Questo lavoro è stato supportato dal National Institutes of Health (R01 AR061164-01A1).

Tutte le procedure sperimentali sono state approvate dal comitato di utilizzo presso il Maine Medical Center Research Institute e istituzionali Animal Care.
1. la raccolta di tubi preparazione
<ol><li>Rendere i terreni di coltura BMSC completando α Medium essenziale minimo (MEM α) con 10% siero bovino fetale e l'1% di penicillina/streptomicina.</li>
	<li>Posto 100 µ l di terreno di coltura BMSC in provette per microcentrifuga da 1,5 mL. 3 ossa solitamente si adattano in una singola provetta così prepararsi di conseguenza.</li>
	<li>Tagliare le estremità di 200 µ l puntali per abbastanza così che si inseriscono le provette da centrifuga. Inserire le punte all'interno dei tubi e accertarsi che i coperchi possono chiudere prima di posizionare i tubi sul ghiaccio. Nota: In alternativa, microcentrifuga 0,75 mL con il taglio di estremità può essere inserito nel tubo per microcentrifuga da 1,5 mL.</li>
</ol>2. raccolta delle ossa da topi
<ol><li>Eutanasia degli animali usando CO2 seguita da dislocazione cervicale e spruzzateli con etanolo al 70%. Nota: Assicurarsi che gli animali da stesso sesso e, preferibilmente, della stessa età sono usati. Utilizziamo abitualmente animali di età 7-8 settimane. Si consiglia di pool di cellule da almeno 3 animali per gruppi sperimentali per produrre una popolazione di cellule rappresentative e riproducibile migliore.</li>
	<li>
Posizionare il mouse eutanasizzato sulla sua schiena su una tavola di dissezione. Utilizzare pinze per creare una tenda di pelle sull'addome. Praticare una piccola incisione (1 cm circa) utilizzando forbici per dissezione sterili. Stacchi la pelle verso gli arti e i piedi dal taglio al fine di esporre la parte inferiore dell'addome e le gambe.
	<ol>
<li>Tagliare sotto la caviglia giunto a rimuovere il piede. Tagliare lungo la cresta iliaca dell'anca per separare la testa del femore dalla pelvi. Mentre il mouse è ancora sulla sua schiena, fare un'incisione al centro la pelvi per separare le due ossa iliache.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Utilizzando salviette privo di lanugine, rimuovere con cautela il muscolo da femori, delle tibie e ossa iliache. Nota: Il taglio tanto di tendini e muscolo dall'osso come possibile rende la pulizia più veloce e più facile con le salviettine pelucchi (ad es., kimwipes). Prestare attenzione quando si manipolano le ossa come essi tendono a rompersi facilmente e la loro fragilità può essere aumentato con determinati genotipi.</li>
	<li>Una volta che tutti i campioni sono stati sezionati, metterli in PBS su ghiaccio e spostare in una cappa di coltura sterile per i passaggi rimanenti di isolamento. Nota: Lavorando in modo asettico per quanto possibile ridurrà il potenziale di contaminazione nelle culture.</li>
	<li>Fare piccoli tagli (circa 1-2 mm) a entrambe le estremità prossimale e distale delle ossa prima della loro immissione nelle punte sezionate all'interno dei tubi di centrifuga. Nota: Assicurarsi di tagliare una quantità sufficiente in modo che midollo possa essere centrifugato fuori; Tuttavia, si deve prestare attenzione per evitare di tagliare troppo, come le popolazioni delle cellule tendono a variare basata sulla vicinanza all'interno dello spazio del midollo.</li>
	<li>Centrifuga a 10.000 x g per 15 s a temperatura ambiente. Assicurarsi che il midollo è svuotato e pellettato nella parte inferiore del tubo da 1,5 mL, mentre le ossa sono all'interno degli inserti (entrambi 200 µ l dispensare suggerimento o 0,75 mL tubo del microcentrifuge). Una volta raccolti tutti il midollo, rimuovere gli inserti con le ossa dai tubi di raccolta. Nota: Se il midollo viene svuotato, le ossa apparirà bianche. Tuttavia, se midollo rimane in determinate ossa, riprovare le estremità di taglio e centrifugare.</li>
</ol>3. sospensione cellulare
<ol><li>Utilizzando un ago 25 G, tirare la cella pellet su e giù lentamente per spezzare ciuffi e combinare tutti i campioni in un tubo conico di soli 15ml. Aggiungere 10 mL di terreno di coltura di BMSC su 500 µ l di campioni.</li>
	<li>Inserire un filtro di 70 µm sulla cima di una provetta conica da 50 mL e passare la sospensione cellulare attraverso questo filtro per rimuovere i frammenti di osso possibile.</li>
</ol>4. placcatura e la cultura di popolazioni miste di cellule del midollo osseo (Totale BMCs)
Nota: Le cellule sono coltivate a 37 ° C in un incubatore con 5% CO2.
<ol><li>Calcolare il numero di cellule e impiattatelo a 1,0 x 106 cellule/cm2 in terreni di coltura. Consentire 72h di coltura mista per le celle da collegare. Nota: Si consiglia di diluire il 20x di sospensione cellulare in terreni di coltura e diluire nuovamente in trypan blu prima di contare le celle utilizzando un emocitometro. Per topi C57Bl6/J maschi 7-settimana-vecchio, cediamo ordinariamente un numero di cellulare di circa 50 x 106 cellule ma età, sesso e ceppo può influire cella numero notevolmente. Nota: Una popolazione di miscela delle cellule dovrebbe allegare bene nella parte inferiore della cultura.</li>
	<li>Dopo 72 h, rimuovere il supporto e sostituirlo con mezzi freschi. Proseguire cambiando i media ogni altro giorno e cerca confluency. Quando le cellule raggiungono confluency di 80-100%, sono pronti per la differenziazione. Nota: Perché questa cultura si mescola con BMSCs sia HSCs, può essere direttamente utilizzato per osteoblastogenesis, adipogenesis come pure osteoclastogenesi.</li>
</ol>5. placcatura e la cultura della popolazione Split di BMSCs (aderente BMSCs)
Nota: Le cellule sono coltivate a 37 ° C in un incubatore con 5% CO2.
<ol><li>Piastra di tutte le celle raccolte dai femori, delle tibie e ossa iliache di un topo in una piastra di coltura di 10 cm (55 cm2 di zona della coltura). Nota: Quando il pool 2-3 i topi C57BL/6J, abbiamo in genere piastra questa popolazione 'totale' del midollo osseo in un pallone da2 di 150 cm.</li>
	<li>Dopo 48 h di coltura mista, rimuovere il supporto di cultura (contenente le HSCs non aderente). Se osteoclastogenesi esperimenti devono essere eseguiti, impostare questa popolazione di cellule non aderenti a parte (Vedi sezione 7), in caso contrario, aspirare e scartare queste cellule.</li>
	<li>Lavare la piastra/boccetta con PBS con attenzione per non disturbare le cellule allegate.</li>
	<li>Rimuovere PBS e sollevare le cellule aggiungendo 0.25% tripsina e incubare a 37 ° C per un minimo di 1-3 estigue la tripsina aggiungendo cell supporti per la sospensione delle cellule. A questo punto, BMSC, che ora vengono sollevati, che può essere contato (come precedentemente fatto nel punto 4.1) e placcato per futuri esperimenti.</li>
	<li>Calcolare il numero di cellule necessarie per la placcatura. Centrifugare il volume richiesto di sospensione cellulare a 1.000 x g per 5 min a temperatura ambiente. Nota: Le cellule sono placcate tipicamente basato su esperimenti di end-point. Ad esempio, se proteina/RNA deve essere isolato abbiamo piastra in genere a una maggiore densità (~1.0-2.0 x 106 cellule/pozzetto in piastre da 6).</li>
	<li>Rimuovere il supporto e risospendere il pellet cellulare del volume di media cultura necessaria per la placcatura. Le cellule in coltura secondo gli esperimenti del piatto e consentire loro di fissare per un paio di giorni. Quando le BMSC raggiunge la confluenza, procedere per eseguire la differenziazione.</li>
</ol>6. differenziazione delle BMSCs
<ol><li>
Osteoblasti
	<ol>
<li>Fai media differenziazione degli osteoblasti aggiungendo 800 µ l di 1 M β-glicerolo fosfato in PBS e 200 µ l di acido ascorbico 0,5 M in PBS a 99 mL di terreno di coltura BMSC (Vedi punto 1.1 per la composizione dei terreni di coltura BMSC).<ol>
<li>Una volta confluenti BMSCs culture (Totale BMCs dal punto 4.3) o aderente BMSCs dal punto 5.6, li differenziano in osteoblasti commutando i terreni di coltura ai media di differenziazione degli osteoblasti.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Sostituire il supporto di differenziazione ogni altro giorno. Le cellule iniziano a produrre noduli bianchi di mineralizzazione. Visualizzarli con l'occhio nudo sul fondo del pozzo; Questo processo può verificarsi entro pochi giorni a 3 settimane.<ol>
<li>Al fine di valutare osteoblastogenesis, eseguire colorazione della fosfatasi alcalina e/o Von Kossa colorazione sui pozzi come descritto nella sezione 8. Nota: Cambiare il supporto attentamente inclinando le piastre con una leggera angolazione per evitare turbative di strato monomolecolare della cellula.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Adipociti
	<ol>
<li>Fai del adipocyte base media mescolando insieme 90 mL di Dulbecco per volta Eagle Medium (DMEM) alto glucosio, 10 mL di siero fetale bovino, 1 mL di penicillina/streptomicina, 100 µ l 20 mM Rosiglitazone e 100 µ l di 2 mM dell'insulina. Se necessario, è possibile memorizzare questo media a 4 ° C per tutta la settimana durante l'esperimento di differenziazione.</li>
		<li>Fanno del adipocyte induzione media con l'aggiunta di 200 µ l di 62,5 mM 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) e 25 µ l di 1 mM desametasone a 25 mL di Adipocyte Base Media.</li>
		<li>Una volta confluenti BMSCs culture (Totale BMCs dal punto 4.3) o aderente BMSCs dal punto 5.6, cambiare il supporto ai media di induzione del adipocyte. Considera questo giorno 0 di differenziazione.</li>
		<li>Dopo 48 h, è necessario rimuovere il supporto e aggiornare la cultura con i media di induzione del adipocyte.</li>
		<li>Il giorno 4, passare alla media base degli adipociti. Nota: Le goccioline del lipido possono iniziano ad apparire più presto giorno 2 o 4 giorni.</li>
		<li>Il giorno 7, osservare che le cellule hanno accumulato le goccioline del lipido massimo e visualizzano un fenotipo simile a un adipocita maturo. Cultura non oltre questo punto, che possono causare morte cellulare/distacco.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. differenziazione di HSCs in osteoclasti
<ol><li>Rendere Media differenziazione degli osteoclasti aggiungendo 50 µ l di 25 µ g/mL di recettore attivatore di NFKB Ligand (RANKL) e 15 µ l di 25 µ g/mL di macrophage Colony Stimulating Factor (mCSF) a 25 mL di terreno di coltura di BMSC.</li>
	<li>Una volta che il BMC totale (dal punto 4.3) o le cellule non-aderenti (dal punto 5.2) sono attaccate al pozzo, terreni di coltura può essere commutato a Media differenziazione degli osteoclasti. Ricostituire la media di differenziazione ogni altro giorno.</li>
	<li>Osservare le culture degli osteoclasti ogni giorno con un microscopio a ingrandimento 10x. Osservare che gli osteoclasti fondono e formano cellule multinucleate, tipicamente intorno a 5-7 ° giorno di differenziazione.</li>
</ol>8. colorazione
<ol><li>
Osteoblasti Nota: Per la colorazione della fosfatasi alcalina (AP), abbiamo spesso utilizzare una macchiatura AP kit (Vedi Tabella materiali) secondo le linee guida.<ol>
<li>Eseguire AP macchiatura seguendo le linee guida del produttore di kit.<ol>
<li>Media di aspirare e lavare le cellule con PBS. Fissare le cellule con 4% paraformaldeide (PFA) in PBS per 12 min a temperatura ambiente.</li>
			<li>Nel frattempo, rendono la soluzione AP utilizzando i reagenti da AP kit di colorazione aggiungendo 500 µ l nitrito di sodio in 500 µ l di soluzione alcalina FRV e mescolando delicatamente; Lasciate riposare per 2 min. aggiungere 22,5 mL dH2O e 500 µ l naftolo AS-BI alcalina. Mescolare delicatamente. Attenzione: PFA è tossico e deve essere maneggiato con cura.</li>
			<li>Una volta che le cellule sono fissi, risciacquare con PBS e aggiungere soluzione AP ad ogni pozzetto (1-2 mL per pozzetto). Coprire con foglio di alluminio e lasciate che la macchia per 30 min a temperatura ambiente al riparo dalla luce. Aspirare la soluzione, lavare con acqua distillata e fate asciugare la piastra.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Acquisire immagini delle colonie macchiati usando una macchina fotografica al fine di osservare le cellule positive della fosfatasi alcalina.</li>
		<li>In alternativa è possibile eseguire Von Kossa invece di macchiatura della fosfatasi alcalina. Per questo, pozzi di lavare accuratamente con acqua distillata come qualsiasi restante PBS precipiterà con nitrato d'argento.
		<ol>
<li>Fissare le cellule con 4% PFA in PBS per 12 min a temperatura ambiente. Quindi, aggiungere la soluzione di nitrato d'argento abbastanza 5% per coprire il pozzo ed esporre alla luce forte per 1 h a temperatura ambiente.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Rimuovere la soluzione di nitrato d'argento e sciacquare ogni pozzetto con acqua distillata. Aggiungere la soluzione di tiosolfato di sodio 5% alle cellule e lasciate riposare per 3 minuti.</li>
		<li>Il tiosolfato di sodio di aspirare e lavare con acqua distillata. Lasciate la piastra asciugare e osservare il deposito minerale colorato in marrone scuro/nero con occhio nudo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Adipociti
	<ol>
<li>Per la colorazione di olio rosso O (ORO), fissare le cellule con 10% neutra tamponata formalina per 1 h a temperatura ambiente.</li>
		<li>Nel frattempo, rendono la soluzione di Stock di ORO sciogliendo 0,035 g in 10 mL di isopropanolo. Questo è sufficiente per una piastra a 6 pozzetti. Mescolare e filtrare la soluzione utilizzando un filtro di carta (poro taglia 11 µm).</li>
		<li>Rendere la soluzione di lavoro di ORO diluendo 9 mL di soluzione di riserva di ORO con 6 mL di acqua distillata. Lasciare la soluzione su un agitatore meccanico fino a che pronto per l'uso.</li>
		<li>Preparare 60% isopropanolo in acqua distillata (fare abbastanza per coprire ogni bene).</li>
		<li>Una volta che le cellule sono fissi, rimuovere una volta fissativa e lavare con acqua distillata. Sostituire l'acqua con la soluzione di isopropanolo 60% per 1 min. Nota: Aggiungere il liquido lentamente mentre le mance la piastra; adipociti sloggiare molto facilmente.</li>
		<li>Rimuovere l'isopropanolo e aggiungere la soluzione di lavoro abbastanza ORO per coprire tutte le celle. Incubare per 15 minuti su un rocker di bassa velocità a temperatura ambiente. ORO di rimuovere e lavare due volte con acqua distillata. Nota: A questo punto, le goccioline del lipido tinto ORO possono essere visualizzate sotto il microscopio.</li>
		<li>Per quantificare i ORO, decolorare l'ORO aggiungendo 1 mL di isopropanolo 100% ad ogni pozzetto e da dondolo lentamente per 10 min.</li>
		<li>Nel frattempo, preparare una serie di diluizioni per creare una curva standard basata sui seguenti 8 standard utilizzando la soluzione di lavoro di ORO (2.100 µ g/mL) e isopropanolo come diluente: 500, 350, 300, 250, 150, 100, 75 e 0 µ g/mL.</li>
		<li>Caricare 200 µ l di standard e i campioni destained in triplici copie su un piatto e leggere l'assorbanza a 490 nm.<ol>
<li>Determinare la concentrazione di ORO per ogni campione basato sulla curva standard. Nota: Si consiglia di normalizzare la concentrazione di ORO al numero di cellulare. Numero di cellulare può essere quantificato di cristalvioletto macchiatura o quantità del DNA.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Osteoclasti Nota: Quando si è pronti, si consiglia di macchiatura osteoclasti per tartrato-resistente acido fosfatasi (trappola) usando la macchiatura trappola kit (Vedi Tabella materiali).<ol>
<li>Per trappola macchiatura, Difficoltà cellule per 30 min a temperatura ambiente con 2,5% glutaraldeide in PBS. Nel frattempo, fare la soluzione di trappola mescolando insieme 50 µ l di soluzione di Base Fast granati, 50 µ l di nitrito di sodio, 4,55 mL di acqua distillata, 50 µ l di Napthol AS-Biphosphate, 200 µ l di soluzione di acetato e 100 µ l di soluzione di tartrato.</li>
		<li>Aspirate fuori fissativo e sciacquare le cellule con PBS due volte prima di aggiungere la soluzione di trappola per 1h a 37 ° C.</li>
		<li>Lavare con acqua distillata prima di contare gli osteoclasti al microscopio (ingrandimento 10x). Le cellule di trappola+ compaiono viola con 3 o più nuclei.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Friedenstein, A. J., Latzinik, N. W., Grosheva, A. G., Gorskaya, U. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marrow+microenvironment+transfer+by+heterotopic+transplantation+of+freshly+isolated+and+cultured+cells+in+porous+sponges.">Marrow microenvironment transfer by heterotopic transplantation of freshly isolated and cultured cells in porous sponges.</a> Exp Hematol. 10 (2), 217-227 (1982).</li><li>Chen, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+growth+and+differentiation+of+osteoprogenitors+in+mouse+bone+marrow+stromal+cell+cultures+by+increased+donor+age+and+glucocorticoid+treatment.">Inhibition of growth and differentiation of osteoprogenitors in mouse bone marrow stromal cell cultures by increased donor age and glucocorticoid treatment.</a> Bone. 35 (1), 83-95 (2004).</li><li>Kokabu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP3+suppresses+osteoblast+differentiation+of+bone+marrow+stromal+cells+via+interaction+with+Acvr2b.">BMP3 suppresses osteoblast differentiation of bone marrow stromal cells via interaction with Acvr2b.</a> Mol Endocrinol. 26 (1), 87-94 (2012).</li><li>Ghali, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dexamethasone+in+osteogenic+medium+strongly+induces+adipocyte+differentiation+of+mouse+bone+marrow+stromal+cells+and+increases+osteoblast+differentiation.">Dexamethasone in osteogenic medium strongly induces adipocyte differentiation of mouse bone marrow stromal cells and increases osteoblast differentiation.</a> BMC Cell Biol. 16, 9 (2015).</li><li>Kretlow, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Donor+age+and+cell+passage+affects+differentiation+potential+of+murine+bone+marrow-derived+stem+cells.">Donor age and cell passage affects differentiation potential of murine bone marrow-derived stem cells.</a> BMC Cell Biol. 9, 60 (2008).</li><li>DeMambro, V. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Igfbp2+Deletion+in+Ovariectomized+Mice+Enhances+Energy+Expenditure+but+Accelerates+Bone+Loss.">Igfbp2 Deletion in Ovariectomized Mice Enhances Energy Expenditure but Accelerates Bone Loss.</a> Endocrinology. 156 (11), 4129-4140 (2015).</li><li>Maridas, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IGFBP-4+regulates+adult+skeletal+growth+in+a+sex-specific+manner.">IGFBP-4 regulates adult skeletal growth in a sex-specific manner.</a> J Endocrinol. 233 (1), 131-144 (2017).</li><li>Nadri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+method+for+isolation+of+murine+bone+marrow+mesenchymal+stem+cells.">An efficient method for isolation of murine bone marrow mesenchymal stem cells.</a> Int J Dev Biol. 51 (8), 723-729 (2007).</li><li>Sreejit, P., Dilip, K. B., Verma, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+mesenchymal+stem+cell+lines+from+murine+bone+marrow.">Generation of mesenchymal stem cell lines from murine bone marrow.</a> Cell Tissue Res. 350 (1), 55-68 (2012).</li><li>Abdallah, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD34+defines+an+osteoprogenitor+cell+population+in+mouse+bone+marrow+stromal+cells.">CD34 defines an osteoprogenitor cell population in mouse bone marrow stromal cells.</a> Stem Cell Res. 15 (3), 449-458 (2015).</li><li>Akiyama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+bone+marrow+derived+mesenchymal+stem+cells+in+suspension.">Characterization of bone marrow derived mesenchymal stem cells in suspension.</a> Stem Cell Res Ther. 3 (5), 40 (2012).</li><li>Lin, C. S., Ning, H., Lin, G., Lue, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+CD34+truly+a+negative+marker+for+mesenchymal+stromal+cells?.">Is CD34 truly a negative marker for mesenchymal stromal cells?.</a> Cytotherapy. 14 (10), 1159-1163 (2012).</li></ol>

Gli autori divulgare che non hanno nessuna finanziaria conflitto di interessi.

In questo articolo, sono disponibili due metodi di coltura di BMSC con i loro vantaggi e limitazioni. Isolamento di cellule provenienti dal midollo osseo è un processo relativamente semplice. Tuttavia, ottenere una popolazione di cellule rappresentativa della cellule staminali mesenchimali o progenitori osteoclastic può essere difficile a causa di vario ambiente cellulare della cavità del midollo.
La totalità del contenuto del midollo osseo la coltura fornisce una rappresentazione stretta ...

BMSCs murino primario sono comunemente usati come modello in vitro di cellule staminali mesenchimali fin dalla loro scoperta nel primi anni 19801. Infatti, colture di cellule di plastica-aderente svuotate dalla cavità del midollo osseo delle ossa lunghe mantengono la capacità di differenziarsi in osteoblasti, osteoclasti, condrociti o adipociti in molti studi2,3, 4 , 5. Tuttavia, il midollo osseo è un tessuto unico composto di molte popolazioni differenti delle cellule, tra cui, ma non limitato a, BMSC, HSCs, cellule endoteliali ed immuni. Così, isolamento e tecniche di coltura possono portare a popolazioni di cellule con diverse omogeneità. Utilizzando tali tecniche per testare il potenziale di differenziazione dalle cellule può essere impegnativo. Ad esempio, quando si confrontano le cellule dai topi con genotipi differenti, a partire con una popolazione di cellule miste limita l'interpretazione dei dati. Al contrario, ottenere popolazioni omogenee di BMSC e HSCs può essere tecnicamente difficile e potrebbe non essere più rappresentativo di un modello ex vivo .
Nel nostro laboratorio, siamo principalmente interessati nell'utilizzazione di BMSCs a causa del loro potenziale di differenziarsi in osteoblasti, osteoclasti e adipociti. Qui, presentiamo tecniche di isolamento BMSCs e HSCs e impostazioni cultura utilizzate per valutare osteoblastogenesis o adipogenesis in vitro, così come le culture di HSCs per differenziarsi in osteoclasti. Un metodo utilizza una popolazione mista di cellule del midollo osseo (BMC) contenente BMSCs e HSCs direttamente adatto per adipogenesis, osteoblastogenesis e osteoclastogenesis (chiamato BMCs totale). Questo metodo è una rappresentazione più vicina ex vivo dell'eterogeneità tra le cellule del microambiente midollare. Un altro metodo separa aderente da cellule non aderenti nel tentativo di popolazioni "pure" coltura di BMSC e HSC (chiamato aderente BMSCs). Il metodo successivo consente la coltura delle cellule esperimenti per iniziare con un numero più preciso di BMSCs o HSCs e riduce il potenziale di effetti complessi indiretti di altre popolazioni di cellule che rimangono nella cultura. Entrambi i metodi sono stati precedentemente pubblicati e utilizzati per indirizzo ricerca diverse domande6,7,8,9.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="636">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">200&#956;L pipet tips&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Rainin</td>
			<td style="width:119px;">17014401</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1.5mL centrifuge tubes</td>
			<td style="width:135px;">USA Scientific</td>
			<td>1615-5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">15mL conical tube&#160;</td>
			<td style="width:135px;">VWR</td>
			<td>89039-668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50mL conical tube</td>
			<td style="width:135px;">VWR</td>
			<td>89039-660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">21-040-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol</td>
			<td style="width:135px;">Fisher Science</td>
			<td>04-355-451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dissection tools</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">70&#956;m filters</td>
			<td style="width:135px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.25% trypsin</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kimwipe</td>
			<td style="width:135px;">VWR</td>
			<td>82003-820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td style="width:135px;">Electron Microscopy Science</td>
			<td style="width:119px;">15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alkaline Phosphatase kit</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">86R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silver Nitrate</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S6506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Thiosulfate</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S7026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Oil Red O</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">O0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isopropanol</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>190764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10% Neutral Buffered Formalin</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>F5554-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Whatman filter Grade 1</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z274852</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tartrate-Resistant Acid Phosphatase kit</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">387A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glutaraldehyde</td>
			<td style="width:135px;">Electron</td>
			<td style="width:119px;">16220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MEM&#945;</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">12571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:135px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">97068-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:135px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">&#946;-glycerol phosphate</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G9891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ascorbic acid</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A4544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM High Glucose&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D5796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Rosiglitazone</td>
			<td style="width:135px;">Cayman Chemical</td>
			<td style="width:119px;">717410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Insulin</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">I6634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">IBMX</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">I5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dexamethasone</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D4902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">RANKL</td>
			<td style="width:135px;">Peprotech</td>
			<td style="width:119px;">310-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">mCSF</td>
			<td style="width:135px;">Peprotech</td>
			<td style="width:119px;">315-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Axio Observer inverter microscope</td>
			<td style="width:135px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, culture, and differentiation of bone marrow stromal cells and osteoclast progenitors from mice

Cellule stromali del midollo osseo (BMSC) costituiscono una popolazione di cellule ordinariamente utilizzata come rappresentazione delle cellule staminali mesenchimali in vitro. Essi risiedono all'interno della cavità del midollo osseo al fianco di cellule staminali ematopoietiche (HSCs), che possono dare origine a globuli rossi, dei progenitori immuni e gli osteoclasti. Così, le estrazioni delle popolazioni delle cellule dai risultati del midollo osseo in un mix eterogeneo di varie popolazioni di cellule, che possono presentare sfide nel disegno sperimentale e confondere l'interpretazione dei dati. Diversi di isolamento e tecniche di coltura sono state sviluppate nei laboratori al fine di ottenere popolazioni più o meno omogenee di BMSC e HSCs invitro. Qui, presentiamo due metodi per l'isolamento di BMSC e HSCs da ossa lunghe del mouse: un metodo che produce una popolazione mista di BMSC e HSCs e un metodo che tenta di separare le due popolazioni di cellule basato su aderenza. Entrambi i metodi forniscono adatto per le cellule osteogeniche e adipogenico differenziazione esperimenti saggi anche come funzionali.

Panoramica delle colture cellulari Le tecniche di due cultura permettono la valutazione di differenziazione su una popolazione mista di BMCs composto da BMSC e HSC (BMCs totale, Figura 1A) o di una popolazione di BMSCs diviso da HSC (BMSCs aderente, Figura 1B). 48 ore dopo che le cellule dal midollo sono isolate e placcato (Figura 1), essi rapidamente fissare alla parte inferiore ...

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Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice

In questo articolo, presentiamo metodi per isolare e differenziare cellule stromali del midollo osseo e cellule staminali ematopoietiche da ossa lunghe del mouse. Due differenti protocolli sono presentati ottenendo diverse popolazioni cellulari adatte per espansione e differenziazione in osteoblasti, adipociti e gli osteoclasti.

Isolamento, la cultura e la differenziazione delle cellule stromali del midollo osseo e dei progenitori degli osteoclasti dai topi

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within ...

isolation-culture-differentiation-bone-marrow-stromal-cells

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

30.8K Views.  Maine Medical Center Research Institute. In questo articolo, presentiamo metodi per isolare e differenziare cellule stromali del midollo osseo e cellule staminali ematopoietiche da ossa lunghe del mouse. Due differenti protocolli sono presentati ottenendo diverse popolazioni cellulari adatte per espansione e differenziazione in osteoblasti, adipociti e gli osteoclasti.

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Isolation and Enrichment of Human Adipose-derived Stromal Cells for Enhanced Osteogenesis

Bone marrow-derived mesenchymal stromal cells (BM-MSCs) are considered the gold standard for stem cell-based tissue engineering applications. However, the process by which they must be harvested can be associated with significant donor site morbidity. In contrast, adipose-derived stromal cells (ASCs) are more readily abundant and more easily harvested, making them an appealing alternative to BM-MSCs. Like BM-MSCs, ASCs can differentiate into osteogenic lineage cells and can be used in tissue engineering applications, such as seeding onto scaffolds for use in craniofacial skeletal defects. ASCs are obtained from the stromal vascular fraction (SVF) of digested adipose tissue, which is a heterogeneous mixture of ASCs, vascular endothelial and mural cells, smooth muscle cells, pericytes, fibroblasts, and circulating cells. Flow cytometric analysis has shown that the surface marker profile for ASCs is similar to that for BM-MSCs. Despite several published reports establishing markers for the ASC phenotype, there is still a lack of consensus over profiles identifying osteoprogenitor cells in this heterogeneous population. This protocol describes how to isolate and use a subpopulation of ASCs with enhanced osteogenic capacity to repair critical-sized calvarial defects.

The transcriptional heterogeneity within human adipose-derived stromal cells can be defined on the single cell level using cell surface markers and osteogenic genes. We describe a protocol utilizing flow cytometry for the isolation of cell subpopulations with increased osteogenic potential, which may be used to enhance craniofacial skeletal reconstruction.

Isolamento e arricchimento di Human derivate da tessuto adiposo cellule stromali di Osteogenesi avanzata

Bone marrow-derived mesenchymal stromal cells (BM-MSCs) are considered the gold standard for stem cell-based tissue engineering applications. However, the ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

An Enzymatic Method to Rescue Mesenchymal Stem Cells from Clotted Bone Marrow Samples

Mesenchymal stem cells (MSCs) - usually obtained from bone marrow - often require expansion culture. Our protocol uses clinical grade urokinase to degrade clots in the bone marrow and release MSCs for further use. This protocol provides a rapid and inexpensive alternative to bone marrow resampling. Bone marrow is a major source of MSCs, which are interesting for tissue engineering and autologous stem cell therapies. Upon withdrawal bone marrow may clot, as it comprises all of the hematopoietic system. The resulting clots contain also MSCs that are lost for expansion culture or direct stem cell therapy. We experienced that 74% of canine bone marrow samples contained clots and yielded less than half of the stem cell number expected from unclotted samples. Thus, we developed a protocol for enzymatic digestion of those clots to avoid labor-intense and costly bone marrow resampling. Urokinase - a clinically approved and readily available thrombolytic drug &#8211; clears away the bone marrow clots almost completely. As a consequence, treated bone marrow aspirates yield similar numbers of MSCs as unclotted samples. Also, after urokinase treatment the cells kept their metabolic activity and the ability to differentiate into chondrogenic, osteogenic and adipogenic lineages. Our protocol salvages clotted blood and bone marrow samples without affecting the quality of the cells. This obsoletes resampling, considerably reduces sampling costs and enables the use of clotted samples for research or therapy.

Mesenchymal stem cells are usually obtained from bone marrow and require expansion culture. When samples clot before processing, a protocol using the (enzymatic) thrombolytic drug urokinase can be applied to degrade the clot. Thus, cells are released and available for expansion culture. This protocol provides a rapid and inexpensive alternative to resampling.

Un metodo enzimatico per salvare cellule staminali mesenchimali da coagulata midollo osseo da analizzare

Mesenchymal stem cells (MSCs) - usually obtained from bone marrow - often require expansion culture. Our protocol uses clinical grade urokinase to degrade ...

Isolation and Differentiation of Adipose-Derived Stem Cells from Porcine Subcutaneous Adipose Tissues

Obesity is an unconstrained worldwide epidemic. Unraveling molecular controls in adipose tissue development holds promise to treat obesity or diabetes. Although numerous immortalized adipogenic cell lines have been established, adipose-derived stem cells from the stromal vascular fraction of subcutaneous white adipose tissues provide a reliable cellular system ex vivo much closer to adipose development in vivo. Pig adipose-derived stem cells (pADSC) are isolated from 7- to 9-day old piglets. The dorsal white fat depot of porcine subcutaneous adipose tissues is sliced, minced and collagenase digested. These pADSC exhibit strong potential to differentiate into adipocytes. Moreover, the pADSC also possess multipotency, assessed by selective stem cell markers, to differentiate into various mesenchymal cell types including adipocytes, osteocytes, and chondrocytes. These pADSC can be used for clarification of molecular switches in regulating classical adipocyte differentiation or in direction to other mesenchymal cell types of mesodermal origin. Furthermore, extended lineages into cells of ectodermal and endodermal origin have recently been achieved. Therefore, pADSC derived in this protocol provide an abundant and assessable source of adult mesenchymal stem cells with full multipotency for studying adipose development and application to tissue engineering of regenerative medicine.

This protocol describes the isolation of pig adipose-derived stem cells (pADSC) from subcutaneous adipose tissues with examination of multipotency. The multipotent pADSC are used to delineate processes of adipocyte differentiation and study transdifferentiation into multiple cell lineages of mesodermal mesenchyme or further lineages of ectoderm and endoderm for regenerative studies.

Isolamento e differenziazione delle cellule staminali derivate da tessuto adiposo sottocutaneo da Suini tessuti adiposi

Obesity is an unconstrained worldwide epidemic. Unraveling molecular controls in adipose tissue development holds promise to treat obesity or diabetes. ...

Isolation and Expansion of Mesenchymal Stem/Stromal Cells Derived from Human Placenta Tissue

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose dependent. Human term placenta is rich in MSC and is a physically large tissue that is generally discarded following birth. Placenta is an ideal starting material for the large-scale manufacture of multiple cell doses of allogeneic MSC. The placenta is a fetomaternal organ from which either fetal or maternal tissue can be isolated. This article describes the placental anatomy and procedure to dissect apart the decidua (maternal), chorionic villi (fetal), and chorionic plate (fetal) tissue. The protocol then outlines how to isolate MSC from each dissected tissue region, and provides representative analysis of expanded MSC derived from the respective tissue types. These methods are intended for pre-clinical MSC isolation, but have also been adapted for clinical manufacture of placental MSC for human therapeutic use.

Herein we describe methods for the dissection of fetal and maternal tissues from human term placenta, followed by isolation and expansion of mesenchymal stem/stromal cells (MSC) from these tissues.

Isolamento e l&#39;espansione delle staminali mesenchimali stromali derivate / cellule da placenta umana Tissue

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose ...

Isolating Mesangiogenic Progenitor Cells (MPCs) from Human Bone Marrow

In a research study aimed to isolate human bone marrow (hBM)-derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) for clinical applications, we identified a novel cell population specifically selected for growth in human serum supplemented medium. These cells are characterized by morphological, phenotypic, and molecular features distinct from MSCs and we named them Mesodermal Progenitor Cells (MPCs). MPCs are round, with a thick highly refringent core region; they show strong, trypsin resistant adherence to plastic. Failure to expand MPCs directly revealed that they are slow in cycling. This is as also suggested by Ki-67 negativity. On the other hand, culturing MPCs in standard medium designed for MSC expansion, gave rise to a population of exponentially growing MSC-like cells. Besides showing mesenchymal differentiation capacity MPCs retained angiogenic potential, confirming their multiple lineage progenitor nature. Here we describe an optimized highly reproducible protocol to isolate and characterize hBM-MPCs by flow cytometry (CD73, CD90, CD31, and CD45), nestin expression, and F-actin organization. Protocols for mesengenic and angiogenic differentiation of MPCs are also provided. Here we also suggest a more appropriate nomenclature for these cells, which has been re-named as "Mesangiogenic Progenitor Cells".

Isolating Mesangiogenic Progenitor Cells MPCs from Human Bone Marrow

Here we describe an optimized, highly reproducible protocol to isolate Mesodermal Progenitor Cells (MPCs) from human bone marrow (hBM). MPCs were characterized by flow cytometry and nestin expression. They showed the ability to give rise to exponentially growing MSC-like cell cultures while retaining their angiogenic potential.

Isolare le cellule progenitrici Mesangiogenic (PPM) da midollo osseo umano

In a research study aimed to isolate human bone marrow (hBM)-derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) for clinical applications, we identified a novel ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust methods for the large-scale production of functional cell types, including cardiomyocytes. Here we demonstrate that the temporal manipulation of WNT, TGF-&#946;, and SHH signaling pathways leads to highly efficient cardiomyocyte differentiation of single-cell passaged hPSC lines in both static suspension and stirred suspension bioreactor systems. Employing this strategy resulted in ~ 100% beating spheroids, consistently containing &#62; 80% cardiac troponin T-positive cells after 15 days of culture, validated in multiple hPSC lines. We also report on a variation of this protocol for use with cell lines not currently adapted to single-cell passaging, the success of which has been verified in 42 hPSC lines. Cardiomyocytes generated using these protocols express lineage-specific markers and show expected electrophysiological functionalities. Our protocol presents a simple, efficient and robust platform for the large-scale production of human cardiomyocytes.

Here, we present a robust, fast and scalable cardiomyocyte differentiation protocol for human pluripotent stem cells (hPSCs). Cardiomyocytes derived using this large-scale method can provide sufficient cell numbers for their effective use in human cardiovascular disease modeling, high-throughput drug screening, and potentially clinical applications.

Produzione su larga scala dei cardiomiociti da cellule staminali umane pluripotenti usando un altamente riproducibile piccole molecole-Based Differenziazione protocollo

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Isolation of Mouse Endometrial Epithelial and Stromal Cells for In Vitro Decidualization

Decidualization is a progesterone-dependent differentiation process of endometrial stromal cells and is a prerequisite for successful embryo implantation. Although many efforts have been made to reveal the underlying mechanisms of decidualization, the exact signaling between the epithelial cells that are in contact with the embryo and the underlying stromal cells remains poorly understood. Therefore, studying decidualization in a way that takes both the epithelial and stromal cells into account could improve our knowledge about the molecular details of decidualization. For this purpose, in vivo models of artificial decidualization are physiologically the most relevant; however, manipulation of intercellular communication is limited. Currently, in vitro cultures of endometrial stromal cells are being used to investigate the modulation of decidualization by several signaling molecules. Conventionally, human or mouse endometrial stromal cells are used. However, the availability of human samples is very often limited. Furthermore, the use of murine tissues is accompanied with variety in the method of culturing. This study presents a validated and standardized method to obtain pure Endometrial Epithelial Cell (EEC) and Stromal Cell (ESC) cultures using adult intact mice treated with estrogen for three consecutive days. The protocol is optimized to improve the yield, viability, and purity of the cells and was further extended in order to study decidualization in a coculture of EEC and ESC. This model may be suitable to exploit the importance of both cell types in decidualization and to evaluate the contribution of significant signaling molecules secreted by EEC or ESC during the intercellular communication.

Isolation of Mouse Endometrial Epithelial and Stromal Cells for In Vitro Decidualization

This study presents a standardized and validated method for the isolation and culture of primary mouse endometrial stromal and epithelial cells, which can be used in a coculture system to study in vitro decidualization.

Isolamento di mouse endometriale epiteliali e stromali cellule per<em&gt; In Vitro</em&gt; decidualizzazione

Decidualization is a progesterone-dependent differentiation process of endometrial stromal cells and is a prerequisite for successful embryo implantation. ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem cells (hPSCs). Until recently, efforts to differentiate hPSCs into HSCs have predominantly generated hematopoietic progenitors that lack HSC potential, and instead resemble yolk sac hematopoiesis.&#160;These resulting hematopoietic progenitors may have limited utility for in vitro disease modeling of various adult hematopoietic disorders, particularly those of the lymphoid lineages. However, we have recently described methods to generate erythro-myelo-lymphoid multilineage definitive hematopoietic progenitors from hPSCs using a stage-specific directed differentiation protocol, which we outline here. Through enzymatic dissociation of hPSCs on basement membrane matrix-coated plasticware, embryoid bodies (EBs) are formed. EBs are differentiated to mesoderm by recombinant BMP4, which is subsequently specified to the definitive hematopoietic program by the GSK3&#946; inhibitor, CHIR99021. Alternatively, primitive hematopoiesis is specified by the PORCN inhibitor, IWP2. Hematopoiesis is further driven through the addition of recombinant VEGF and supportive hematopoietic cytokines. The resulting hematopoietic progenitors generated using this method have the potential to be used for disease and developmental modeling, in vitro.

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, used to differentiate hPSCs into CD34+ hematopoietic progenitors. This method uses stage-specific manipulation of canonical WNT signaling to specify cells exclusively to either the definitive or primitive hematopoietic program.

Regia di differenziazione dei progenitori ematopoietici primitivi e definitivo da cellule staminali pluripotenti umane

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Isolation and Characterization of Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly gained attention because they do not pose any ethical or moral concerns. Current methods to isolate MSCs from UC yield low amounts of cells with variable proliferation potentials. Since UC is an anatomically-complex organ, differences in MSC properties may be due to the differences in the anatomical regions of their isolation. In this study, we first dissected the cord/placenta samples into three discrete anatomical regions: UC, cord-placenta junction (CPJ), and fetal placenta (FP). Second, two distinct zones, cord lining (CL) and Wharton&#39;s jelly (WJ), were separated. The explant culture technique was then used to isolate cells from the four sources. The time required for the primary culture of cells from the explants varied depending on the source of the tissue. Outgrowth of the cells occurred within 3 - 4 days of the CPJ explants, whereas growth was observed after 7 - 10 days and 11 - 14 days from CL/WJ and FP explants, respectively. The isolated cells were adherent to plastic and displayed fibroblastoid morphology and surface markers, such as CD29, CD44, CD73, CD90, and CD105, similarly to bone marrow (BM)-derived MSCs. However, the colony-forming efficiency of the cells varied, with CPJ-MSCs and WJ-MSCs showing higher efficiency than BM-MSCs. MSCs from all four sources differentiated into adipogenic, chondrogenic, and osteogenic lineages, indicating that they were multipotent. CPJ-MSCs differentiated more efficiently in comparison to other MSC sources. These results suggest that the CPJ is the most potent anatomical region and yields a higher number of cells, with greater proliferation and self-renewal capacities in vitro. In conclusion, the comparative analysis of the MSCs from the four sources indicated that CPJ is a more promising source of MSCs for cell therapy, regenerative medicine, and tissue engineering.

Here, we present a protocol for the dissection of human umbilical cord (UC) and fetal placenta sample into cord lining (CL), Wharton&#39;s jelly (WJ), cord-placenta junction (CPJ), and fetal placenta (FP) for the isolation and characterization of mesenchymal stromal cells (MSCs) using the explant culture technique.

Isolamento e caratterizzazione di cellule mesenchimali stromali dal Cordone ombelicale e placenta fetale

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly ...

A RANKL-based Osteoclast Culture Assay of Mouse Bone Marrow to Investigate the Role of mTORC1 in Osteoclast Formation

Osteoclasts are unique bone-resorbing cells that differentiate from the monocyte/macrophage lineage of bone marrow. Dysfunction of osteoclasts may result in a series of bone metabolic diseases, including osteoporosis. To develop pharmaceutical targets for the prevention of pathological bone mass loss, the mechanisms by which osteoclasts differentiate from precursors must be understood. The ability to isolate and culture a large number of osteoclasts in vitro is critical in order to determine the role of specific genes in osteoclast differentiation. Inactivation of the mammalian/mechanistic target of rapamycin complex 1 (TORC1) in osteoclasts can decrease osteoclast number and increase bone mass; however, the underlying mechanisms require further study. In the present study, a RANKL-based protocol to isolate and culture osteoclasts from mouse bone marrow and to study the influence of mTORC1 inactivation on osteoclast formation is described. This protocol successfully resulted in a large number of giant osteoclasts, typically within one week. Deletion of Raptor impaired osteoclast formation and decreased the activity of secretory tartrate-resistant acid phosphatase, indicating that mTORC1 is critical for osteoclast formation.

This manuscript describes a protocol to isolate and culture osteoclasts in vitro from mouse bone marrow, and to study the role of the mammalian/mechanistic target of rapamycin complex 1 in osteoclast formation.

Un base di RANKL Osteoclast cultura Assay di midollo osseo del topo per studiare il ruolo di mTORC1 nella formazione degli osteoclasti

Osteoclasts are unique bone-resorbing cells that differentiate from the monocyte/macrophage lineage of bone marrow. Dysfunction of osteoclasts may result ...