Ringraziamo Christine Holt e Bill Harris per l'aiuto con la microscopia confocale. Ringraziamo Darren Gilmour per i costrutti della spina dorsale del timer fluorescente e Anna Huttenlocher per il vettore backbone Tol2-Lyz. Ringraziamo Steve Renshaw per la linea Tg(mpx:GFP)i114 . Questo lavoro è stato supportato dal MRC (MR/L019523/1), dal Wellcome Trust [204845/Z/16/Z]; Isaac Newton Trust [12.21(a)i] e una sovvenzione Isaac Newton Trust 19.23(n). C.C. è stato supportato da un MRC DTP studentship e in parte dal Wellcome Trust [204845/Z/16/Z]; Isaac Newton Trust [12.21(a)i] sovvenzione. H.W. è stato supportato da un MRC DTP Studentship. H.P. è stato supportato da una sovvenzione di dottorato Wellcome Trust (105391 / Z / 14 / Z) e in parte da un Wellcome Trust [204845 / Z / 16 / Z]; Isaac Newton Trust [12.21(a)i] sovvenzione e MRC (MR/L019523/1).

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Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi

Il metodo descritto consente l'imaging dal vivo della dinamica dei recettori in risposta a ligandi endogeni in situ durante una risposta infiammatoria al danno tissutale. L'uso di reporter neutrofili Cxcr1/Cxcr2 potrebbe essere esteso ad altri contesti fisiologici, come infezioni, modelli tumorali o altri tipi di danno tissutale 14,25,26,27. Inoltre, le linee di salvataggio transgeniche, in cui il recettore endogeno viene soppresso e salvato da un recettore mutante esogeno, potrebbero fornire strumenti utili per analizzare l'importanza di specifici modelli di migrazione dei neutrofili nelle risposte immunitarie. Ad esempio, i mutanti del recettore Cxcr1 che hanno una desensibilizzazione compromessa causano un raggruppamento di neutrofili più prominente nei siti infiammatori14. Questo fenotipo di guadagno di funzione potrebbe essere utilizzato per comprendere il ruolo della congregazione dei neutrofili in diversi processi fisiologici, ad esempio la riparazione delle ferite, le malattie infettive o l'evoluzione del tumore e integrare gli esperimenti di knockdown / knockout del recettore. La metodologia fornisce anche una base per ampliare la gamma di reporter disponibili. La scelta del reporter fluorescente è importante da considerare e dipende dalla questione biologica. Abbiamo scoperto che il turnover costitutivo di questi recettori delle chemochine nei neutrofili era elevato, rispetto alle cellule epiteliali, e che i reporter con maturazione rapida (ad esempio, sfGFP) erano tenuti a riportare i livelli di membrana allo stato stazionario e risolvere le differenze sulla stimolazione dei neutrofili 8,14. Pertanto, i rapporti di membrana di sfGFP / tagRFP non sono applicabili per misurare l'internalizzazione indotta dal ligando in questo tipo di cellula, ma il modello di tagRFP consente il monitoraggio dei destini intracellulari del recettore, che potrebbe essere utile in alcuni studi. Abbiamo anche scoperto che il segnale intracellulare più concentrato di tagRFP è utile per lo screening delle singole larve. Un approccio alternativo per misurare i livelli dei recettori sulla membrana plasmatica sarebbe quello di co-esprimere un marcatore di membrana fluorescente nei neutrofili nello stesso transgene9 o in un transgeneindipendente 14. Nel primo scenario il transgene fornirebbe un ulteriore mezzo per lo screening del pesce e i livelli di espressione sarebbero comparabili tra il marcatore e il recettore. Quest'ultimo approccio sarebbe più modulare, in quanto una linea zebrafish con un reporter recettore potrebbe essere combinata con diverse linee reporter. In entrambi i casi, vale la pena notare che la quantificazione di membrana dei livelli del recettore è difficile nei neutrofili raggruppati (vedi sotto). Infine, notiamo che una possibile estensione di questo protocollo sarebbe quella di seguire l'imaging dal vivo mediante immunoistochimica per analisi di localizzazione più dettagliate.
Il sistema di transgenesi Tol2 è ben consolidato7 e il promotore del lisozima C è stato ampiamente utilizzato per l'espressione dei neutrofili11,15. L'approccio della transgenesi è, quindi, relativamente semplice e il livello di espressione raggiunto con questo promotore è abbastanza alto da fornire un contrasto sufficiente per l'analisi della dinamica del recettore. Una possibile limitazione è che il livello di espressione non ricapitola i livelli di espressione del recettore endogeno. Nuove tecnologie CRISPR potrebbero essere implementate per stabilire linee knock-in per i recettori di particolare interesse28. Queste tecnologie sono ancora ingombranti e potrebbero non garantire i livelli di espressione richiesti per l'imaging subcellulare, ma il loro sviluppo di successo sarebbe un importante passo avanti per la comprensione delle dinamiche di segnalazione endogena. Le convalide funzionali sono importanti per interpretare i dati con costrutti recettoriali transgenici. Ad esempio, i saggi di riconoscimento dei ligandi possono essere utilizzati per stabilire che la proteina di fusione fluorescente è funzionale e il salvataggio dei fenotipi knockout potrebbe essere utilizzato per stabilire che i livelli di espressione transgenica dei neutrofili sono compatibili con la funzionalità14. Infine, un modo più diretto per convalidare la fusione del recettore sarebbe quello di utilizzare un test funzionale in vitro con recettore marcato insieme a versioni non marcate14.
L'approccio di quantificazione affronta difficoltà specifiche nella segmentazione accurata della membrana nei neutrofili in vivo. Nelle cellule di natura epiteliale, la quantificazione dei livelli dei recettori può essere eseguita automaticamente normalizzando i livelli del recettore di membrana in un marcatore di controllo, che può essere espresso in tandem o separatamente9. In effetti, abbiamo applicato un tale approccio, quando abbiamo utilizzato il test di riconoscimento del ligando in embrioni gastrulanti14. Tuttavia, i neutrofili subiscono cambiamenti complessi e rapidi nella forma delle cellule in vivo, rendendo difficile la segmentazione della membrana sia in 2D che in 3D14. Questo è ancora più difficile quando i neutrofili si raggruppano, che si verifica in molti contesti fisiologici29. La metrica di contrasto supera questa limitazione in quanto non richiede la segmentazione della membrana, ma riflette invece lo stato complessivo della distribuzione del recettore nella cellula (membranoso / liscio vs vescicolare / punteggiato). È importante notare che la metrica di contrasto può essere influenzata dal contrasto complessivo dell'immagine, quindi è necessaria la normalizzazione dei valori delle singole cellule a un riferimento interno per tenere conto della variabilità del segnale in diversi embrioni / campioni. Ad esempio, abbiamo usato il valore medio di contrasto cellulare dei neutrofili non responsivi nel CHT (cioè neutrofili che rimangono fermi e non migrano nella pinna ventrale)14. Un'ulteriore possibilità sarebbe quella di normalizzare con i valori di contrasto di un marcatore di controllo nella stessa cella. Ciò fornirebbe una soluzione quando non è disponibile un riferimento interno di cellule non rispondenti e potrebbe probabilmente risolvere differenze quantitative più sottili nella dinamica dei recettori tra condizioni diverse.
La posizione dell'imaging è un'altra variabile da considerare. La ragione per scegliere la ferita della pinna ventrale qui, al contrario del più comunemente usato modello di ferita della pinna caudalemodello 16,30, è perché il sito di ferimento si trova vicino al sito di residenza dei neutrofili / origine migratoria. Ciò accelera la tempistica del test, poiché ci vuole relativamente poco tempo per l'arrivo dei neutrofili. Inoltre, offre l'opportunità di catturare il comportamento cellulare sia all'origine della migrazione (CHT) che nella posizione di interesse target (ferita). Questo è rilevante qui, perché la risoluzione spaziale e temporale richiesta per l'imaging subcellulare è difficile da combinare con un ampio campo visivo o una scansione multi-posizione. Pertanto, il test della ferita della pinna ventrale consente di tracciare l'evoluzione della risposta migratoria dall'origine della migrazione e la cattura simultanea di fluttuazioni non specifiche del recettore nelle cellule che non rispondono. Come accennato in precedenza, quest'ultimo è utile ai fini della quantificazione in quanto fornisce un riferimento interno per dinamiche non specifiche. In altri sistemi, potrebbe non essere possibile avere un tale riferimento interno, nel qual caso i valori di contrasto di un marcatore a membrana coespresso fornirebbero un controllo alternativo.
In sintesi, prevediamo che la metodologia è applicabile ad altri sistemi e può essere implementata per una varietà di scopi. Ad esempio, gli stessi reporter potrebbero essere utilizzati in altri contesti infiammatori, come le impostazioni di infezione o altri modelli di malattia. Il repertorio delle linee reporter del recettore zebrafish potrebbe essere esteso ad altri recettori di segnalazione, per comprendere i meccanismi di segnalazione o segnalare le dinamiche del ligando in vivo. L'approccio può essere combinato con tecniche di knockdown/knockout per interrogare le basi meccanicistiche delle dinamiche osservate. Ad esempio, la perturbazione dell'espressione del ligando può indicare la dipendenza dal ligando per le dinamiche dei recettori osservate. In futuro, prevediamo che il sistema potrebbe essere ulteriormente perfezionato per incorporare l'inserimento knock-in dei giornalisti. In definitiva, i risultati che utilizzano questa metodologia fornirebbero nuove intuizioni preziose al di là della comunità dei pesci zebra, data la conservazione di questi recettori di segnalazione nei mammiferi e la relativa sfida di condurre questi studi in organismi più grandi.

La migrazione dei leucociti è di fondamentale importanza per le risposte immunitarie. Le cellule immunitarie sono cellule migratorie prototipiche, che sono notevolmente in grado di attraversare tessuti e vasi sanguigni e di percepire una serie di segnali di guida chimica per migrare direzionalmente verso microbi o altre cellule ospiti importanti. Una guida corretta si basa sul riconoscimento dei chemioattrattivi, tra cui le chemochine rappresentano la categoria1 più importante. Le chemochine sono riconosciute da recettori accoppiati a sette proteine G transmembrana altamente specifici. Al momento del legame con le chemochine, i recettori delle chemochine cambiano conformazione portando all'attivazione delle proteine G trimeriche associate e alla loro dissociazione in subunità di segnalazione funzionale che promuovono i cambiamenti citoscheletrici e la migrazione diretta1. Secondariamente, i recettori delle chemochine sono fosforilati e questa modifica porta alla desensibilizzazione all'attrattivo, che può essere seguita da una rapida risensibilizzazione / riciclaggio o degradazione intracellulare e down-regolazione dalla superficie cellulare2. Queste dinamiche dei recettori influenzano la durata e la dose di segnalazione ricevuta dalle cellule, ma il modo in cui influenzano il comportamento di migrazione dei leucociti è stato difficile da chiarire in vivo.
Il monitoraggio delle dinamiche dei recettori nei leucociti vivi nei sistemi tradizionali dei mammiferi deve affrontare diverse sfide. Per gli studi dal vivo, le fusioni di recettori con proteine fluorescenti devono essere espresse nelle cellule. Questo è difficile nei leucociti primari, in particolare nei neutrofili, e gli studi finora hanno utilizzato linee cellulari neutrofile surrogate per esprimere i recettori delle chemochine 3,4. La generazione di modelli murini transgenici, in cui i leucociti esprimono un recettore fluorescente o recettori mutanti con difetti di traffico informativo 5,6, comporta un notevole investimento di tempo e risorse. Anche in questi casi, la risoluzione e il contrasto di imaging per le dinamiche dei recettori di imaging nell'animale vivo possono essere limitati e gli studi hanno utilizzato l'immunoistochimica su sezioni di tessuto fisse5. Date queste sfide tecniche, la nostra comprensione di come le dinamiche dei recettori chemioattrattivi influenzano il comportamento cellulare in un ambiente di tessuto vivo è attualmente limitata.
Qui forniamo una metodologia per monitorare il traffico di recettori nei neutrofili zebrafish. I pesci zebra sono geneticamente trattabili, come i topi, ma la transgenesi è relativamente più semplice attraverso l'uso di sistemi di trasposoni efficienti e la manipolazione diretta dello zigote7. La larva trasparente è idealmente suscettibile di imaging. Le dinamiche del recettore delle chemochine sono state visualizzate nelle cellule germinali primordiali e nella linea laterale primordium mediante espressione di fusioni corrispondenti con reporter fluorescenti 8,9,10. Le larve di zebrafish sono dotate di neutrofili maturi che hanno proprietà genetiche e cellulari altamente conservate rispetto ai neutrofili dei mammiferi. Le dinamiche di segnalazione subcellulare come la dinamica citoscheletrica e i regolatori di polarità sono stati visualizzati in queste cellule mediante la generazione di corrispondenti linee transgeniche 11,12,13. Recentemente, abbiamo visualizzato e analizzato funzionalmente le dinamiche del recettore delle chemochine nei neutrofili durante il corso delle risposte infiammatorie al danno tissutale14. Qui, descriviamo la generazione di linee reporter transgeniche per la segnalazione di chemochine nei neutrofili, la preparazione di embrioni per l'imaging dal vivo, un test delle ferite per lo studio della segnalazione dei neutrofili e il protocollo per l'acquisizione e l'analisi delle immagini. Forniamo anche un protocollo laterale per testare le risposte dei recettori delle chemochine ai ligandi candidati, che è utile quando si cerca di stabilire modelli di riconoscimento dei ligandi in recettori non caratterizzati. Queste tecniche possono essere utilizzate in combinazione con ulteriori manipolazioni genetiche, come l'inibizione dell'espressione di chemochine endogene o la generazione di recettori mutanti con traffico alterato indotto dal ligando, per interrogarsi su come specifiche dinamiche di segnalazione influenzano il comportamento dei leucociti in vivo. Le linee transgeniche che esprimono recettori delle chemochine marcati fluorescentemente possono anche essere utilizzate come reporter per gradienti di chemochine endogene, che sono altrimenti difficili da rilevare mediante colorazione diretta degli anticorpi. La metodologia descritta fornisce la possibilità di espandere la generazione di reporter ad altri recettori di immuno-segnalazione.

<table><tbody><tr><td>1-phenyl-2-thiourea</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7629-25G</td><td></td></tr><tr><td>50mL CellStar Centrifuge Tube</td><td>Grenier Bio-One Limited</td><td>210270</td><td></td></tr><tr><td>Clark capillary glass</td><td>Harvard Apparatus</td><td>30-0020</td><td></td></tr><tr><td>Cleanline Thin Bleach</td><td>Scientific Laboratory Supplies</td><td>CLE0301</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting scope</td><td>Nikon</td><td>SMZ645</td><td></td></tr><tr><td>Dri Block heater</td><td>Techne</td><td>FDB02AD</td><td></td></tr><tr><td>Fiji</td><td>National Institutes of Health, Bethesda, MD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forceps, Jewelers Dumont No. 5</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6521</td><td></td></tr><tr><td>Glass bottom microwell dishes</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Glass pasteur pipette</td><td>Fisherbrand</td><td>11795098</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen Ambion mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit</td><td>Invitrogen</td><td>10391175</td><td></td></tr><tr><td>Leica SP8 confocal microscope</td><td>Leica</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Low melting point agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16520-100</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic stand</td><td>Narishige</td><td>GJ-1</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>The MathWorks, Inc., Natick, MA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Methylene blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9140-25G</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-2643</td><td></td></tr><tr><td>Microinjection system</td><td>Parker</td><td>Picospritzer III</td><td></td></tr><tr><td>Microloader pipette tips</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Narishige</td><td>M-152</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette Puller</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>Flaming/Brown P-97</td><td></td></tr><tr><td>Microscope slide</td><td>Thermo-Scientific</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>PerkinElmer Spinning Disk UltraVIEW ERS, Olympus IX81 spinnng disk confocal microscope</td><td>Olympus</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish (120mm)</td><td>Grenier Bio-One Limited</td><td>632180</td><td></td></tr><tr><td>Phenol red</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0290-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Poly(A) Tailing Kit</td><td>Invitrogen</td><td>AM1350</td><td></td></tr><tr><td>Prism</td><td>GraphPad Software</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Small paintbrush</td><td>N/A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spectral Applied Research LMM5 laser module</td><td></td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Surgical Scalpel Blade No. 23</td><td>Swann-Morton</td><td>233-5528</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine MS222</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521-50G</td><td></td></tr><tr><td>Volocity software</td><td></td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Yokogawa CSU10 spinning disc confocal scanner</td><td>Yokogawa</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

live imaging of chemokine receptors in zebrafish neutrophils during wound responses

La guida dei leucociti da parte di gradienti chimici è essenziale per le risposte immunitarie. I neutrofili sono le prime cellule ad essere reclutate in siti di danno tissutale dove eseguono funzioni antimicrobiche cruciali. Il loro traffico verso questi loci è orchestrato da diversi chemioattrattivi infiammatori, tra cui le chemochine. A livello molecolare, la segnalazione chemioattrattante è regolata dal traffico intracellulare dei recettori corrispondenti. Tuttavia, non è chiaro come i cambiamenti subcellulari nei recettori delle chemochine influenzino le dinamiche di migrazione dei leucociti a livello cellulare e tissutale. Qui descriviamo una metodologia per l'imaging dal vivo e l'analisi quantitativa delle dinamiche dei recettori delle chemochine nei neutrofili durante le risposte infiammatorie al danno tissutale. Questi strumenti hanno rivelato che il traffico differenziale del recettore delle chemochine nei neutrofili del pesce zebra coordina il raggruppamento e la dispersione dei neutrofili nei siti di danno tissutale. Ciò ha implicazioni per la nostra comprensione di come le risposte infiammatorie sono auto-risolte. Gli strumenti descritti potrebbero essere utilizzati per comprendere i modelli di migrazione dei neutrofili in una varietà di contesti fisiologici e patologici e la metodologia potrebbe essere estesa ad altri recettori di segnalazione.

La ferita della pinna ventrale è seguita da una rapida mobilizzazione dei neutrofili dal CHT nella pinna ventrale e dal raggruppamento al margine della ferita, entro 30-60 minuti (Figura 1). Abbiamo visualizzato la distribuzione di due recettori delle chemochine, Cxcr1 e Cxcr2, che sono espressi dai neutrofili zebrafish24 e riconoscono Cxcl8a e Cxcl8b14, usando la microscopia confocale a disco rotante. Abbiamo generato due linee transgeniche corrispondenti, Tg(lyz:Cxcr1-FT) e Tg(lyz:Cxcr2-FT), in cui i neutrofili esprimono un costrutto timer fluorescente (FT) del recettore, cioè una fusione con un tandem di sfGFP e tagRFP (Figura 2 e riferimento14). L'uso dei due fluorofori aveva lo scopo di consentire il monitoraggio di un'ampia gamma di destini recettoriali e fornire stime del tempo di turnover proteico sulla membrana plasmatica, poiché i recettori di nuova sintesi fluorescevano in verde e diventavano progressivamente rossi all'età di 8,14 anni. Tuttavia, questi recettori hanno un rapido turnover costitutivo sulla membrana plasmatica dei neutrofili e che il tempo di permanenza era più breve del tempo di maturazione di tagRFP, con sfGFP che mostrava localizzazione di membrana e tagRFP che mostrava localizzazione vescicolare allo stato stazionario (Video supplementare 1 e ref14). Pertanto, ci siamo concentrati sulla distribuzione di sfGFP per monitorare l'internalizzazione indotta dal ligando nei siti di danno tissutale. Il modello di distribuzione del recettore è stato quantificato utilizzando la metrica di contrasto, che riporta le differenze di intensità tra i pixel vicini. La logica è che quando la distribuzione del recettore è membranosa e liscia, il valore di contrasto è basso. Quando la distribuzione del recettore è vescicolare e più puntina, il valore di contrasto è alto (Figura 3).
Un metodo alternativo consiste nel quantificare il rapporto tra i livelli dei recettori (intensità sfGFP) rispetto ai livelli di un marcatore di membrana di controllo, ad esempio la CFP di membrana (mCFP) (Figura 3). Entrambi i metodi potrebbero rilevare l'internalizzazione del recettore, come indicato da un modello di distribuzione del recettore vescicolare più globale nella cellula (valore di contrasto più elevato) o livelli di recettori più bassi sulla membrana (rapporto sfGFP / mCFP inferiore). Tuttavia, la metrica di contrasto potrebbe anche rilevare l'internalizzazione del recettore nei cluster di neutrofili alla ferita, in cui la segmentazione della membrana era meno accurata e non applicabile (Figura 3). Utilizzando questa metrica, siamo stati in grado di quantificare le differenze visibili tra il traffico di neutrofili Cxcr1 e Cxcr2 nelle ferite (Figura 4 e Video supplementare 2). Cxcr1-FT interiorizzato in cellule situate nella ferita mentre Cxcr2-FT è rimasto membranoso nei neutrofili nella ferita (Figura 4A-C, Video supplementare 2 e Video supplementare 3). La soppressione di Cxcl8a e Cxcl8b, attraverso il trattamento con morfolino, ha influenzato in modo differenziale l'internalizzazione di Cxcr1-FT alle ferite (Figura 4C,D). Per convalidare ulteriormente che Cxcr1-FT risponde a Cxcl8a, abbiamo eseguito saggi di risposta alle chemochine negli embrioni precoci. Abbiamo scoperto che Cxcr1-FT è marcatamente interiorizzato in embrioni in cui Cxcl8a è stato co-espresso (Figura 5). Complessivamente questi risultati indicano che i metodi descritti possono essere utilizzati per misurare l'internalizzazione del recettore indotta da chemochine nei neutrofili e stabilire l'identità del ligando mediando questi effetti.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig01.jpg"> Figura 1: Migrazione dei neutrofili alle ferite delle pinne ventrali. (A) (A sinistra) Vignetta della larva di 3 dpf che mostra la posizione del tessuto ematopoietico caudale (CHT), la circolazione di Venere (VC, blu), la pinna ventrale (VF) e il sito della ferita. (Destra) Cartone animato raffigurante l'area della ferita (W) con i neutrofili che vengono mobilitati dal CHT e raggruppati sulla ferita. Il plesso della vena caudale (CVP) del tessuto CHT è disegnato in blu. (B) Immagine in campo luminoso (a sinistra) e proiezione confocale (a destra) che mostra la ferita della pinna ventrale e la distribuzione dei neutrofili nelle larve di Tg(mpx:GFP) a 2 ore dopo l'avvolgimento. Le linee tratteggiate mostrano i contorni VF e CHT. Barra della scala = 25 μm. Immagine cartoon e fluorescente modificata dal ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61679/61679fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig02.jpg"> Figura 2: Imaging dal vivo del traffico del recettore delle chemochine nei neutrofili. (A) Costrutti utilizzati per l'espressione transgenica neutrofila-specifica di Cxcr1-FT (Fluorescent Timer) e Cxcr2-FT. Proiezioni confocali di neutrofili nella testa di una larva transgenica 3 dpf (Tg(lyz:Cxcr1-FT), top; Tg(lyz:Cxcr2-FT), in basso) che mostra i canali tRFP (magenta) e sfGFP (verde). Barra di scala = 20 μm. (B) Schema anatomico di 3 larve dpf come in Figura 1A. Sotto la larva ci sono schemi che raffigurano l'area della ferita (W) con i neutrofili che vengono mobilitati dal CHT (in alto) o eseguono la chemiotassi quando entrano nella pinna ventrale (in basso). Il quadrato tratteggiato indica l'area ripresa nelle istantanee a destra. (C) Neutrofili nelle larve di Tg(lyz:Cxcr1-FT) (sfGFP è mostrato) dopo mobilizzazione dal CHT (pannelli superiori) o chemiotassi verso la ferita (pannelli inferiori). Le frecce mostrano le stesse celle nel tempo. I punti temporali sull'immagine a destra sono minuti trascorsi dopo l'immagine a sinistra. Barra di scala = 10 μm. (D) Rappresentazione schematica dell'approccio sperimentale per l'imaging dal vivo del traffico del recettore delle chemochine. Pannelli A-C modificati dal rif.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61679/61679fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig03.jpg"> Figura 3: Esempi di quantificazione della dinamica dei recettori. I neutrofili singoli (blu) o raggruppati (verde) alle ferite o i neutrofili non mobilizzati nel CHT (rosso, arancione) sono stati segmentati e analizzati con metodi diversi per confrontare i risultati. Le stesse celle di esempio mostrate sono state analizzate con due metodi per mettere in relazione ciò che si vede nell'immagine con l'intervallo di valori estratti. (A) La superficie delle celle di esempio selezionate è stata segmentata in base alla definizione del contorno nel canale sfGFP. (B) Il contrasto è stato calcolato dalle celle di esempio mostrate in A. (C) La membrana delle cellule di esempio selezionate è stata segmentata in base alla definizione del contorno nel canale CFP. È seguita l'analisi raziometrica di sfGFP/CFP. (D) Il rapporto sfGFP/CFP è stato calcolato sulle celle di esempio mostrate in C. Le barre di errore rappresentano S.E.M. da singole celle, nei casi di n>1, i valori qui non sono stati utilizzati per analisi statistiche ma semplicemente per esemplificare le misurazioni ottenute con i diversi metodi di quantificazione. Barra della scala = 10 μm. Figura modificata dal rif.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61679/61679fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig04v2.jpg"> Figura 4: Dinamica differenziale di Cxcr1 e Cxcr2 in risposta al ferimento. (A) Proiezione confocale di neutrofili in larve Tg(lyz:Cxcr1-FT) o Tg(lyz:Cxcr2-FT) alla ferita a 80 minuti dopo l'avvolgimento (canale sfGFP mostrato). Barra della scala = 10 μm.  (B) Neutrofilo Cxcr1-FT ingrandito (a sinistra) e Cxcr2-FT (a destra) alla ferita. Il recettore verde è mostrato in grigio. Barra di scala = 5 μm. (C) Contrasto normalizzato (contrasto per singolo neutrofilo normalizzato al contrasto medio delle cellule non mobilizzate nel CHT). cxcl8a si riferisce all'iniezione di un blocco di giunzione insieme a un morfolino che blocca la traduzione per cxcl8a. cxcl8b si riferisce all'iniezione con un morfolino che blocca la giunzione per cxcl8b. Per Tg(lyz:Cxcr1-FT): n=24 cellule (CHT), n=47 cellule (ferita) da 8 larve. Per Tg(lyz:Cxcr1-FT) con morfolinos: n=28 cellule (Cxcl8a-MO) da 5 larve, n=16 cellule (Cxcl8b-MO) da 5 larve. Per Tg(lyz:Cxcr2-FT): n=10 cellule (CHT) e n=20 cellule (ferita) da 3 larve. I dati sono stati raggruppati da larve indipendenti acquisite in 1-5 sessioni di imaging. Test di Kruskal-Wallis con il test di confronto multiplo di Dunn per Tg (lyz: Cxcr1-FT), test di Mann-Whitney spaiato a due code per Tg (lyz: Cxcr2-FT). (D) Proiezione confocale di neutrofili in larve transgeniche Tg(lyz:Cxcr1-FT) trattate con cxcl8a morpholino (MO) (a sinistra) e cxcl8b MO (a destra) che rispondono alle ferite delle pinne (canale sfGFP mostrato in verde). Istantanea scattata in punti temporali di accumulo equivalente di neutrofili (85 minuti post-ferimento nell'immagine sinistra e 45 minuti post-ferimento nell'immagine destra). Barra della scala = 10 μm. Figura modificata dal rif.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61679/61679fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig05.jpg"> Figura 5: Test di risposta alle chemochine negli embrioni precoci. Fette confocali a scansione laser di embrioni gastrulanti che mostrano espressione e distribuzione di Cxcr1-FT. 100 pg di mRNA Cxcr1-FT sono stati iniettati in uova a stadio cellulare con o senza mRNA Cxcl8a 150 pg. I recettori verdi e rossi sono mostrati in canali separati. Il marcatore CFP a membrana di controllo (mCFP) viene mostrato nel canale ciano. Barra della scala = 20 μm. Figura modificata dal rif.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61679/61679fig05large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Film supplementare 1: Neutrofili transgenici nella testa di una larva Tg(lyz:Cxcr1-FT) (sinistra) e Tg(lyz:Cxcr2-FT) (destra) a 3 dpf. sfGFP(verde), tagRFP (magenta). L'intervallo di fotogrammi è di 30 secondi e la frequenza dei fotogrammi è di 5 fps. Barra della scala = 20 μm. Il video proviene dal ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61679/Supplementary_Movie1.avi" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo video.</a>
Film supplementare 2: Neutrofili in Tg(lyz:Cxcr1-FT) (sinistra) e Tg(lyz:Cxcr2-FT) (destra) larve transgeniche che rispondono alle ferite delle pinne. Il film inizia entro 10 minuti dopo il ferimento e dura 60 minuti sfGFP (verde), tagRFP (magenta). L'intervallo di fotogrammi è di 30 secondi e la frequenza dei fotogrammi è di 10 fps. CHT = tessuto ematopoietico caudale. VF = pinna ventrale. Barra della scala = 25 μm. Il video proviene dal ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61679/Supplementary_Movie2.avi" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo video.</a>
Film supplementare 3. Ulteriori esempi di neutrofili da una larva transgenica Tg (lyz: Cxcr1- FT) ferita (larva diversa da quella mostrata nel Video 2), acquisita a una risoluzione più elevata, che mostra l'internalizzazione del recettore (canale sfGFP mostrato in verde) alla mobilizzazione nel CHT o all'ingresso e chemiotassi nella pinna ventrale. L'intervallo di fotogrammi è di 30 secondi e la frequenza dei fotogrammi è di 2 fps. Barra della scala = 10 μm. Il video proviene dal ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61679/Supplementary_Movie3.avi" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo video.</a>
File supplementare 1<a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61679/Supplementary%20file%201.m" target="_blank">: Fare clic qui per scaricare questo file.</a>
File supplementare 2: <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61679/Supplementary%20file%202.m" target="_blank">Fare clic qui per scaricare questo file.</a>
File supplementare 3<a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61679/Supplementary%20file%203.m" target="_blank">: Fare clic qui per scaricare questo file.</a>
File supplementare 4: <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61679/Supplementary%20file%204.m" target="_blank">Fare clic qui per scaricare questo file.</a>

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Live Imaging of Chemokine Receptors in Zebrafish Neutrophils During Wound Responses

Qui descriviamo i protocolli per eseguire l'imaging dal vivo e l'analisi quantitativa delle dinamiche dei recettori chemioattrattari nei neutrofili zebrafish

Imaging dal vivo dei recettori delle chemochine nei neutrofili zebrafish durante le risposte alle ferite

Leukocyte guidance by chemical gradients is essential for immune responses. Neutrophils are the first cells to be recruited to sites of tissue damage ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

2.4K Views.  University of Cambridge. Qui descriviamo i protocolli per eseguire l'imaging dal vivo e l'analisi quantitativa delle dinamiche dei recettori chemioattrattari nei neutrofili zebrafish

Video: Live Imaging of Chemokine Receptors in Zebrafish Neutrophils During Wound Responses

Live Imaging of Innate Immune and Preneoplastic Cell Interactions Using an Inducible Gal4/UAS Expression System in Larval Zebrafish Skin

Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformation by the use of the 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) inducible KalTA4-ERT2/UAS expression system1 in zebrafish larvae, and the subsequent live imaging of innate immune cell interaction with HRASG12V expressing skin cells. The KalTA4-ERT2/UAS system is both inducible and reversible which allows us to induce cell transformation with precise temporal/spatial resolution in vivo. This provides us with a unique opportunity to live image how individual preneoplastic cells interact with host tissues as soon as they emerge, then follow their progression as well as regression. Recent studies in zebrafish larvae have shown a trophic function of innate immunity in the earliest stages of tumorigenesis2,3. Our inducible system would allow us to live image the onset of cellular transformation and the subsequent host response, which may lead to important insights on the underlying mechanisms for the regulation of oncogenic trophic inflammatory responses. We also discuss how one might adapt our protocol to achieve temporal and spatial control of ectopic gene expression in any tissue of interest.

Studying the earliest events of preneoplastic cell progression and innate immune cell interaction is pivotal to understand and treat cancer. Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformations and the subsequent live imaging of innate immune cell interaction with HRASG12V expressing skin cells in zebrafish larvae.

Immagini dal vivo di Innata immunitario e preneoplastiche interazioni cella utilizzando un / UAS Expression System inducibile GAL4 in Zebrafish larvale pelle

Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformation by the use of the 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) inducible KalTA4-ERT2/UAS ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Non-invasive Imaging of Disseminated Candidiasis in Zebrafish Larvae

Disseminated candidiasis caused by the pathogen Candida albicans is a clinically important problem in hospitalized individuals and is associated with a 30 to 40% attributable mortality6. Systemic candidiasis is normally controlled by innate immunity, and individuals with genetic defects in innate immune cell components such as phagocyte NADPH oxidase are more susceptible to candidemia7-9. Very little is known about the dynamics of C. albicans interaction with innate immune cells in vivo. Extensive in vitro studies have established that outside of the host C. albicans germinates inside of macrophages, and is quickly destroyed by neutrophils10-14. In vitro studies, though useful, cannot recapitulate the complex in vivo environment, which includes time-dependent dynamics of cytokine levels, extracellular matrix attachments, and intercellular contacts10, 15-18. To probe the contribution of these factors in host-pathogen interaction, it is critical to find a model organism to visualize these aspects of infection non-invasively in a live intact host. 
The zebrafish larva offers a unique and versatile vertebrate host for the study of infection. For the first 30 days of development zebrafish larvae have only innate immune defenses2, 19-21, simplifying the study of diseases such as disseminated candidiasis that are highly dependent on innate immunity. The small size and transparency of zebrafish larvae enable imaging of infection dynamics at the cellular level for both host and pathogen. Transgenic larvae with fluorescing innate immune cells can be used to identify specific cells types involved in infection22-24. Modified anti-sense oligonucleotides (Morpholinos) can be used to knock down various immune components such as phagocyte NADPH oxidase and study the changes in response to fungal infection5. In addition to the ethical and practical advantages of using a small lower vertebrate, the zebrafish larvae offers the unique possibility to image the pitched battle between pathogen and host both intravitally and in color. 
The zebrafish has been used to model infection for a number of human pathogenic bacteria, and has been instrumental in major advances in our understanding of mycobacterial infection3, 25. However, only recently have much larger pathogens such as fungi been used to infect larva5, 23, 26, and to date there has not been a detailed visual description of the infection methodology. Here we present our techniques for hindbrain ventricle microinjection of prim25 zebrafish, including our modifications to previous protocols. Our findings using the larval zebrafish model for fungal infection diverge from in vitro studies and reinforce the need to examine the host-pathogen interaction in the complex environment of the host rather than the simplified system of the Petri dish5.

The rapid development, small size and transparency of zebrafish are tremendous advantages for the study of innate immune control of infection1-4. Here we demonstrate techniques for infecting zebrafish larvae using the fungal pathogen Candida albicans by microinjection, methodology recently used to implicate phagocyte NADPH oxidase activity in control of fungal dimorphism5.

Non invasiva Imaging di candidosi disseminata nelle larve Zebrafish

Disseminated candidiasis caused by the pathogen Candida albicans is a clinically important problem in hospitalized individuals and is associated with a 30 ...

Immunologia e infezioni

Facilitating Drug Discovery: An Automated High-content Inflammation Assay in Zebrafish

Zebrafish larvae are particularly amenable to whole animal small molecule screens1,2 due to their small size and relative ease of manipulation and observation, as well as the fact that compounds can simply be added to the bathing water and are readily absorbed when administered in a &lt;1% DMSO solution. Due to the optical clarity of zebrafish larvae and the availability of transgenic lines expressing fluorescent proteins in leukocytes, zebrafish offer the unique advantage of monitoring an acute inflammatory response in vivo. Consequently, utilizing the zebrafish for high-content small molecule screens aiming at the identification of immune-modulatory compounds with high throughput has been proposed3-6, suggesting inflammation induction scenarios e.g. localized nicks in fin tissue, laser damage directed to the yolk surface of embryos7 or tailfin amputation3,5,6. The major drawback of these methods however was the requirement of manual larva manipulation to induce wounding, thus preventing high-throughput screening. Introduction of the chemically induced inflammation (ChIn) assay8 eliminated these obstacles. Since wounding is inflicted chemically the number of embryos that can be treated simultaneously is virtually unlimited. Temporary treatment of zebrafish larvae with copper sulfate selectively induces cell death in hair cells of the lateral line system and results in rapid granulocyte recruitment to injured neuromasts. The inflammatory response can be followed in real-time by using compound transgenic cldnB::GFP/lysC::DsRED26,9 zebrafish larvae that express a green fluorescent protein in neuromast cells, as well as a red fluorescent protein labeling granulocytes.
In order to devise a screening strategy that would allow both high-content and high-throughput analyses we introduced robotic liquid handling and combined automated microscopy with a custom developed software script. This script enables automated quantification of the inflammatory response by scoring the percent area occupied by red fluorescent leukocytes within an empirically defined area surrounding injured green fluorescent neuromasts. Furthermore, we automated data processing, handling, visualization, and storage all based on custom developed MATLAB and Python scripts.
In brief, we introduce an automated HC/HT screen that allows testing of chemical compounds for their effect on initiation, progression or resolution of a granulocytic inflammatory response. This protocol serves a good starting point for more in-depth analyses of drug mechanisms and pathways involved in the orchestration of an innate immune response. In the future, it may help identifying intolerable toxic or off-target effects at earlier phases of drug discovery and thereby reduce procedural risks and costs for drug development.

Here we describe a novel high-content chemically induced inflammation assay aiming at the identification of immune-modulatory bioactives. We have successfully combined automated microscopy with custom developed software scripts enabling automated quantification of the inflammatory response as well as further data processing, analysis, mining, and storage.

Facilitare Drug Discovery: un sistema automatico di alta Tenore infiammazione in Zebrafish

Zebrafish larvae are particularly amenable to whole animal small molecule screens1,2 due to their small size and relative ease of manipulation and ...

Microstructured Devices for Optimized Microinjection and Imaging of Zebrafish Larvae

Zebrafish have emerged as a powerful model of various human diseases and a useful tool for an increasing range of experimental studies, spanning fundamental developmental biology through to large-scale genetic and chemical screens. However, many experiments, especially those related to infection and xenograft models, rely on microinjection and imaging of embryos and larvae, which are laborious techniques that require skill and expertise. To improve the precision and throughput of current microinjection techniques, we developed a series of microstructured devices to orient and stabilize zebrafish embryos at 2 days post fertilization (dpf) in ventral, dorsal, or lateral orientation prior to the procedure. To aid in the imaging of embryos, we also designed a simple device with channels that orient 4 zebrafish laterally in parallel against a glass cover slip. Together, the tools that we present here demonstrate the effectiveness of photolithographic approaches to generate useful devices for the optimization of zebrafish techniques.

Microinjection of zebrafish embryos and larvae is a crucial but challenging technique used in many zebrafish models. Here, we present a range of microscale tools to aid in the stabilization and orientation of zebrafish for both microinjection and imaging.

Dispositivi microstrutturati Microinjection ottimizzata e Imaging delle larve di Zebrafish

Zebrafish have emerged as a powerful model of various human diseases and a useful tool for an increasing range of experimental studies, spanning ...

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of causing systemic disease in both fish and humans. A better understanding of S. iniae disease pathogenesis requires an appropriate model system. The genetic tractability and the optical transparency of the early developmental stages of zebrafish allow for the generation and non-invasive imaging of transgenic lines with fluorescently tagged immune cells. The adaptive immune system is not fully functional until several weeks post fertilization, but zebrafish larvae have a conserved vertebrate innate immune system with both neutrophils and macrophages. Thus, the generation of a larval infection model allows the study of the specific contribution of innate immunity in controlling S. iniae infection.
The site of microinjection will determine whether an infection is systemic or initially localized. Here, we present our protocols for otic vesicle injection of zebrafish aged 2-3 days post fertilization as well as our techniques for fluorescent confocal imaging of infection. A localized infection site allows observation of initial microbe invasion, recruitment of host cells and dissemination of infection. Our findings using the zebrafish larval model of S. iniae infection indicate that zebrafish can be used to examine the differing contributions of host neutrophils and macrophages in localized bacterial infections. In addition, we describe how photolabeling of immune cells can be used to track individual host cell fate during the course of infection.

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Here, we present a protocol for the generation and imaging of a localized bacterial infection in the zebrafish otic vesicle.

Imaging non invasiva della risposta immunitaria innata in un modello di Zebrafish larvale<em&gt; Streptococcus iniae</em&gt; Infezione

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of ...

An Ectopic Chemokine Expression Model for Testing Macrophage Recruitment In Vivo

Zebrafish are widely used in basic and biomedical research. Many zebrafish transgenic lines are currently available to label various types of cells. Owing to the transparent embryonic body of zebrafish, it is convenient for us to study the effect of one chemokine on the behavior of a certain type of cells in vivo. Here we provided a workflow to investigate the function of a chemokine on macrophage migration in vivo. We constructed a tissue-specific overexpression plasmid to overexpress IL-34 and injected the plasmid into one-cell stage transgenic fish embryos whose macrophages were specifically labeled by a fluorescent protein. We then used whole mount fluorescent in situ hybridization and immunostaining to detect the pattern of the chemokine expression and the number or location of macrophages. The injected WT embryos were raised to generate a stable transgenic line. Finally, we used confocal live imaging to directly observe macrophage behavior in the stable transgenic fish to study the function of IL-34 on macrophages in vivo.

To test the effect of a chemokine on macrophage recruitment in vivo, the whole mount in situ hybridization was used to detect the ectopic expression of the chemokine, and immunostaining was used to label macrophages. Live imaging was used for real-time observation of macrophage migration.

Un modello di espressione della chemiochina ectopica per testare il reclutamento macrofrofo in vivo

Zebrafish are widely used in basic and biomedical research. Many zebrafish transgenic lines are currently available to label various types of cells. Owing ...

Using Zebrafish Models of Human Influenza A Virus Infections to Screen Antiviral Drugs and Characterize Host Immune Cell Responses

Each year, seasonal influenza outbreaks profoundly affect societies worldwide. In spite of global efforts, influenza remains an intractable healthcare burden. The principle strategy to curtail infections is yearly vaccination. In individuals who have contracted influenza, antiviral drugs can mitigate symptoms. There is a clear and unmet need to develop alternative strategies to combat influenza. Several animal models have been created to model host-influenza interactions. Here, protocols for generating zebrafish models for systemic and localized human influenza A virus (IAV) infection are described. Using a systemic IAV infection model, small molecules with potential antiviral activity can be screened. As a proof-of-principle, a protocol that demonstrates the efficacy of the antiviral drug Zanamivir in IAV-infected zebrafish is described. It shows how disease phenotypes can be quantified to score the relative efficacy of potential antivirals in IAV-infected zebrafish. In recent years, there has been increased appreciation for the critical role neutrophils play in the human host response to influenza infection. The zebrafish has proven to be an indispensable model for the study of neutrophil biology, with direct impacts on human medicine. A protocol to generate a localized IAV infection in the Tg(mpx:mCherry) zebrafish line to study neutrophil biology in the context of a localized viral infection is described. Neutrophil recruitment to localized infection sites provides an additional quantifiable phenotype for assessing experimental manipulations that may have therapeutic applications. Both zebrafish protocols described faithfully recapitulate aspects of human IAV infection. The zebrafish model possesses numerous inherent advantages, including high fecundity, optical clarity, amenability to drug screening, and availability of transgenic lines, including those in which immune cells such as neutrophils are labeled with fluorescent proteins. The protocols detailed here exploit these advantages and have the potential to reveal critical insights into host-IAV interactions that may ultimately translate into the clinic.

Systemic and localized zebrafish infection models for human influenza A virus are demonstrated. Using a systemic infection model, zebrafish can be used to screen antiviral drugs. Using a localized infection model, zebrafish can be used to characterize host immune cell responses.

Utilizzando modelli di Zebrafish di umana virus infezioni allo schermo farmaci antivirali e caratterizzare host immune cellulo Risposte

Each year, seasonal influenza outbreaks profoundly affect societies worldwide. In spite of global efforts, influenza remains an intractable healthcare ...

Long-term In Vivo Tracking of Inflammatory Cell Dynamics Within Drosophila Pupae

During the rapid inflammatory response to tissue damage, cells of the innate immune system are quickly recruited to the injury site. Once at the wound, innate immune cells perform a number of essential functions, such as fighting infection, clearing necrotic debris, and stimulating matrix deposition. In order to fully understand the diverse signaling events that regulate this immune response, it is crucial to observe the complex behaviors of (and interactions that occur between) multiple cell lineages in vivo, and in real-time, with the high spatio-temporal resolution. The optical translucency and the genetic tractability of Drosophila embryos have established Drosophila as an invaluable model to live-image and dissect fundamental aspects of inflammatory cell behavior, including mechanisms of developmental dispersal, clearance of apoptotic corpses&#160;and/or microbial pathogens, and recruitment to wounds. However, more recent work has now demonstrated that employing a much later stage in the Drosophila lifecycle &#8211; the Drosophila pupa &#8211; offers a number of distinct advantages, including improved RNAi efficiency, longer imaging periods, and significantly greater immune cell numbers. Here we describe a protocol for imaging wound repair and the associated inflammatory response at the high spatio-temporal resolution in live Drosophila pupae. To follow the dynamics of both re-epithelialization and inflammation, we use a number of specific in vivo fluorescent markers for both the epithelium and innate immune cells. We also demonstrate the effectiveness of photo-convertible fluorophores, such as Kaede, for following the specific immune cell subsets, to track their behavior as they migrate to, and resolve from, the injury site.

Long-term In Vivo Tracking of Inflammatory Cell Dynamics Within Drosophila Pupae

Here we present a protocol for live-imaging wound repair and the associated inflammatory response at high spatio-temporal resolution in vivo. This method utilizes the pupal stage of Drosophila development to enable long-term imaging and tracking of specific cell populations over time and is compatible with efficient RNAi-mediated gene inactivation.

Monitoraggio a lungo termine In Vivo della cellula infiammatoria dinamica all'interno della drosofila pupe

During the rapid inflammatory response to tissue damage, cells of the innate immune system are quickly recruited to the injury site. Once at the wound, ...

Monitoring On-Target Signaling Responses in Larval Zebrafish - Z-REX Unmasks Precise Mechanisms of Electrophilic Drugs and Metabolites

Reactive metabolites and related electrophilic drugs are among the most challenging small molecules to study. Conventional approaches to deconstruct the mode of action (MOA) of such molecules leverage bulk treatment of experimental specimens with an excess of a specific reactive species. In this approach, the high reactivity of electrophiles renders non-discriminate labeling of the proteome in a time- and context-dependent manner; redox-sensitive proteins and processes can also be indirectly and often irreversibly affected. Against such a backdrop of innumerable potential targets and indirect secondary effects, linking phenotype to specific target engagement remains a complex task. Zebrafish targeting reactive electrophiles and oxidants (Z-REX)-an on-demand reactive-electrophile delivery platform adapted for use in larval zebrafish-is designed to deliver electrophiles to a specific protein of interest (POI) in otherwise unperturbed live fish embryos. Key features of this technique include a low level of invasiveness, along with dosage-, chemotype-, and spatiotemporally-controlled precision electrophile delivery. Thus, in conjunction with a unique suite of controls, this technique sidesteps off-target effects and systemic toxicity, otherwise observed following uncontrolled bulk exposure of animals to reactive electrophiles and pleiotropic electrophilic drugs. Leveraging Z-REX, researchers can establish a foothold in the understanding of how individual stress responses and signaling outputs are altered as a result of specific reactive ligand engagement with a specific POI, under near-physiologic conditions in intact living animals.

Zebrafish targeting reactive electrophiles and oxidants (Z-REX) is a chemical biology-based method for the investigation of reactive small-molecule signaling. This technique can be applied to live fish of different developmental stages. Here, we couple standard assays in zebrafish with Z-REX for signaling pathway analysis.

Monitoraggio delle risposte di segnalazione on-target nel pesce zebra larvale - Z-REX smaschera meccanismi precisi di farmaci elettrofili e metaboliti

Reactive metabolites and related electrophilic drugs are among the most challenging small molecules to study. Conventional approaches to deconstruct the ...

Biologia

Photoconversion-Based Leukocyte Tracking in Bacterial-Infected Transgenic Zebrafish

Source: Harvie, E. A. et al., <a href="https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/52788">Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection.</a>&#160;J. Vis. Exp. (2015)
This video demonstrates the tracking of leukocyte recruitment using transgenic zebrafish larvae expressing photoconvertible green fluorescent protein. Pre-injecting red fluorescent dye-labeled bacteria into the otic vesicle and inducing photoconversion enables observation of leukocytes&#39; migration, phagocytosis, and dispersal throughout the body, providing valuable insights into immune response dynamics.

Tracciamento dei leucociti basato sulla fotoconversione in zebrafish transgenico infetto da batteri

1. Preparing Microinjection Needles

	Prepare thin wall glass capillary injection needles (1.0 OD/0.75 ID) using a micropipette puller device with the ...