15の暖かいボトルを解凍。火災は、パスツールピペットを磨く。 30分間70％エタノールですべての手術器具を消毒する。
2. （ 表1参照）メッキのメディアを準備して温める。
3. 安楽死：ケタミン/キシラジンのIP注入を実行します。 10〜15分待ってから、角膜とペダル撤退反射の欠如のために確認してください。反射神経が存在しないと、ペントバルビタール（FatalPlus）のIC注射を行います。
4. テント腹部の皮膚。腹腔を露出する皮膚と筋肉の層を介してカット。子宮の位置を確認し、子宮頸部、卵巣でそれを切り離します。
5. はさみで子宮から胚を取り出し、冷めないようにL15にすぐにそれらを置きます。 （次のすべての手順は、解剖顕微鏡および胚の下に完成されており、解剖コードは常に暖かいL15に浸漬する必要があります。）顎の周りと頭蓋骨の後頭骨下に鉗子を閉じることによって胚を斬る。

7。解剖³

1. 片側に胚を置きます。手足や腹部の臓器を離れて除去する他のセットを使用しながら鉗子の一組と脊髄を保護する。
2. 胚をオンにし、鉗子の一組とそれがそのままじっとしている。首から尾まで胚の長さに沿って切り取り、全体コードが露出するまで。
3. 慎重にコードの端をつかみ、削除するためにテールに向かって自分自身の上に引き出します。コー​​ドは、膜と接続された後根神経節（DRG）と無料のプルになります。
4. DRGの外植片または解離性感覚ニューロンの文化が実行されることになっている場合、コードからDRGをチョキチョキと暖かいL15の新鮮な料理にそれらを転送する。
   1. 移植片培養をDRGの、25.9に進みます
   2. 解離性感覚ニューロンを培養するためには、手順9に進んでください
   3. 運動ニューロンの培養には、DRGは、ステップ7.5の膜で除去されます。
5. 中敷の取り外しと同様、コードの先端にそれを把握し、それを剥がすことにより脊髄から膜を取り除く。すべての胚に対してこのステップを繰り返し、その後、小さな（2-3 mm）の部分にコード​​を切る。

1. ペレット片に2〜3分間1000 RPMで円錐とスピンに刻んだコードとL15を注ぐ。
2. 上清を捨て、ペレットコードにトリプシン3 mLを加える。 20分間37℃の水浴でインキュベートする。
3. 円錐と再ペレットに2〜3分間、1000rpmでスピンを3 mLのFBSを追加。
4. 上清と塗りFBSで火ポリッシュパスツールピペットを捨て。
5. 円錐形の一つパスツールL15のピペットフルを追加してから、解決策が目に見える塊と均一になるまで静かに砕いて粉末にする。泡を避けてください。
6. L15でOptiprepの9％溶液を調製します。隔年胚（胚の数が奇数の場合は、切り上げ）のためにOptiprep液3mLでつのチューブを準備します。
7. すべてのチューブの間で均等に分割し、Optiprep液に均質化ソリューションをドロップします。 15分間2000 rpmでチューブを回転させる。
8. 慎重に50 mLコニカルにおける各チューブとプールからの上位2 mLを収集する。 Optiprepの細胞をリンスして5分間1000rpmでL15とスピンで円錐形を塗りつぶします。
9. 上清を捨て、メッキのメディア（250〜500μl）を、少量の細胞を再懸濁します。生きている細胞を同定するためにトリパンブルー排除を用いて細胞を数える。 10.1に進みます

9。感覚ニューロン（SN）処理⁷

1. ペレットに2〜3分の作品のために1000 RPMでコニカルチューブに脊髄およびL15から削除DRGとスピンを注ぐ。
2. 上清を捨て、ペレットDRGにトリプシン3 mLを加える。 10分間37℃の水浴でインキュベートする。
3. 円錐と再ペレットに2〜3分間、1000rpmでスピンを3 mLのFBSを追加。
4. 上清と塗りFBSで火ポリッシュパスツールピペットを捨て。
5. 円錐形の一つパスツールL15のピペットフルを追加してから、解決策が目に見える塊と均一になるまで静かに砕いて粉末にする。泡を避けてください。
6. 5分間1000rpmでホモジネートを回転させる。上清を捨て、Snめっきの小容量のリムーバブルメディア（250〜500μL）で細胞を懸濁します。生きている細胞を同定するためにトリパンブルー排除を用いて細胞を数える。 10.1に進みます

10。メッキと文化

1. 解離SNまたはMN文化のための：
   1. メディアの数滴を基板をカバーするとして細胞懸濁液の適切な量を追加します。解離細胞は低密度（25〜50細胞/ mm ^2）で播種してください。細胞は培地をウェルの中にフラッディングする前に少なくとも1時間付着することができます。
2. 移植片培養をDRGの：
   1. メディアの数滴を基板をカバーするには、メディアにDRGに追加します。それらが均等に（約4 DRGは、22x22 mmのカバースリップに収まる）基板上に分散されるようにDRGを手配する。 DRGは、メディアで井戸をフラッディングする前に少なくとも4時間のために付着することができます。
3. 文化は、メディアを変更することなく、4日間まで維持することができます。長い文化のために、半分のメディアの変更は、フィードのメディアで行ってください。フィードメディアは、メッキのメディアマイナスL -グルタミンと同じ組成である。

11。免疫細胞化学^1,5,8

1. セルを修正する：吸引のメディアは、30分間のウォーム4％PFA（パラホルムアルデヒド）に置き換える。その後3X 5分1 × PBSで洗浄を行います。
2. ブロッキング/透過化：ブロック/パーマ液（1 × PBSでウシ血清アルブミン1.25パーセント、0.05％トリトンX - 100、2.0％正常ヤギ血清）を準備します。吸引PBSと30分間のサンプルをブロック/パーマソリューションを適用する。その後1X 5分1X PBSの洗浄を行います。
3. 一次抗体：一次抗体希釈標準溶液調製（10％正常ヤギ血清、1.25％ウシ血清アルブミン、0.1％アジ化ナトリウム、0.05％トリトンX - 100をおよび1x PBSで10mLに）。一次抗体の適切な量を追加する（ 表2参照）。パラフィルムとの線、いくつかの料理。各基板のためパラフィルム上に一次抗体溶液の200μlのビーズを置きます。基板反転、（部屋にエアコンが付けまたは特に乾燥の場合は、水飽和一枚の紙が正常に機能している溶液の蒸発を防ぐために、料理のコーナーに追加できる）一晩一次抗体希釈標準溶液にそれらの細胞の側を下に浮いて。
4. 二次抗体：（ワーキング溶液は4℃で保存し、Cを収集して再利用することができます）プライマリから基板を除去し、2X 5分1 × PBSで洗浄を行う。 4時間PBS（また、パラフィルムが並ぶ皿の上に反転）で1:200に希釈した200μlの二次抗体を適用します。
5. 2X 5分1 × PBSで洗浄を行う、セカンダリから削除します。でスライド上にマウント基板には、DAPIまたは別の適切な核のカウンタが含まれているゴールドが染色長くしてください。

12。代表的な結果：

配向とランダムエルの典型的な形態ectrospun繊維を図1に示されています。我々は通常、このプロトコルで> 90％のニューロンのMNの純度^7,8を取得し、我々は、重要な線維芽細胞成長なしに限り一週間などのための文化をDRGの維持している。図2は、文化と免疫染色の24時間後のガラスと繊維の典型的なMNの外観を示しています。ガラスおよび繊維の3つの日間培養した免疫染色DRGを図3に示されている。

図1。ファイバのアライメントは、コレクタの選択によって操作されます。 A.））回転する車輪のコレクタとB.に紡糸繊維を揃えるランダム繊維は、固定プレートのコレクタ上にスピン。スケールバー= 20μmの。

図2。）PLLコーティングされたAの文化の24時間後にTuJ1（緑）およびDAPI（青）のために繊維とBを染色した代表的な運動ニューロン）ガラス。スケールバー= 20μmの。

図3。PLLコーティングされたAの3日間培養した後、ニューロフィラメントのための代表的なDRGのステンドグラス（緑））ガラスとB）繊維。スケールバー= 200μmの。

表1：使用直前にメディアに（*）星を獲得したコンポーネントを追加します。残りのコンポーネントは、原液として調製し^、6,7を必要とするまで-20 ° Cに保つことができる。

表2：一次抗体の選択は、研究者の目標に依存しています。上記は、いくつかの抗体と我々の研究室で成功を収めて使用した濃度です。 S - 100は、シュワン細胞の同定および/または繊維芽細胞を汚染するかどうかを確認、しかしそれはグリア細胞とfibroblasts4を区別するNGFR p75のと組み合わせて使用​​する必要があることに注意することは特に便利です。我々はまた、目標は、個々の神経突起を可視化するかどうニューロフィラメントまたはTuJ1が優れた選択肢である一方NGFR p75の汚れが非常に軽く神経突起ことに気づいた。

このプロトコルは、いくつかの重要なステップがあります。最初はエレクトロ繊維基材の適切な生産を伴います。液体培地では、PLLA繊維、PLGAフィルムおよびPLGAの堀は、単一ユニットとしてガラス製カバースリップから分離されます。 PLGAが省略された場合、PLLA繊維は、平らなシートは残りません - 彼らが使用不能にもつれに丸くなっています。従って、PLGA膜は培養中に光ファイバのアライメントを維持するために適切な基質として含まれています。堀は、繊維がしっかりとPLGA膜に固定されており、フィルムに構造的な剛性を追加することを保証するために両方のスピンの後に追加されます。基板は、固定染色し、実装時に操作される際に堀にも便利なハンドルとして機能します。粉砕は2番目に重要なステップです。あらゆる努力が泡の形成を回避するためになされるべきである。さらに、我々は、ファイアーポリッシュピペットはこのステップに使用される非常に高い利回りを得ている。研磨発生させるには、ブンゼンバーナーを点灯し、ピペットに電球を取り付けます。継続的に絞ると電球を放出しながら炎を迅速に2-3回をピペットの先端を渡す - ピペットを通る空気の流れが完全に閉じてから先端を防ぐことができます。穴が開いたままとエッジは使用前に少し丸み表示されるようになるようにピペットの先端を調べます。

エレクトロスピニングは、非常に汎用性の高いプロセスです。エレクトロスピニングのパラメータは、形態の様々な繊維を製造するように変更することができます。タンはら （2005）詳細PLLAエレクトロ繊維の直径に影響を与えるパラメータの体系的研究を。 Wang ら （2009）エレクトロPLLA繊維のアラインメントに影響を与えるパラメータの詳細な調査を提示。

NIH K08 EB003996