Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della microbiologia su quanto spesso il DNA plasmide può essere diffuso tra diversi batteri. Il vantaggio principale di questa tecnica è che riducendo lo sfondo, possiamo rilevare piccole differenze nella frequenza di coniugazione con un'alta risoluzione. A dimostrare la procedura sarà Kosuke Yanagiya, uno studente laureato del mio laboratorio.
Per calcolare la frequenza di coniugazione in base al numero più probabile, filtrare l'accoppiamento di un millilitro da una coltura del donatore durante la notte con un millilitro da una coltura ricevente durante la notte per 45 minuti a 30 gradi Celsius, come appena dimostrato. Mentre la co-coltura sta incubando, diluire serialmente le colture originali del donatore e del ricevente per placcare in triplice copia sul brodo di Luria donatore, o LB, più kanamicina, o lB ricevente più piastre di gentamicina per una coltura di due giorni a 30 gradi Celsius. Al termine dell'incubazione, resuspendare la coltura sul filtro in LB sterile contenente kanamicina e gentamicina per la diluizione seriale in una piastra di coltura cellulare a 96 po 'in quadruplicata.
Dopo due giorni a 30 gradi Celsius, contare manualmente le unità che formano la colonia, o CNO, sulle placche di agar donatrici e riceventi e il numero di pozzi in cui i transconjuganti crescono per microscopia leggera. Per calcolare il numero più probabile e la sua deviazione, aprire il programma di calcolo MPN. Immettere il nome e la data dell'esperimento, il numero della serie di test e il numero massimo di diluizioni nella riga sette del foglio di programma del file del foglio di calcolo.
Nelle tabelle dei dati di input prodotte automaticamente immettere la formula nella colonna fattore di diluizione D, 0,01 nel volume in millilitri o colonna GW e quattro nel numero di tubi colonna N. Immettere il numero di pozzi in cui i transcongiunti sono cresciuti ad ogni diluizione del campione e fare clic su calcola i risultati per ottenere i risultati come numero più probabile per millilitro e i limiti di confidenza superiore e inferiore del 95%. Quindi dividere il numero di transconiut per il numero di unità di formazione di colonie donatrici e riceventi per millilitro per calcolare la frequenza di coniugazione dei plasmidi.
In questo esperimento rappresentativo, la frequenza di coniugazione di entrambi i plasmidi è aumentata a tassi di agitazione più elevati con una differenza massima di frequenza di coniugazione osservata tra zero e 400 RPM per le colture introdotte nel pBP136:gfp plasmide e tra zero e 200 RPM per le colture che sono state introdotte nel pCAR1:gfp plasmide. Per determinare la densità delle cellule riceventi necessarie per confrontare la probabilità di coniugazione, sono stati eseguiti test di accoppiamento con diverse densità di donatori e riceventi. In questo esperimento rappresentativo, i transcongiunti pBP136:gfp sono stati rilevati nel 100% dei pozzi contenenti uno per 10 al terzo CFU del donatore e uno per 10 al quinto a uno per 10 al settimo CFU del ricevente, e quelli con uno per 10 alla seconda CFU del donatore e uno per 10 al sesto-10 al settimo CFU del ricevente , indicando che la densità cellulare era troppo alta.
I test di accoppiamento con 10 CFU di donatore e da 10 al sesto o 10 al quinto CFU del ricevente, tuttavia, hanno portato a una diminuzione del numero di pozzi positivi transcongiunti. Pertanto, si prevedeva che 10-quinta CFU del ricevente fosse necessaria per l'accoppiamento con una singola cellula donatrice. I test di accoppiamento con pCAR1:gfp a diverse densità di ceppi donatori e riceventi hanno dimostrato risultati simili, sebbene nel complesso le percentuali di pozzi positivi transcongiunti fossero molto inferiori a quelle di pBP136:gfp.
Supponendo che le cellule donatrici e ricevente possano attaccarsi l'una all'altra in modo simile, la probabilità di iniziazione coniugazione per il donatore di pCAR1 è stata inferiore a quella del donatore pBP136. Sulla base di questi risultati, è stato stimato che 10-settima CFU del ricevente era richiesta per una singola cellula donatrice ordinata per FACS. Dopo aver contato il numero di pozzi positivi transcongiunti, la percentuale di pozzi positivi transcongiunti per pBP136:gfp è stata determinata essere maggiore di quella per pCAR1:gfp, dimostrando una differenza di oltre 36 volte nella probabilità di coniugazione iniziata dal donatore tra questi due plasmidi.
Durante il tentativo della procedura, è importante ricordare di diluire sempre attentamente le miscele batteriche.
