细菌结合频率的高分辨率比较

这种方法可以帮助回答微生物学领域关于质粒DNA在不同细菌之间传播率的关键问题。该技术的主要优点是，通过减少背景，我们可以检测出高分辨率的结合频率的小差异。演示这个程序的将是我实验室的研究生科苏克·亚纳吉亚。

要按最可能的数字计算结合频率，请从隔夜供体培养体中过滤一毫升，从隔夜接受者培养体中过滤一毫升，在30摄氏度下进行45分钟，刚才演示。当共同培养孵育时，连续稀释原始捐赠者和接受者培养物，将三分之一电镀到捐赠者 Luria 肉汤（LB），加上卡那霉素，或接受者 LB，再稀释 30 摄氏度的两天培养物。在孵育结束时，在含有卡那霉素和根霉素的无菌LB中重新在过滤器上重新暂停培养物，在四甲酸的96井细胞培养板中连续稀释。

在30摄氏度下两天后，手动计算供体和接受者琼脂板上的菌落形成单位（CFU）以及转体通过光显微镜生长的孔数。要计算最可能的数字及其偏差，请打开 MPN 计算程序。在电子表格文件的程序表第 7 行中输入实验的名称和日期、测试系列的数量以及稀释的最大数量。

在自动生产的输入数据表中，在稀释因子 D 列中输入公式，在体积中输入 0.01（以毫升或 GW 列为单位）和在管 N 列数中输入 4 个公式。输入每个样品稀释时转射剂生长的孔数，然后单击计算结果，以获得最佳毫升最可能数，以及上下 95% 置信极限。然后将转联剂的数量除以每毫升组成单位的供体和接受群体的数量，以计算质粒的结合频率。

在这个具有代表性的实验中，两个质粒的结合频率以较高的搅拌速率增加，对于引入 pBP136:gfp 质粒的培养物，在零和 400 RPM 之间观察到的最大结合频率差异，在引入 pCAR1:gfp 质粒的培养物的 0 到 200 RPM 之间。为了确定比较结合概率所需的受助细胞的密度，对不同的供体和接受者密度进行了交配测定。在这个代表性实验中，pBP136:gfp转性剂在100%的井中检测到含有1倍10至第三CFU的捐赠物，1次10至10至10至第七个接受者的CFU，以及1倍10至第二个CFU的接受者的10倍至第六至第七CFU的井中。，表示细胞密度过高。

然而，与10个供体CFU和10至第六至第五个CFU的接受者进行交配测定，导致转义阳性井数量减少。因此，预计与单个供体细胞交配需要10至第5个接受者CFU。在供体和受助菌株的不同密度下与 pCAR1:gfp 进行交配测定，结果相似，尽管总体而言，转致阳性井的百分比远远低于 pBP136:gfp。

假设供体和接受者细胞可以同样相互依附，pCAR1捐赠者的结合启动概率低于pBP136捐赠者的连体启动概率。根据这些结果，估计按国际社区会议分类的单一捐赠细胞需要10至第7个接受者CFU。在计算了转振正井的数量后，pBP136:gfp的转结正井的百分比被确定为大于pCAR1:gfp，表明捐赠者启动这两个质粒之间结合的概率差异超过36倍。

在尝试该程序时，重要的是要记住始终仔细稀释细菌混合物。