破骨细胞是一种多核细胞类型，通常被研究人员用于骨病研究、癌症研究、组织工程和内假体研究等领域。然而，破骨细胞分化可能具有挑战性，因为前体融合是必要的。此外，人类破骨细胞与IPSCs的分化需要在正确的时间使用各种生物因子。
说到人类原代细胞。CD34+外周血单核细胞是目前最广泛使用的分化为破骨细胞的细胞类型。然而，这种方法受到CD34+群体内异质性及其有限的可扩展性的限制。
人类IPSC是破骨细胞的替代来源。由于它们可以无限期繁殖，因此它们允许破骨细胞生产的可扩展性和升级。这允许区分大量的破骨细胞，从而促进破骨细胞的研究。
在这里，我们的博士后Alexander Blumke和博士生Jessica Simon展示了破骨细胞与人类IPSC传代IPSC的分化。通过使用P-10或P-20移液器吸头或细胞刮刀在体视显微镜下去除分化区域或具有许多死亡IPSC聚集体的区域，开始传代IPSC。分化区域将显得更密集，颜色更白。
用旧培养基洗净分离的细胞，然后用PBS洗去任何剩余的分离细胞两次。接下来，向孔中加入每孔每毫升五单位的分散酶一毫升。三到五分钟后，可以在体视显微镜下观察到从培养皿中抬起的菌落边缘。
小心地去除分散酶，并加入一毫升 DMEM/F-12 和 15 毫摩尔 HEPES。使用干细胞传代工具或一次性细胞提升器将聚集体切成小尺寸。使用 5 毫升血清移液管或带宽口径吸头的 P-1000 将含有聚集体的培养基转移到 15 毫升锥形管中。
用 DMEM/F-12 冲洗孔并将培养基转移到 15 毫升管中。将切片的IPSC聚集体以200G离心三分钟。用巴斯德玻璃移液管取出上清液，并加入两毫升人IPSC无血清培养基，以使用5毫升血清移液管或带有宽口径吸头的P-1000去除并重悬IPSC。
从预包被的孔板中抽出剩余的基底膜提取物，并向六孔板的每个孔中加入一毫升人IPSC无血清培养基。使用带有宽口径吸头的 P-1000 将 IPSC 转移到六孔板的新孔中，使最终体积为每孔 2 毫升人 IPSC 无血清培养基。根据IPSC系列的不同，需要优化分流比。
在这里，使用了 1:6 的分流比。在转移聚集体后，旋转孔板以使细胞均匀分布在孔板上。胚状体诱导。
从IPSC培养物中吸出旧培养基，并用DPBS冲洗孔。将半毫升预热至室温的预热液加入六孔板的每个孔中，并旋转培养容器以覆盖整个孔表面。将培养容器在 37 摄氏度下孵育 5 至 8 分钟。
从培养箱中取出容器，吸出溶液，并将第一阶段培养基加入由50纳克/毫升人骨形态发生蛋白4,50纳克/毫升人血管内皮生长因子165,20纳克/毫升人干细胞因子和10微摩尔ROCK抑制剂Y-27632组成的孔中。用第一阶段培养基冲洗孔，轻轻分离细胞。将细胞拉入锥形管中。
将新的第一阶段培养基添加到孔中，并使用细胞刮刀分离任何剩余的细胞。将所有细胞转移到试管中后，在室温下以200G离心五分钟以沉淀细胞。将细胞吸出并重悬于总共两毫升预平衡的第一阶段培养基中。
使用血细胞计数器或自动细胞计数装置 Seed 12 对细胞进行计数，每孔 500 个细胞在圆底超低附着 96 孔板中放入 100 μL 第一阶段培养基中。在显微镜下，细胞将弥漫地出现在整个溶液中。将96孔板以100G离心三分钟离心后，在显微镜下观察时，细胞应开始类似于球状体。
将板放入37°C培养箱中。在第一天和第二天用第一阶段培养基更换一半的培养基。使用多通道移液器将旧培养基倒入培养皿中。
从 96 孔板中处理培养基后，检查可能被意外移除的 EB。使用P-1000移液器造血分化将培养皿中意外去除的EB转移回去。用三毫升第二阶段培养基预填充六孔板的孔，其中加入两毫摩尔超谷氨酰胺、55微摩尔β-巯基乙醇、25纳克/毫升、人白细胞介素-3和100纳克/毫升人巨噬细胞集落刺激因子。
使用 P-1000 和宽口径吸头，将 8 个 EB 转移到六孔板的每个孔中。转移后，在体视显微镜下用肉眼检查每个孔中有八个EB。五到七天后，由造血细胞组成的漂浮细胞群应该变得可见。
造血分化期可以变化，从 7 天开始。10 天的分化显示由大 CD45+CD14+ 和 CD11b+ 亚群组成的造血群体。用第二阶段培养基处理五天后，通过小心地去除旧培养基并将其分配到 50 毫升锥形管中来更换培养基。
立即向孔中加入一毫升新的第二阶段培养基。为了保存可能已经存在的任何漂浮造血细胞，用旧培养基在300G下旋转管5分钟。将新的第二阶段培养基添加到试管中并重悬，以分离可能已与旧培养基转移的细胞。
在每个孔中加入两毫升新的第二阶段培养基，并保存细胞，该孔先前填充了一毫升第二阶段培养基。在造血分化的第 10 天，通过将漂浮造血细胞收集到 50 毫升锥形管中来收获它们，并且可以使用 10%DMSO、50% FBS 和 40% 培养基冷冻，或立即用于进一步将细胞分化为破骨细胞。M-CSF成熟和破骨细胞分化。
以每平方厘米 200， 000 个细胞的种子细胞，并用补充有 10% FBS 和 50 纳克/毫升 M-CSF 的 α MEM 处理三天。为了进行功能测定或成像，用带有宽口径尖端的 P-1000 洗涤，分离 MCSF 成熟的细胞。将分离的细胞与旧培养基转移到试管中，并以300G旋转五分钟。
用补充有 10%FBS、每毫升 M-CSF 50 纳克和每毫升 RANK 配体 80 纳克的新鲜 α MEM 重悬并溶解细胞沉淀。以每平方厘米 200， 000 个细胞重新接种细胞并分化 7 到 9 天。多核破骨细胞通常在第 5 至 7 天左右出现。
代表性结果。生成的造血细胞群的组成可以使用流式细胞术进行分析。在这里，造血细胞显示出大量的CD45+前体细胞。
与同型对照相比，表达单核细胞标志物 CD14 和 CD11b 的细胞群通常占整个细胞群的三分之一。终末分化的IPSC衍生的破骨细胞可以在显微镜下观察为TRAP阳性多核细胞。共聚焦显微镜显示细胞染色组织蛋白酶 K.功能测定（如骨或矿物质吸收测定）可进一步定量破骨细胞活性。
在这里，在成像前用 10% 漂白剂去除成熟的破骨细胞后可以看到吸收坑，而未添加 RANK 配体处理的 M-CSF 成熟破骨细胞前体不显示吸收坑。结论。该协议能够稳健可靠地区分人类破骨细胞，并可以为骨病或涉及过度钙化的疾病提供现成的解决方案。我们使用破骨细胞将它们进一步设计到我们的 RANK 细胞中，这些细胞使用细胞内信号转导结构域，该信号结构域可以与二聚化的化学诱导剂一起激活，以实现受控和不依赖骨保护素的破骨细胞激活。
