Gli autori desiderano ringraziare il laboratorio del Dr. Carol Kim per la formazione microiniezione, Clarissa Henry per un consiglio per l&#39;accelerazione dello sviluppo embrionale e l&#39;uso di attrezzature e Nathan Lawson per contribuire fli1: pesce EGFP. Ringraziamo i membri del laboratorio di Wheeler e Shawn Mura per la lettura critica del manoscritto. Vorremmo anche ringraziare Mark Nilan per la cura dei pesci e consiglio, e Ryan Phennicie e Kristin Gabor per un parere tecnico su questo progetto. Questo lavoro è stato finanziato da un assistente di ricerca MAFES ai fratelli K., un MAFES Hatch sovvenzione E08913-08, e un premio NIH NCRR P20RR016463 a R. Wheeler.

Tutti i protocolli di cura zebrafish ed esperimenti sono stati eseguiti sotto la cura degli animali e del Comitato Istituzionale uso (IACUC) protocollo A2009-11-01. 1. Morfolino e Piatti iniezione larvali Sperimentale durata: * (10-15 minuti) Grado di difficoltà: * <ol><li> Per le iniezioni a base di uova, preparare una soluzione al 2% di agarosio in acqua sterile e forno a microonde. Quando la soluzione si è raffreddata versare una parte in un extra piatto fondo Petri (Fisher Scientific) fino a quando non è mezzo pieno. Raffreddare su ghiaccio e assicurarsi che la piastra sia a livello. </li><li> Una volta che il piatto è raffreddato, versare uno strato 15 mL superiore del 2% agarosio. Spruzzare una iniezione uovo scanalato stampi in plastica (Adaptive Tools Scienza) con acqua sterile da una bottiglia a spruzzo. Disporre con attenzione il solco stampo giù nel caldo agarosio. Quando l&#39;agarosio si è raffreddato, usare una spatola metallica piana (VWR Scientific) di dissociare lo stampo dal agarosa. Rimuovere lentamente la griglia dal agarosio. Avvolgere i piatti embrioni iniezione in Parafilm (VWR Scientific) e conservare invertito a 4 ° C. </li><li> Per iniezioni larvali di pesce, preparare una soluzione al 2% agarosio come descritto. Versare la soluzione in una capsula Petri di dimensioni standard (VWR Scientific) e mettere da parte fino a quando non si solidifica. Piatti di iniezione Wrap larvali in Parafilm e conservare invertita a 4 ° C. </li></ol> 2. Cultura Preparazione funghi Sperimentale durata: ** (30 minuti) Grado di difficoltà: ** <ol><li> Preparare estratto di lievito, peptone-destrosio (YPD) piastre di agar: 10 g / litro di estratto di lievito, 20 g / litro peptone, 20 g / litro destrosio, e 20 g / litro di agar e in autoclave. Per preparare liquido YPD 10 g / litro di estratto di lievito, 20 g / litro peptone, 20 g / litro e destrosio autoclave 20-30 minuti a 121 ° C. </li><li> Due giorni prima infezioni preparare un piatto di pesce striscia da congelatole scorte di Candida albicans culture su agar YPD per ottenere singole colonie. </li><li> Incubare a 37 ° C per una notte. </li><li> Mettere 5 ml di brodo YPD in 16 tubi di diametro da 150 x cultura (VWR Scientific). </li><li> Il giorno prima che le infezioni dei pesci prendere 1 piccola colonia in agar YPD con un tassello di legno (VWR Scientific). Mettere il bastone nel tubo cultura e turbinano attorno al risospendere colonia nel liquido YPD. </li><li> Grow notte a 37 ° C su un tamburo Culture TC-7 Roller tessuto dotato di un 14-pollici ruota provetta (New Brunswick Scientific). </li><li> Il giorno successivo, spin down 1 ml di cultura a 14000x g per 1 minuto in una provetta da 1,7 mL (Axygen). Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in liquido residuo con vortex (VWR Scientific). </li><li> Aggiungere 1 ml 1x tampone fosfato isotonico (VWR Scientific) e far girare come descritto in precedenza. </li><li> Ripetere il lavaggio PBS 3 volte. </li><li> Diluire diluizione 1:100 in 1x PBS (10 microlitri di C. albicans lavato in 990 microlitri 1x PBS). </li><li> Conta su un emocitometro (VWR Scientific). </li><li> Diluire a 10 7 cellule / ml. </li></ol> 3. Infezioni zebrafish Sperimentale durata: **** (1-3 ore) Grado di difficoltà: **** <ol><li> Raccogliere embrioni conformemente al punto 5 e conservare in uova-acqua, 60 mg / L sali Instant Ocean (Fisher Scientific) in acqua deionizzata sterile. </li><li> Utilizzando un microscopio da dissezione come il SZ61 Olympus (Olympus), embrioni dechorionate il giorno infezione. Utilizzare le pinzette Dumont Dumoxel (VWR Scientific) per tirare il corion 27 parte come aprire un sacchetto di patatine, o delicatamente colpire le pinzette in posizione chiusa nel corion e poi lentamente aprirli. Il pesce dovrebbe comparire a destra, fuori del corion. </li><li> Agitare il piatto più profonda Petri con il coperchio per spostare pesci al centro del piatto. Trasferire il pesce al coperchio del piatto. Rimuovere l&#39;acqua e uovasostituire con mezzi freschi. Aggiungere il pesce alla media. </li><li> Piatti caldi di iniezione larvali in un incubatore a 28 ° C. Preparare tricaine metano solfonato (Western Chemical Inc.) diluizione a 200 ug / mL per anestetizzare i pesci. </li><li> Contare il numero desiderato di larve per infezione (20-50 pesce). Mettere il pesce in soluzione metano solfonato tricaine e attendere 1-2 minuti fino a quando non smettono di muoversi. </li><li> Accendere l&#39;unità MPPI-3 ad iniezione (Applied Scientific Instruments). Accertarsi che il pressostato è su &quot;pulse&quot; e la &quot;durata dell&#39;impulso&quot; è impostato su 9 con 3 PSI per l&#39;unità contropressione. Aprire la valvola al serbatoio di azoto fino a quando la pressione sul gruppo di iniezione legge 30 PSI. </li><li> Caricare un tirato micropipetta 28 con 5 pl di vortexata Candida albicans ad una concentrazione di 1x10 7 cellule / ml. Posizionare la micropipetta nel supporto micropipetta (Applied Scientific Instruments). Riempire un vuoto capsula Petri più profonda con l&#39;acqua. Spostare la micropipetta finché la punta is all&#39;interno di vista sfiora la superficie dell&#39;acqua tramite microscopio a dissezione e l&#39;uso delle pinzette Dumont Dumoxel (VWR Scientific) per tagliare l&#39;ago di circa 3 mm dalla punta della pipetta tirato. </li><li> Premete l&#39;interruttore a pedale (Applied Scientific Instruments) per verificare che l&#39;ago è stato ritagliato. Si dovrebbe vedere il liquido si disperdono se hanno avuto successo. Il diametro del bolo liquido dovrebbe essere non più grande del diametro della pupilla di prim 25 larva zebrafish (0,21 mm, ottenendo una sfera di 4,9 nL in volume). Regolare la pressione di conseguenza se il bolo liquido è troppo grande o troppo piccolo. </li><li> Anestetizzare la pesce in metano solfonato tricaine (200 pg / mL). Una volta che il pesce ha smesso di muoversi, agitare il piatto con il coperchio fino a quando i pesci sono nel centro. Raccogliere 50 pesci usando una pipetta di trasferimento (Fisher Scientific). Toccare il lato della pipetta per risolvere il pesce verso la punta. Pipettare delicatamente pesce sul piatto larvale agarosio utilizzando come liquido meno possibile. </li><li> Linea il pesce con una bacchetta di vetro liscio (attenzione a non schiacciarli!). Aspirare quanto più liquido possibile, fuori del piatto. Utilizzare un Kimwipe ad evacuare l&#39;umidità. </li><li> Posizionare il piatto delle larve di agarosio con il pesce sotto il microscopio fino ad ottenere una buona vista del pesce e l&#39;ago allo stesso tempo. Spostare l&#39;ago di vetro verso il pesce. Zoom sia il pesce e l&#39;ago, come si posiziona l&#39;ago verso il pesce. Con attenzione spostare l&#39;ago di vetro nella vescicola otica 27, 29 (orecchio) del primo pesce. Saprete una volta che hai spostato l&#39;ago nel pesce perché quando si preme l&#39;interruttore a pedale (Applied Scientific Instruments), il ventricolo rombencefalo si solleva leggermente. </li><li> Premete l&#39;interruttore a pedale (Applied Scientific Instruments) e guardare il liquido si disperdono all&#39;interno rombencefalo del pesce ventricolo 27. Ritrarre l&#39;ago dal pesce e passare al pesce successivo. Ripetere la procedura fino a quando è stata iniettata tutti i pesci nel piatto. Rimuovere qualsiasi dead pesce e iniettare sostituzioni per mantenere il numero corretto (50 pesci). Per ogni gruppo di 50 pesci iniettato un ago microiniezione nuova deve essere preparato, o C. albicans si deposita nella parte inferiore dell&#39;ago e zoccoli, o getta via la concentrazione iniettato. </li><li> Lavare il pesce fuori del piatto inclinando il piatto e spruzzare uovo acqua sul pesce in un piatto fondo più pulito Petri contenente 60 mL di uova acqua. E &#39;importante non lasciare il pesce sul agarosio per più di 15-20 minuti o si seccano e muoiono. </li><li> Ripetere l&#39;intero processo di iniezione fino al termine. Non dimenticare PBS e non patogeni iniettati controlli. </li><li> Al termine, tenere il pesce a 28 ° C. </li><li> Chiudere il rubinetto della bombola di azoto. Spostare l&#39;interruttore unità di iniezione da &quot;impulso&quot; al &quot;continuo&quot; per alleviare la pressione nella linea del serbatoio, la pressione dovrebbe scendere a zero a questo punto. Passare unità di iniezione torna a &quot;impulsi&quot;. Spegnere l&#39;unità di iniezione e ripulire l&#39;area di lavoro. </li></ol&gt; 4. Preparazione del Pesce per l&#39;imaging Sperimentale durata: ** (30 minuti) Grado di difficoltà: ** <ol><li> Preparare la soluzione metano solfonato tricaine come prima (200 pg / mL). Esca pesce infetto, e trasferirli in tricaine. </li><li> Preparare 47,9 mL 0,4% agarosio low-melt (VWR scientifica) in uova acqua. Riscaldare la soluzione da microonde. Raffreddare a 37 ° C e aggiungere metano solfonato tricaine (200 pg / mL) alla miscela </li><li> Una volta che i pesci sono immobilizzati in metano solfonato tricaine, pesce pipetta individuo in una piastra di Petri (VWR scientifica) contenente 0,4% agarosio a basso punto di fusione (VWR Scientific). </li><li> Quindi, spostare i pesci dal basso punto di fusione di agarosio in singoli pozzetti di un piatto fondo di vetro (MatTek Corporation) per l&#39;imaging. Uso come poco bassa temperatura di fusione agarosio possibile così il pesce giace piatto sul fondo del piatto. Utilizzare solo abbastanza del tricaine-agarosio per riempire il incerchi ner del piatto fondo di vetro. </li></ol> 5. Modifiche relative a Giove protocolli Micropipette per Microiniezione Sperimentale durata: * (10-15 minuti) Grado di difficoltà: * <ol><li> Tirare canne cave di vetro BF120-69-10 (Strumenti Sutter) con un Flaming Brown Micropipetta Estrattore modello P-97 (Sutter Instruments) a seconda Yuan et al. 30. Scegliere il programma # 7 con il calore seguenti condizioni = 470, Velocità = 120, Time = 200. L&#39;ago risultante è di 8 mm da punta a smusso e, una volta tagliati a 3 mm sopra la punta ha un diametro di circa 10 pm. </li><li> Caricare una micropipetta di vetro nelle staffe. Selezionare &quot;Pull&quot;. Il filamento di riscaldamento riscalda l&#39;ago secondo i parametri del programma e la lastra di vetro si separerà in due micropipette tirato. Micropipette Conservare in un contenitore pipetta (Suttstrumenti er). </li></ol> Di raccolta degli embrioni, iniezione Morpholino e manutenzione Durata sperimentale: *** (1-2 ore) Grado di difficoltà: *** <ol start="3"><li> Raccogliere embrioni secondo i metodi di Rosen et al. 31. Utilizzare un setaccio di plastica (Wares di Knutsford) per raccogliere le uova dal serbatoio deposizione delle uova (ambienti acquatici). Tenere il setaccio a testa in giù sopra un piatto di Petri più profondo e risciacquare con acqua vasca di raccolta delle uova. </li><li> Per la preparazione morfolino, aggiungere 300 microlitri di acqua sterile a 300 nanomoli di morfolino (GeneTools, LLC). Questo dà uno stock di lavoro di 1,0 mm. </li><li> Controllare la concentrazione del morfolino utilizzando un NanoDrop (Thermo Scientific). Selezionare &quot;acido nucleico e cambiare il tipo di campione di&quot; altro &quot;e lunghezza d&#39;onda a 265. Inserire la costante moltiplicando il peso molecolare del morfolino da 1000 diviso il absorptivity coefficiente di figurare nella scheda di morfolino proprietà oligo. </li><li> Bianche il NanoDrop con 2 pl 0,1 N HCl. Diluire 5 pl della soluzione morfolino in 95 pl di HCl 0,1 N (20x diluizione). Mettere 2 microlitri della diluizione sul piedistallo NanoDrop e misura click. Moltiplicare la concentrazione per il fattore di diluizione (20). Questo dà una concentrazione operativa di morfolino. Per calcolare la concentrazione millimolare dividere la concentrazione ottenuta dal peso molecolare del morfolino. </li><li> Preparare una stock di lavoro di morfolino Danieau in tampone (58 mM NaCl, 0,7 mM KCl, 0,4 mM MgSO 4, 0,6 mM Ca (NO 3) 2, 5.0 mM di HEPES, pH 7,6) e 0,01% di rosso fenolo (VWR Scientific). </li><li> Per lavoro iniezione morfolino seguire il protocollo secondo Rosen et al. 31 e Yuan et al. 30. Lavare i piatti di iniezione morpholino con uovo e acqua calda a 28 ° C per 15 minuti. Rimuovere l&#39;acqua dai piatti di iniezione e line-up one-cstadio embrioni ell nelle scanalature del piatto di iniezione (preparato dalla sezione 1) con una pipetta di trasferimento. Ogni piastra grado di contenere circa 250 uova. Iniettare 1-2 embrioni allo stadio di cellule con morfolino. Uova rimarrà in uno stadio di cellule per 15 minuti 27. </li><li> Lavare le uova iniettate con uovo-acqua quando finiti (acqua deionizzata sterile con 60 mg / L sali Instant Ocean) e porlo in 60 mL di uova in acqua supplementare piastre di Petri profonde. Piatti di iniezione Morpholino può essere riutilizzato. Risciacquare con acqua uovo quando hai finito e memorizzare invertita a 4 ° C. </li><li> Per la conservazione di embrioni aggiungere 60 ml di acqua uova al piatto. Contare i 110 embrioni con una pipetta di trasferimento in diverse capsule di Petri profonde supplementari con 60 mL uovo d&#39;acqua. Aggiungi 0,00003% blu di metilene per prevenire la crescita microbica e embrioni incubare a 28 ° C. </li><li> Per accelerare lo sviluppo di embrioni embrioni mantenere i piatti a 33 ° C per 24 ore e stage secondo Kimmel et al. 27, consentendo di sviluppare embrioni ad una testaAngolo del tronco di 75 ° (Prim 25 stage 27). </li><li> Per il lavoro l&#39;infezione larvale tenere embrioni a 28 ° C dopo l&#39;iniezione con il C. albicans. </li><li> Ogni giorno sostituire i piatti embrione con 60 ml di acqua fresca all&#39;uovo. </li></ol> Imaging Sperimentale durata: ***** (1-5 ore) Grado di difficoltà: *** <ol start="14"><li> Preparare il pesce in basso punto di fusione di agarosio (secondo il punto 4.2) con tricaine in piatti a base di imaging fondo di vetro (MatTek Corporation) come descritto in precedenza. Porre la capsula in un IX-81 Olympus (Olympus) stage microscopio invertito. Portare il pesce a fuoco con un ingrandimento di 4x in contrasto interferenziale differenziale (DIC) della luce. Le immagini possono essere catturate a 4x, 20x e 40x di ingrandimento in DIC, TRITC (isotiocianato rodamina tetrametil) e FITC (isotiocianato di fluorescina), impostazioni del filtro. </li><li> Utilizzare un Olympus IX-81 microscopio invertito con un FV-1000 sistema di scansione laser confocale secondo Ariga et al. 32. Condurre corsi a tempo con ingrandimento 40x impostando Z-stack con fette di 1-1,5 micron ogni ora di infezione. </li><li> Per l&#39;imaging lungo andamento nel tempo di 2 ore o più, disporre uno strato di agarosio a bassa fusione sulla parte superiore del pesce nel piatto di imaging ogni 2-3 ore. Questo impedisce l&#39;agarosio si secchi e la frantumazione il pesce mentre viene ripreso. Per i corsi di tempo lunghi con un piccolo numero di pesci, utilizzare una fase riscaldato (Bioptechs Inc.) per mantenere 28 ° C durante infezioni. </li></ol> 6. Risultati rappresentativi Un esempio di un successo rombencefalo ventricolo C. infezione albicans in una larva zebrafish a 5 ore dopo l&#39;infezione (IPU) e 24 HPI è illustrato nella (Figura 1). Macrofagi come cellule con inghiottito C. albicans si vedono nel ventricolo rombencefalo a 5 HPI. Entro il 24 HPI, C. albicans si trova all&#39;interno dei macrofagi-like cells nel tessuto coda dorsale indicativa della candidosi disseminata. Questo risultato infezione è altamente dipendente da una precisa iniezione di 10-15 lievito forma C. albicans nel ventricolo rombencefalo. Proiezione di pesci infetti immediatamente post-iniezione può garantire questo. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4051/4051fig1.jpg" /> Figura 1 transgenico fli1:. EGFP 22, 33 larva infettati con CaF2-yCherry Candida albicans e ripreso intravitally mediante microscopia confocale. (AC) 5 ore post-infezione (A) larva Infected con EGFP che esprimono macrofago-come le cellule nel sito di infezione (rombencefalo ventricolo) bar Scala = 100 micron. (B e C) le immagini ingrandimento maggiore di pesce stesso, mostrando C. albicans all&#39;interno fagociti. Barra della scala = 100 micron per B e 10 micron per C. (DF) 24 ore post-infezione (D) larva infetta con candidosi disseminata, con CaF2-yCherry C. albicans all&#39;interno EGFP macrophage cellule simili nel tessuto coda dorsale. Scala bar = 100 micron. (E e F) immagini forti ingrandimenti di pesce stesso, mostrando C. albicans nei tessuti della coda. Scala bar = 100 micron.

Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

Il metodo di microiniezione zebrafish qui presentata si differenzia da Gutzman et al. In 34 che qui si dimostra l&#39;iniezione attraverso la vescicola otica nel ventricolo rombencefalo di 36-48 larve HPF. Il metodo che permette di descrivere l&#39;iniezione costante del 10-15 lievito nel ventricolo rombencefalo con danno tissutale ridotta. Questo protocollo produce inizialmente una infezione locale che si propaga attraverso il corpo da 24 HPI (figura 1) e determina letalità signifi...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti (opzionale) </td></tr><tr><td> Vasche di deposizione </td><td> Habitat acquatici </td><td> 2L </td><td></td></tr><tr><td> 1,7 ml provette </td><td> Axygen </td><td> MCT-175-C </td><td></td></tr><tr><td> Istantanea Ocean </td><td> Fisher Scientific </td><td> S17957C </td><td></td></tr><tr><td> Extra piastre di Petri profonde </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08-757-11Z </td><td></td></tr><tr><td> Standard Scatole Petri </td><td> VWR Scientific </td><td> 25384-302 </td><td></td></tr><tr><td> Pipette di trasferimento </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-711-7M </td><td></td></tr><tr><td> Estratto di lievito </td><td> VWR Scientificafic </td><td> 90000-726 </td><td></td></tr><tr><td> Peptone </td><td> VWR Scientific </td><td> 90000-264 </td><td></td></tr><tr><td> Destrosio </td><td> Fisher Scientific </td><td> D16-1 </td><td></td></tr><tr><td> Agar </td><td> VWR Scientific </td><td> 90000-760 </td><td></td></tr><tr><td> Emocitometro monouso </td><td> VWR Scientific </td><td> 82030-468 </td><td></td></tr><tr><td> Soluzione tampone fosfato </td><td> VWR Scientific </td><td> 12001-986 </td><td></td></tr><tr><td> Dumont Dumoxel Pinzetta </td><td> VWR Scientific </td><td> 100501-806 </td><td></td></tr><tr><td> Tasselli di legno </td><td> VWR Scientific </td><td> 10805-018 </td><td></td></tr><tr><td> Kimwipes </td><td> VWR Scientific </td><td> 300053-964 </td><td></td></tr><tr><td> Low MeltAgarosio </td><td> VWR Scientific </td><td> 12001-722 </td><td></td></tr><tr><td> Agarosio per i piatti di iniezione </td><td> VWR Scientific </td><td> 12002-102 </td><td></td></tr><tr><td> Flaming Brown Micropipetta Puller </td><td> Sutter Instruments </td><td> P-97 </td><td></td></tr><tr><td> Bacchette di vetro Hollow </td><td> Sutter Instruments </td><td> BF120-69-10 </td><td> Per le canne di vetro vetro liscio dal riscaldamento sopra becco Bunsen </td></tr><tr><td> Pipettare Scatola </td><td> Sutter Instruments </td><td> BX10 </td><td></td></tr><tr><td> MPPI-3 Sistema di iniezione </td><td> Applicata strumentazione scientifica </td><td> MPPI-3 </td><td></td></tr><tr><td> Unità di pressione Indietro </td><td> Applicata strumentazione scientifica </td><td> BPU </td><td></td></tr><tr><td> Micropipetta Holder Kit </td><td> AppliStrumentazione scientifica ed </td><td> MPIP </td><td></td></tr><tr><td> Foot Switch </td><td> Applicata strumentazione scientifica </td><td> FSW </td><td></td></tr><tr><td> Micromanipolatore </td><td> Applicata strumentazione scientifica </td><td> MM33 </td><td></td></tr><tr><td> Base magnetica </td><td> Applicata strumentazione scientifica </td><td> Base magnetica </td><td></td></tr><tr><td> Tricaine metano solfonato </td><td> Occidentale Chemical Inc. </td><td> MS-222 </td><td></td></tr><tr><td> Dissezione Scope </td><td> Olimpo </td><td> SZ61 top SZX-ILLB2-100 di base </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio confocale </td><td> Olimpo </td><td> IX-81 con la FV-1000 sistema di scansione laser confocale </td><td></td></tr><tr><td> TC-7 Roller Tissue Culture tamburo della ruota con il 14 pollici provetta </td><td> New Brunswick Scientific </td><td> TC-7 </td><td></td></tr><tr><td> Imaging Piatti </td><td> MatTek Corporation </td><td> P24G-1.0-10-F </td><td></td></tr><tr><td> Puntali per il caricamento di aghi </td><td> Eppendorf </td><td> 930001007 </td><td></td></tr><tr><td> Griglie piastra colata </td><td> Adaptive Scienza Tools </td><td> TU-1 </td><td></td></tr><tr><td> Fase riscaldata </td><td> Bioptechs Inc. </td><td> Delta T-5 </td><td></td></tr><tr><td> Spatola piatta </td><td> VWR Scientific </td><td> 82027-486 </td><td></td></tr><tr><td> Setacci di plastica </td><td> Wares di Knutsford online </td><td> 12 cm </td><td></td></tr><tr><td> Parafilm </td><td> VWR Scientific </td><td> 52858-000 </td><td></td></tr><tr><td> Vortex Genie </td><td> VWR Scientific </td><td> 14216-184 </td><td></td></tr><tr><td> 16 x 150 mm Cultura tubi </td><td> VWR Scientific </td><td> 60825-435 </td><td></td></tr><tr><td> NanoDrop </td><td> Thermo Scientific </td><td> ND 2000 </td><td></td></tr><tr><td> Rosso fenolo </td><td> VWR Scientific </td><td> 97062-478 </td><td></td></tr><tr><td> HCl </td><td> VWR Scientific </td><td> 87003-216 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> VWR Scientific </td><td> BDH4534-500GP </td><td></td></tr><tr><td> KCl </td><td> VWR Scientific </td><td> BDH4532-500GP </td><td></td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td> VWR Scientific </td><td> BDH0246-500GP </td><td></td></tr><tr><td> Ca (NO 3) 2 </td><td> VWR Scientific </td><td> BDH0226-500GP </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> VWR Scientific </td><td> BDH4520-500GP </td><td></td></tr&gt; <tr><td> Morpholinos </td><td> GeneTools, LLC </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

non-invasive imaging of disseminated candidiasis in zebrafish larvae

Candidiasi disseminata causata dal patogeno Candida albicans è un problema importante negli individui clinicamente ospedalizzati e viene associato ad una mortalità 30 al 40% attribuibile 6. Candidosi sistemica è normalmente controllata da immunità innata, e gli individui con difetti genetici in cellule immunitarie innate componenti come NADPH ossidasi dei fagociti sono più sensibili alla candidemia 7-9. Molto poco si sa circa la dinamica di C. l&#39;interazione con le innate albicans cellule immunitarie in vivo. Ampia studi in vitro hanno stabilito che al di fuori dello Stato membro ospitante C. albicans germina all&#39;interno dei macrofagi, ed è rapidamente distrutto da neutrofili 10-14. Gli studi in vitro, anche se utile, non può ricapitolare il complesso in un ambiente vivo, che include dipendenti dal tempo la dinamica dei livelli di citochine, gli allegati della matrice extracellulare, e contatti intercellulari 10, 15-18 </sup&gt;. Per sondare il contributo di questi fattori in interazione ospite-patogeno, è fondamentale trovare un organismo modello per visualizzare questi aspetti di infezione non-invasiva in un ospite in diretta intatto. La larva zebrafish offre un ospite vertebrato unico e versatile per lo studio di infezione. Per i primi 30 giorni di larve di sviluppo zebrafish hanno solo le difese immunitarie innate 2, 19-21, semplificando lo studio di malattie come la candidosi disseminata, che sono altamente dipendenti sull&#39;immunità innata. Le dimensioni ridotte e la trasparenza delle larve zebrafish consentire l&#39;imaging delle dinamiche dell&#39;infezione a livello cellulare sia per ospite e patogeno. Larve transgenica con fluorescenti innate cellule immunitarie possono essere utilizzate per identificare specifici tipi di cellule coinvolte nella infezione 22-24. Modificati oligonucleotidi antisenso (Morpholinos) possono essere utilizzati per abbattere i vari componenti del sistema immunitario come NADPH ossidasi dei fagociti e di studiare i cambiamenti in risposta a Fungal infezione 5. Oltre ai vantaggi etici e pratici di utilizzo di un piccolo vertebrato inferiore, le larve zebrafish offre la possibilità unica di immagine la battaglia campale tra patogeno e ospite sia intravitally e nel colore. Il pesce zebra è stato utilizzato per l&#39;infezione modello per un numero di batteri patogeni umani, e ha contribuito a notevoli progressi nella nostra comprensione delle infezioni da micobatteri 3, 25. Tuttavia, solo recentemente sono molto più grandi patogeni quali funghi stati utilizzati per infettare larva 5, 23, 26, e ad oggi non c&#39;è stata una descrizione dettagliata visiva della metodologia infezione. Qui vi presentiamo le nostre tecniche di microiniezione ventricolo rombencefalo di prim 25 zebrafish, comprese le nostre modifiche ai protocolli precedenti. I nostri risultati con il modello larvale zebrafish per infezione fungina divergono da studi in vitro e rafforzare la necessità di esaminare l&#39;ospite-patogeno Interaazione nel complesso contesto del paese ospitante, piuttosto che il sistema semplificato del piatto Petri 5.

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Non-invasive Imaging of Disseminated Candidiasis in Zebrafish Larvae

Il rapido sviluppo, di piccola dimensione e la trasparenza delle zebrafish sono vantaggi enormi per lo studio del sistema immunitario innato il controllo delle infezioni<sup&gt; 1-4</sup&gt;. Qui mostriamo le tecniche per infettare le larve di zebrafish con il patogeno fungino<em&gt; Candida albicans</em&gt; Con microiniezione, la metodologia recentemente utilizzata per coinvolgere fagocita l&#39;attività NADPH ossidasi nel controllo del dimorfismo fungino<sup&gt; 5</sup&gt;.

Non invasiva Imaging di candidosi disseminata nelle larve Zebrafish

Disseminated candidiasis caused by the pathogen Candida albicans is a clinically important problem in hospitalized individuals and is associated with a 30 ...

non-invasive-imaging-of-disseminated-candidiasis-in-zebrafish-larvae

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

14.6K Views.  University of Maine. Il rapido sviluppo, di piccola dimensione e la trasparenza delle zebrafish sono vantaggi enormi per lo studio del sistema immunitario innato il controllo delle infezioni 1-4. Qui mostriamo le tecniche per infettare le larve di zebrafish con il patogeno fungino Candida albicans Con microiniezione, la metodologia recentemente utilizzata per coinvolgere fagocita l'attività NADPH ossidasi nel controllo del dimorfismo fungino 5

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Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists. The value of 2P microscopy is that it provides rich spatiotemporal information regarding cell behaviors within intact tissues and in live mice. Leukocyte recruitment plays a significant role in host defense against infection and when unchecked, can contribute to inflammatory and autoimmune diseases. Studying leukocyte recruitment in vivo is technically challenging since cells are moving rapidly within vessels located deep within light scattering tissues. To date, most intravital imaging studies require surgical preparation to expose the blood vessels and tissues. To avoid the tissue damage and inflammation induced by surgery itself, here, we describe a non-invasive single-cell imaging approach that can be used to study leukocyte trafficking in the mouse footpad and phalanges. We discuss the technical aspects of our 2P imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Here, we describe a non-invasive two-photon (2P) microscopy approach to study leukocyte homing in the mouse footpad. We discuss the technical aspects of our tissue imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Non invasiva di imaging di homing dei leucociti e la migrazione In vivo</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

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Immunologia e infezioni

Non-invasive Optical Imaging of the Lymphatic Vasculature of a Mouse

The lymphatic vascular system is an important component of the circulatory system that maintains fluid homeostasis, provides immune surveillance, and mediates fat absorption in the gut. Yet despite its critical function, there is comparatively little understanding of how the lymphatic system adapts to serve these functions in health and disease1. Recently, we have demonstrated the ability to dynamically image lymphatic architecture and lymph "pumping" action in normal human subjects as well as in persons suffering lymphatic dysfunction using trace administration of a near-infrared fluorescent (NIRF) dye and a custom, Gen III-intensified imaging system2-4. NIRF imaging showed dramatic changes in lymphatic architecture and function with human disease. It remains unclear how these changes occur and new animal models are being developed to elucidate their genetic and molecular basis. In this protocol, we present NIRF lymphatic, small animal imaging5,6 using indocyanine green (ICG), a dye that has been used for 50 years in humans7, and a NIRF dye-labeled cyclic albumin binding domain (cABD-IRDye800) peptide that preferentially binds mouse and human albumin8. Approximately 5.5 times brighter than ICG, cABD-IRDye800 has a similar lymphatic clearance profile and can be injected in smaller doses than ICG to achieve sufficient NIRF signals for imaging8. Because both cABD-IRDye800 and ICG bind to albumin in the interstitial space8, they both may depict active protein transport into and within the lymphatics. Intradermal (ID) injections (5-50 &mu;l) of ICG (645 &mu;M) or cABD-IRDye800 (200 &mu;M) in saline are administered to the dorsal aspect of each hind paw and/or the left and right side of the base of the tail of an isoflurane-anesthetized mouse. The resulting dye concentration in the animal is 83-1,250 &mu;g/kg for ICG or 113-1,700 &mu;g/kg for cABD-IRDye800. Immediately following injections, functional lymphatic imaging is conducted for up to 1 hr using a customized, small animal NIRF imaging system. Whole animal spatial resolution can depict fluorescent lymphatic vessels of 100 microns or less, and images of structures up to 3 cm in depth can be acquired9. Images are acquired using V++ software and analyzed using ImageJ or MATLAB software. During analysis, consecutive regions of interest (ROIs) encompassing the entire vessel diameter are drawn along a given lymph vessel. The dimensions for each ROI are kept constant for a given vessel and NIRF intensity is measured for each ROI to quantitatively assess "packets" of lymph moving through vessels.

Recently developed imaging techniques using near-infrared fluorescence (NIRF) may help elucidate the role the lymphatic system plays in cancer metastasis, immune response, wound repair, and other lymphatic-associated diseases.

Non invasiva di imaging ottico del sistema vascolare linfatico di un mouse

The lymphatic  vascular system is an important component of the circulatory system that  maintains fluid homeostasis, provides immune surveillance, and ...

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Investigation of the interactions between animal host and bacterial pathogen is only meaningful if the infection model employed replicates the principal features of the natural infection. This protocol describes procedures for the establishment and evaluation of systemic infection due to neuropathogenic Escherichia coli K1 in the neonatal rat. Colonization of the gastrointestinal tract leads to dissemination of the pathogen along the gut-lymph-blood-brain course of infection and the model displays strong age dependency. A strain of E. coli O18:K1 with enhanced virulence for the neonatal rat produces exceptionally high rates of colonization, translocation to the blood compartment and invasion of the meninges following transit through the choroid plexus. As in the human host, penetration of the central nervous system is accompanied by local inflammation and an invariably lethal outcome. The model is of proven utility for studies of the mechanism of pathogenesis, for evaluation of therapeutic interventions and for assessment of bacterial virulence.

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Here, a procedure is described for the establishment of systemic infection in the neonatal rat with cultures of Escherichia coli K1. This non-invasive procedure permits colonization of the gastrointestinal tract, translocation of the pathogen to the systemic circulation, and invasion of the central nervous system at the choroid plexus.

Non invasiva Modello di neuropatogeno<em&gt; Escherichia coli</em&gt; L&#39;infezione neonatale nel ratto

Investigation of the interactions between animal host and bacterial pathogen is only meaningful if the infection model employed replicates the principal ...

Complete Thymectomy in Adult Rats with Non-invasive Endotracheal Intubation

Thymectomy in neonatal rodents is an established and reliable procedure for immunological studies. However, in adult rats, complications of hemorrhage and pneumothorax from pleural disruption can result in a significant mortality rate. This protocol is a simple method of rat thymectomy that utilizes a mini-sternotomy and endotracheal intubation. Intubation is accomplished with a non-invasive and easily reproducible method and allows for positive pressure ventilation to prevent pneumothorax and a controlled airway that allows sufficient time for careful thymus dissection to minimize pleural disruption. A 1.5 cm sternal incision decreases contact with mediastinal vessels and pleura, while still providing full visualization of the thymus. Following exposure of the mediastinum, the thymus is removed by blunt dissection under magnification. The pleural space is then sealed by suture closure of the pre-tracheal muscles followed by the application of surgical glue. The thorax is then closed by suture closure of the sternum, followed by suture closure of the skin. All thymectomies were complete as evidenced by immunohistochemical (IHC) staining of mediastinal tissue, and absence of na&#239;ve T-cells by flow cytometry, and the procedure had a 96% survival rate. This method is suitable when complete thymectomy with minimal complications is desired for further immunological studies in athymic adult rats.

Rodent thymectomy is a valuable technique in immunological research. Here, a protocol for complete thymectomy in adult rats using a mini-sternotomy along with non-invasive intubation and positive pressure ventilation to minimize perioperative morbidity and mortality is described.

Thymectomy completa in ratti adulti con non-invasiva intubazione endotracheale

Thymectomy in neonatal rodents is an established and reliable procedure for immunological studies. However, in adult rats, complications of hemorrhage and ...

Modeling Mucosal Candidiasis in Larval Zebrafish by Swimbladder Injection

Early defense against mucosal pathogens consists of both an epithelial barrier and innate immune cells. The immunocompetency of both, and their intercommunication, are paramount for the protection against infections. The interactions of epithelial and innate immune cells with a pathogen are best investigated in vivo, where complex behavior unfolds over time and space. However, existing models do not allow for easy spatio-temporal imaging of the battle with pathogens at the mucosal level.
The model developed here creates a mucosal infection by direct injection of the fungal pathogen, Candida albicans, into the swimbladder of juvenile zebrafish. The resulting infection enables high-resolution imaging of epithelial and innate immune cell behavior throughout the development of mucosal disease. The versatility of this method allows for interrogation of the host to probe the detailed sequence of immune events leading to phagocyte recruitment and to examine the roles of particular cell types and molecular pathways in protection. In addition, the behavior of the pathogen as a function of immune attack can be imaged simultaneously by using fluorescent protein-expressing C. albicans. Increased spatial resolution of the host-pathogen interaction is also possible using the described rapid swimbladder dissection technique.
The mucosal infection model described here is straightforward and highly reproducible, making it a valuable tool for the study of mucosal candidiasis. This system may also be broadly translatable to other mucosal pathogens such as mycobacterial, bacterial or viral microbes that normally infect through epithelial surfaces.

In vivo spatio-temporal interactions of pathogen and immune defenses at the mucosal level are not easily imaged in existing vertebrate hosts. The method presented here describes a versatile platform to study mucosal candidiasis in live vertebrates using the swimbladder of the juvenile zebrafish as an infection site.

Modellazione mucosa Candidosi in Zebrafish larvale da vescica natatoria Injection

Early defense against mucosal pathogens consists of both an epithelial barrier and innate immune cells. The immunocompetency of both, and their ...

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of causing systemic disease in both fish and humans. A better understanding of S. iniae disease pathogenesis requires an appropriate model system. The genetic tractability and the optical transparency of the early developmental stages of zebrafish allow for the generation and non-invasive imaging of transgenic lines with fluorescently tagged immune cells. The adaptive immune system is not fully functional until several weeks post fertilization, but zebrafish larvae have a conserved vertebrate innate immune system with both neutrophils and macrophages. Thus, the generation of a larval infection model allows the study of the specific contribution of innate immunity in controlling S. iniae infection.
The site of microinjection will determine whether an infection is systemic or initially localized. Here, we present our protocols for otic vesicle injection of zebrafish aged 2-3 days post fertilization as well as our techniques for fluorescent confocal imaging of infection. A localized infection site allows observation of initial microbe invasion, recruitment of host cells and dissemination of infection. Our findings using the zebrafish larval model of S. iniae infection indicate that zebrafish can be used to examine the differing contributions of host neutrophils and macrophages in localized bacterial infections. In addition, we describe how photolabeling of immune cells can be used to track individual host cell fate during the course of infection.

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Here, we present a protocol for the generation and imaging of a localized bacterial infection in the zebrafish otic vesicle.

Imaging non invasiva della risposta immunitaria innata in un modello di Zebrafish larvale<em&gt; Streptococcus iniae</em&gt; Infezione

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of ...

Deciphering and Imaging Pathogenesis and Cording of Mycobacterium abscessus in Zebrafish Embryos

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as an infection model to study the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen interactions.&#160;The ease of obtaining large numbers of embryos, their accessibility due to external development, their optical transparency as well as the availability of a wide panoply of genetic/immunological tools and transgenic reporter line collections, contribute to the versatility of this model.&#160;In this respect, the present manuscript describes the use of zebrafish as an&#160;in vivo&#160;model system to investigate the chronology of Mycobacterium abscessus infection. This human pathogen can exist either as smooth (S) or rough (R) variants, depending on cell wall composition, and their respective virulence can be imaged and compared in zebrafish embryos and larvae. Micro-injection of either S or R fluorescent variants directly in the blood circulation via the caudal vein, leads to chronic or acute/lethal infections, respectively. This biological system allows high resolution visualization and analysis of the role of mycobacterial cording in promoting abscess formation. In addition, the use of fluorescent bacteria along with transgenic zebrafish lines harbouring fluorescent macrophages produces a unique opportunity for multi-color imaging of the host-pathogen interactions. This article describes detailed protocols for the preparation of homogenous M. abscessus inoculum and for intravenous injection of zebrafish embryos for subsequent fluorescence imaging of the interaction with macrophages. These techniques open the avenue to future investigations involving mutants defective in cord formation and are dedicated to understand how this impacts on M. abscessus pathogenicity in a whole vertebrate.

Deciphering and Imaging Pathogenesis and Cording of Mycobacterium abscessus in Zebrafish Embryos

Optically transparent zebrafish embryos are widely used to study and visualize in real time the interactions between pathogenic microorganisms and the innate immune cells. Micro-injection of Mycobacterium abscessus, combined with fluorescence imaging, is used to scrutinize essential pathogenic features such as cord formation in zebrafish embryos.

Decifrare e Imaging Patogenesi e Cording di<em&gt; Mycobacterium abscessus</em&gt; In Zebrafish embrioni

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as an infection model to study the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen ...

A Non-invasive and Technically Non-intensive Method for Induction and Phenotyping of Experimental Bacterial Pneumonia in Mice

Although community-acquired pneumonia remains a major public health problem, murine models of bacterial pneumonia have recently facilitated significant preclinical advances in our understanding of the underlying cellular and molecular pathogenesis. In vivo mouse models capture the integrated physiology and resilience of the host defense response in a manner not revealed by alternative, simplified ex vivo approaches. Several methods have been described in the literature for intrapulmonary inoculation of bacteria in mice, including aerosolization, intranasal delivery, peroral endotracheal cannulation under &#39;blind&#39; and visualized conditions, and transcutaneous endotracheal cannulation. All methods have relative merits and limitations. Herein, we describe in detail a non-invasive, technically non-intensive, inexpensive, and rapid method for intratracheal delivery of bacteria that involves aspiration (i.e., inhalation) by the mouse of an infectious inoculum pipetted into the oropharynx while under general anesthesia. This method can be used for pulmonary delivery of a wide variety of non-caustic biological and chemical agents, and is relatively easy to learn, even for laboratories with minimal prior experience with pulmonary procedures. In addition to describing the aspiration pneumonia method, we also provide step-by-step procedures for assaying the subsequent in vivo pulmonary innate immune response of the mouse, in particular, methods for quantifying bacterial clearance and the cellular immune response of the infected airway. This integrated and simple approach to pneumonia assessment allows for rapid and robust evaluation of the effect of genetic and environmental manipulations upon pulmonary innate immunity.

Several methods have been described in the literature for modeling bacterial pneumonia in mice. Herein, we describe a non-invasive, inexpensive, rapid method for inducing pneumonia via aspiration (i.e., inhalation) of a bacterial inoculum pipetted into the oropharynx. Downstream methods for assessment of the pulmonary innate immune response are also detailed.

Un metodo non invasivo e tecnicamente non intensiva per l&#39;induzione e Fenotipizzazione Sperimentale polmonite batterica nei topi

Although community-acquired pneumonia remains a major public health problem, murine models of bacterial pneumonia have recently facilitated significant ...

Non-invasive In Vivo Fluorescence Optical Imaging of Inflammatory MMP Activity Using an Activatable Fluorescent Imaging Agent

This paper describes a non-invasive method for imaging matrix metalloproteinases (MMP)-activity by an activatable fluorescent probe, via in vivo fluorescence optical imaging (OI), in two different mouse models of inflammation: a rheumatoid arthritis (RA) and a contact hypersensitivity reaction (CHR) model. Light with a wavelength in the near infrared (NIR) window (650 - 950 nm) allows a deeper tissue penetration and minimal signal absorption compared to wavelengths below 650 nm. The major advantages using fluorescence OI is that it is cheap, fast and easy to implement in different animal models.
Activatable fluorescent probes are optically silent in their inactivated states, but become highly fluorescent when activated by a protease. Activated MMPs lead to tissue destruction and play an important role for disease progression in delayed-type hypersensitivity reactions (DTHRs) such as RA and CHR. Furthermore, MMPs are the key proteases for cartilage and bone degradation and are induced by macrophages, fibroblasts and chondrocytes in response to pro-inflammatory cytokines. Here we use a probe that is activated by the key MMPs like MMP-2, -3, -9 and -13 and describe an imaging protocol for near infrared fluorescence OI of MMP activity in RA and control mice 6 days after disease induction as well as in mice with acute (1x challenge) and chronic (5x challenge) CHR on the right ear compared to healthy ears.

Non-invasive In Vivo Fluorescence Optical Imaging of Inflammatory MMP Activity Using an Activatable Fluorescent Imaging Agent

This paper explains the application of fluorescent imaging using an activatable optical imaging probe to visualize the in vivo activity of key matrix metalloproteinases in two different experimental models of inflammation.

Non invasivo<em&gt; In Vivo</em&gt; Fluorescenza ottica di imaging dell&#39;attività MMP infiammatoria utilizzando un agente fluorescente di imaging attivo

This paper describes a non-invasive method for imaging matrix metalloproteinases (MMP)-activity by an activatable fluorescent probe, via in vivo ...

A Non-invasive Way to Isolate and Phenotype Cells from the Conjunctiva

Traditionally, ocular surface cytology is studied with techniques such as spatula technology and brush technology. The problem with these techniques is that they may induce traumatic lesions on the surface of the eye, which can progress to scarring, eyelid deformity, limbal stem cell deficiency and in some cases, cause great discomfort to the subject. To avoid these clinical problems, impression cytology (IC) was developed to diagnose dry eye disease and later neoplasia, atopic disease, vernal keratoconjunctivitis and keratoconjunctivitis sicca. Typically, clinicians manually cut filter papers into required shapes and apply these to the ocular surface. Here, we describe how to perform IC using a commercially available medical device. This technique is explained here followed by immunophenotyping by flow cytometry. This technique requires less manual handling and causes less injury to the ocular surface.

The exposed normal ocular surface consists of cornea and conjunctiva. Epithelial cells, goblet cells and immune cells are present in the conjunctiva. Here, a non-invasive, technique of impression cytology is described using an impression cytology device and flow cytometry to analyze immune cells in the conjunctiva.

Un modo non invasivo per isolare e fenotipo le cellule della Conjunctiva

Traditionally, ocular surface cytology is studied with techniques such as spatula technology and brush technology. The problem with these techniques is ...