Gli osteoclasti sono un tipo di cellula multinucleata comunemente usato dai ricercatori in aree come la ricerca sulle malattie ossee, la ricerca sul cancro, l'ingegneria tissutale e la ricerca sulle endoprotesi. Tuttavia, la differenziazione degli osteoclasti può essere impegnativa, poiché è necessaria la fusione dei precursori. Inoltre, la differenziazione degli osteoclasti umani dalle IPSC richiede l'uso di una varietà di fattori biologici al momento giusto.
Quando si tratta di cellule primarie umane. Le cellule mononucleate del sangue periferico CD34+ sono attualmente il tipo di cellula più utilizzato per la differenziazione in osteoclasti. Tuttavia, questo approccio è limitato dall'eterogeneità all'interno della popolazione CD34+ e dalla loro limitata espandibilità.
Le IPSC umane rappresentano una fonte alternativa per gli osteoclasti. Poiché possono essere propagati indefinitamente, consentono l'espandibilità e l'aumento della produzione di osteoclasti. Ciò consente la differenziazione di un gran numero di osteoclasti, il che facilita la ricerca sugli osteoclasti.
Qui, il nostro postdoc Alexander Blumke e la dottoranda Jessica Simon, dimostrano la differenziazione degli osteoclasti dalle IPSC umane che passano le IPSC. Iniziare a passare le IPSC rimuovendo le regioni differenziate o le regioni con molti aggregati IPSC morti allo stereomicroscopio utilizzando un puntale per pipette P-10 o P-20 o un raschietto per cellule. Le regioni differenziate appariranno più dense e di colore più bianco.
Lavare le cellule staccate con un vecchio terreno, quindi lavare via le cellule staccate rimanenti con PBS due volte. Quindi, aggiungi un millilitro di cinque unità per millilitro di dispasi per pozzetto al pozzetto. I bordi delle colonie che si staccano dalla capsula possono essere osservati allo stereomicroscopio dopo tre-cinque minuti.
Rimuovere con cautela la dispasi e aggiungere un millilitro di DMEM/F-12 con HEPES da 15 millimolari. Utilizzare uno strumento per il passaggio di cellule staminali o un sollevatore di cellule usa e getta per tagliare gli aggregati in piccole dimensioni. Trasferire il terreno con gli aggregati in una provetta conica da 15 millilitri utilizzando una pipetta sierologica da cinque millilitri o una P-1000 con punta a foro largo.
Sciacquare il pozzetto con DMEM/F-12 e trasferire il terreno nella provetta da 15 millilitri. Centrifugare gli aggregati IPSC affettati a 200 G per tre minuti. Rimuovere il surnatante con una pipetta di vetro Pasteur e aggiungere due millilitri di terreno privo di siero IPSC umano per rimuovere e risospendere le IPSC utilizzando una pipetta sierologica da cinque millilitri o P-1000 con puntali a foro largo.
Aspirare l'estratto di membrana basale rimanente dalle piastre a pozzetti pre-rivestite e aggiungere un millilitro di terreno privo di siero IPSC umano a ciascun pozzetto della piastra a sei pozzetti. Trasferire le IPSC in nuovi pozzetti di una piastra a sei pozzetti in modo che il volume finale sia di due millilitri di terreno umano privo di siero IPSC per pozzetto utilizzando un P-1000 con punte a foro largo. A seconda della linea IPSC, i rapporti di divisione devono essere ottimizzati.
In questo caso, è stato utilizzato un rapporto di divisione 1:6. Ruotare la piastra del pozzetto per distribuire uniformemente le cellule sulla piastra dopo che gli aggregati sono stati trasferiti. Induzione del corpo embrioide.
Aspirare il vecchio terreno dalle colture IPSC e risciacquare i pozzetti con DPBS. Aggiungere mezzo millilitro di preriscaldato a temperatura ambiente in ciascun pozzetto di una piastra a sei pozzetti e far roteare il recipiente di coltura per rivestire l'intera superficie del pozzetto. Incubare il recipiente di coltura a 37 gradi C per cinque-otto minuti.
Rimuovere il recipiente dall'incubatrice, aspirare la soluzione e aggiungere il terreno di fase uno ai pozzetti costituiti da 50 nanogrammi per millilitro di proteina morfogenica dell'osso umano 4, 50 nanogrammi per millilitro di fattore di crescita endoteliale vascolare umano 165, 20 nanogrammi per millilitro di fattore di cellule staminali umane e 10 inibitori micromolari ROCK Y-27632. Staccare delicatamente le cellule risciacquando il pozzetto con il terreno di stadi uno. Tirare le cellule in un tubo conico.
Aggiungere il nuovo terreno di fase uno ai pozzetti e staccare le cellule rimanenti utilizzando un raschietto per cellule. Dopo aver trasferito tutte le cellule nella provetta, centrifugare a 200 G per cinque minuti a temperatura ambiente per pellettare le cellule. Aspirare e risospendere le cellule in un totale di due millilitri di terreno pre-bilanciato di fase uno.
Contare le cellule utilizzando un emocitometro o un dispositivo automatico per il conteggio delle cellule Seme 12, 500 cellule per pozzetto in una piastra a 96 pozzetti a fondo tondo con attacco ultrabasso in 100 microlitri di terreno di fase uno. Al microscopio, le cellule appariranno diffusamente in tutta la soluzione. Centrifugare le piastre a 96 pozzetti per tre minuti a 100 G Dopo la centrifugazione, le cellule dovrebbero iniziare ad assomigliare a sferoidi se osservate al microscopio.
Mettere la piastra in un'incubatrice a 37 gradi C. Cambia metà del mezzo il primo giorno e il secondo giorno con il supporto della fase uno. Utilizzare una pipetta multicanale per smaltire il vecchio terreno in una capsula di Petri.
Dopo aver smaltito i terreni dalla piastra a 96 pozzetti, verificare la presenza di EB che potrebbero essere stati rimossi accidentalmente. Trasferire nuovamente gli EB rimossi accidentalmente nella capsula di Petri utilizzando una pipetta P-1000 Differenziazione ematopoietica. Pozzetti di pre-riempimento di una piastra a sei pozzetti con tre millilitri di terreno di fase due, a cui vengono aggiunti ultraglutammina bimillimolare, beta-mercaptoetanolo 55-micromolare, 25 nanogrammi per millilitro, interleuchina-3 umana e 100 nanogrammi per millilitro di fattore stimolante le colonie di macrofagi umani.
Utilizzando un P-1000 e una punta a foro largo, trasferire otto EB in ciascun pozzetto della piastra a sei pozzetti. Dopo il trasferimento, controllare a occhio sotto lo stereomicroscopio che in ogni pozzetto siano presenti otto EB. Dopo cinque-sette giorni, dovrebbe diventare visibile una popolazione cellulare fluttuante composta da cellule ematopoietiche.
Il periodo di differenziazione ematopoietica può essere variato, a partire da sette giorni. La differenziazione per 10 giorni ha mostrato una popolazione ematopoietica composta da grandi sottopopolazioni CD45+CD14+ e CD11b+. Dopo cinque giorni di trattamento con il mezzo di fase due, eseguire un cambio di terreno rimuovendo con cura il vecchio terreno ed erogandolo in un tubo conico da 50 millilitri.
Aggiungere immediatamente un millilitro di nuovo terreno di fase due ai pozzetti. Al fine di salvare eventuali cellule ematopoietiche galleggianti che potrebbero essere già presenti, far girare la provetta con il vecchio terreno a 300 G per cinque minuti. Aggiungere il nuovo terreno di fase due alla provetta e risospendere per staccare le cellule che potrebbero essere state trasferite con il vecchio mezzo.
Aggiungere due millilitri di nuovo terreno di fase due con le cellule salvate in ciascun pozzetto, che in precedenza era stato riempito con un millilitro di terreno di fase due. Al 10° giorno di differenziazione ematopoietica, le cellule ematopoietiche galleggianti vengono raccolte raccogliendole in una provetta conica da 50 millilitri e possono essere congelate utilizzando il 10% di DMSO, il 50% di FBS e il 40% di medium, o immediatamente utilizzate per differenziare ulteriormente le cellule in osteoclasti. Maturazione M-CSF e differenziamento degli osteoclasti.
Cellule del seme a 200.000 cellule per centimetro quadrato e trattare per tre giorni con alfa MEM integrato con 10% FBS e 50 nanogrammi per millilitro M-CSF. Per eseguire saggi funzionali o imaging, staccare le cellule maturate con MCSF lavandole con un P-1000 con punta a foro largo. Trasferire le cellule staccate con il vecchio terreno in una provetta e centrifugare a 300 G per cinque minuti.
Risospendere e dissolvere il pellet cellulare con alfa MEM fresco integrato con 10% di FBS, 50 nanogrammi per millilitro di M-CSF e 80 nanogrammi per millilitro di legante RANK. Risemina le cellule a 200.000 cellule per centimetro quadrato e differenzia per sette-nove giorni. Gli osteoclasti multinucleati compaiono in genere intorno al quinto o settimo giorno.
Risultati rappresentativi. La composizione della popolazione di cellule ematopoietiche generata può essere analizzata utilizzando la citometria a flusso. Qui, le cellule ematopoietiche mostrano un'ampia popolazione di cellule precursori CD45+.
Le popolazioni cellulari che esprimono i marcatori monocitari CD14 e CD11b di solito costituiscono un terzo dell'intera popolazione rispetto ai controlli isotipici. Gli osteoclasti derivati da IPSC terminalmente differenziati possono essere visti al microscopio come cellule multinucleate TRAP-positive. La microscopia confocale mostra la colorazione delle cellule per la catepsina K.I saggi funzionali come i saggi di assorbimento osseo o minerale consentono un'ulteriore quantificazione dell'attività degli osteoclasti.
In questo caso, i fossetti di riassorbimento sono visibili dopo aver rimosso l'osteoclasto maturo con candeggina al 10% prima dell'imaging, mentre i precursori degli osteoclasti maturati con M-CSF trattati senza l'aggiunta del ligando RANK non mostrano pozzi di riassorbimento. Conclusione. Questo protocollo consente la differenziazione robusta e affidabile degli osteoclasti umani e potrebbe fornire una soluzione pronta all'uso per le malattie ossee o le malattie che comportano un eccesso di calcificazione. Usiamo gli osteoclasti per ingegnerizzarli ulteriormente nelle nostre cellule RANK che utilizzano un dominio di segnalazione intracellulare che può essere attivato in combinazione con un induttore chimico di dimerizzazione per l'attivazione controllata e indipendente dagli osteoprotegerine.
