Il danno allo stroma corneale adulto porta a una rapida risposta di guarigione della ferita che compromette la vista a causa della formazione di tessuto cicatriziale opaco. Questo protocollo genera ferite nelle cornee embrionali dei pulcini che, a differenza degli adulti, possono guarire senza cicatrici. Data la capacità intrinseca della cornea embrionale lesa di subire una completa ricapitolazione della struttura corneale nativa senza cicatrici rilevabili, il pulcino embrionale serve un importante modello animale per chiarire i fattori molecolari e cellulari per la guarigione delle ferite corneali senza cicatrici.
L'aspetto più impegnativo di questa tecnica è generare una ferita consistente che penetra sia nell'epitelio più esterno che nello stroma corneale più profondo. Come si sta imparando, può essere utile visualizzare le cornee ferite in una sezione trasversale in modo da poter valutare la profondità della penetrazione della ferita nello stroma corneale. Per iniziare, disporre le uova orizzontalmente su un vassoio e contrassegnarle nella parte superiore dell'uovo per indicare la posizione prevista dell'embrione.
Incubare queste uova in un incubatore umidificato a 38 gradi Celsius con la funzione di dondolo attivata. Rimuovere l'uovo dall'incubatrice il terzo giorno di sviluppo embrionale e posizionarlo orizzontalmente in un portaovoi sicuro. Crea un piccolo foro nella parte superiore del guscio d'uovo vicino all'estremità appuntita dell'uovo usando l'estremità affilata delle forbici di dissezione.
Inserire un ago ipodermico smussato calibro 18 attraverso il foro. Con l'ago spinto sul fondo della superficie interna dell'uovo e il lato smussato dell'ago rivolto verso l'estremità appuntita dell'uovo, rimuovere da due a tre millilitri di albumina dall'uovo di gallina e scartare. Pulire la superficie del guscio d'uovo che circonda il foro con salviette prive di lanugine, leggermente inumidite con etanolo al 70% e asciugare.
Sigillare il foro fatto per rimuovere l'albumina con nastro trasparente. Con l'estremità affilata delle forbici di dissezione, fai un secondo foro nella parte superiore del guscio d'uovo. Assicurarsi che le forbici non si estendano troppo lontano nel guscio d'uovo per evitare di entrare in contatto e danneggiare l'embrione o la vascolarizzazione embrionale posizionata direttamente sotto il lato del secondo foro.
Usando una pinza curva, allarga il foro della finestra per estendersi di circa due o tre centimetri di diametro per rivelare e accedere all'embrione in via di sviluppo sotto il guscio. Ora, inserisci un'estremità della pinza nel foro, mantenendola parallela e strettamente giustapposta al guscio d'uovo. Con l'altra estremità della pinza posizionata all'esterno del guscio d'uovo, pizzicare con cura le due estremità della pinza insieme, permettendo loro di rompere e rimuovere piccoli pezzi del guscio d'uovo.
Continua a rompere e rimuovere i frammenti di guscio d'uovo fino a quando non rimane una finestra di due o tre centimetri che si sovrappone direttamente all'embrione. Per limitare la contaminazione batterica, aggiungere da 100 a 200 microlitri di soluzione di suoneria contenente 50 unità per millilitro di penicillina e 50 microgrammi per millilitro di streptomicina attraverso il foro della finestra. Sigillare il foro della finestra con nastro adesivo trasparente.
Eseguire questa sigillatura dell'uovo allineando un angolo del nastro sull'asse lungo del foro e premendo il nastro sul guscio da uno a due centimetri di distanza dal bordo del foro. Continuare a sigillare intorno all'apertura fino a quando un lembo di nastro adesivo appeso viene lasciato su un lato. Premere i due pezzi di nastro insieme, creando una forma a cupola sopra il foro e premere il lembo di nastro sporgente sul guscio per finire di sigillare l'uovo.
Restituire le uova finestrate all'incubatrice per un ulteriore sviluppo. Assicurarsi di mantenere queste uova orizzontali e spegnere la funzione di oscillazione degli incubatori. Utilizzare un microscopio di dissezione per garantire che l'embrione sia nella fase di sviluppo corretta e individuare le posizioni della membrana amniocoronica e della membrana corioallantoica.
Quindi utilizzare forbici da microsezione sterilizzate per tagliare un foro nella membrana amniocorionica direttamente sopra l'arto anteriore che si estende dalla membrana, sovrastante l'arto anteriore alla membrana sovrastante la testa. Utilizzare due paia di pinze sterili fini e afferrare delicatamente l'amnione in due posizioni adiacenti tra la membrana amniocoronica ACM e la membrana corioallantoica. Muovi con attenzione ogni coppia di pinze, entrambe afferrando saldamente la membrana amniotica, lontano l'una dall'altra con una coppia che si muove dorsalmente verso l'embrione e l'altra ventralmente.
Utilizzare pinze sottili sterilizzate per sezionare e rimuovere qualsiasi membrana di amnione rimanente che copre l'embrione. Usando una pinza sterilizzata, afferrare l'amnione vicino alla regione cranica media dell'embrione e tirare con attenzione l'amnione in una direzione di coccole rispetto all'embrione verso la membrana corioallantoica spostata in precedenza. Risigillare il foro della finestra usando del nastro trasparente come descritto nel manoscritto e restituire l'uovo all'incubatrice per un ulteriore sviluppo.
Potrebbe essere necessario riposizionare le membrane embrionali extra per garantire che l'occhio destro sia accessibile. Se l'occhio destro non è accessibile per la ferita a causa della posizione dell'embrione nell'uovo, può servire come controllo non ferito. Utilizzare un micro coltello da dissezione per fare un'incisione che si estende sull'estensione della cornea dell'occhio destro che è parallela e in linea con il tessuto coroideo.
Usa il micro coltello da dissezione per lacerare di nuovo la cornea nello stesso punto della prima incisione, due volte di più in modo tale che il taglio due e il taglio tre che si verificano insieme alla stessa posizione nella cornea come taglia uno. Per aiutare con la vitalità, utilizzare la pinza dell'iride curva per infilare l'embrione sotto la membrana corioallantoica dopo l'intervento chirurgico per promuovere la corretta crescita della membrana corioallantoica. Quindi, aggiungere da tre a quattro gocce di soluzione di suoneria contenente antibiotici per idratare l'embrione e sterilizzare l'uovo.
Risigillare il foro della finestra con nastro trasparente e tornare all'incubatrice, lasciando l'uovo orizzontale. Permettere all'embrione di svilupparsi e alla ferita corneale di guarire per il periodo desiderato. Dopo l'incubazione, eutanasizzare l'embrione e utilizzare una pinza dell'iride curva per raccogliere l'occhio in una capsula di Petri della soluzione salina di Ringer afferrando delicatamente l'occhio sul lato posteriore dove l'occhio e il tessuto facciale si incontrano e sollevando con cura l'intero occhio lontano e libero dal tessuto facciale.
Usa una pinza fine per praticare un piccolo foro da tre a cinque centimetri nella parte posteriore di tutto l'occhio e fissa l'intero occhio nel 4% di paraformaldeide a quattro gradi Celsius durante la notte con una leggera agitazione. Per ottenere una ferita ideale, è fondamentale utilizzare un coltello da micro dissezione affilato e applicare la giusta quantità di pressione durante la lacerazione. L'applicazione di una pressione troppo bassa si tradurrà in una ferita superficiale che strappa l'epitelio corneale senza penetrare sufficientemente nello stroma anteriore.
L'applicazione di troppa pressione si traduce in una ferita a piena estensione che penetra nell'intero stroma ed espone l'umore acqueo all'ambiente esterno. L'esecuzione delle corrette incisioni laceranti produce una ferita ideale che inizialmente si allarga da zero a tre giorni dopo la ferita. Successivamente, si verifica la riepitelizzazione e la formazione di nuovi tessuti per chiudere definitivamente la ferita in modo privo di cicatrici entro 11 giorni, dopo la ferita.
La localizzazione spaziotemporale delle proteine della matrice extracellulare, della fibronectina e della tenascina all'interno della ferita di guarigione è risultata elevata nei punti temporali corrispondenti alla riepitelizzazione corneale, suggerendo il loro coinvolgimento nella chiusura della ferita, nella migrazione delle cellule epiteliali e nella sopravvivenza. L'immunoistochimica a monte intero ha rivelato che i nervi che giustapponevano direttamente la cornea centrale ferita sono temporaneamente inibiti dal tessuto corneale di guarigione. Nonostante la precedente inibizione, i nervi corneali alla fine innervano il tessuto corneale completamente guarito 11 giorni dopo la ferita a livelli di densità simili e in modelli simili allo stadio abbinato controlli non feriti embrionale giorno 18.
Come evidenziato dall'imaging armonico di seconda generazione, fasci di fibre di collagene attraverso varie profondità della ferita corneale centrale sono visti disposti ortogonalmente, corrispondenti alla macro struttura nativa del tessuto corneale centrale non ferito. Se combinato con i classici approcci di biologia dello sviluppo, come l'innesto di tessuto e l'impianto di perline, così come gli approcci moderni per la manipolazione genica come l'infezione retrovirale e l'elettroporazione del DNA, questo modello animale promette di rivelare fattori molecolari e meccanismi cellulari necessari per promuovere la guarigione delle ferite corneali senza cicatrici. Determinare i fattori molecolari chiave nelle proteine della matrice che regolano la guarigione delle ferite senza cicatrici fetali aprirà la strada a terapie che promuovono un processo di guarigione più ristoratore con meno cicatrici e una migliore ricapitolazione della normale architettura tissutale.
