Ringraziamo sinceramente Dr. Mustafa Khokha, Università di Yale, per fornire l'uso delle sue risorse di laboratorio. Siamo grati a Mr. Wu Ming-Jie per l'eccellente assistenza tecnica. EF è un investigatore HHMI. Questo lavoro è stato supportato da un dono dal John Monsky e fondo per la ricerca di Jennifer Weis Monsky malattia di Lyme.

1. preparazione di modelli del DNA
<ol><li>Scarica la sequenza del rRNA 16S specifica ad ogni generi batterica dal NCBI database e progettazione catena della polimerasi (PCR) compatibile avanti e reverse primer che amplificheranno generi specifiche regioni (~ 200-250 base-accoppiamenti lungo) come descritto in precedenza 19. riferirsi alle risorse open source database SILVA20,21 e probeBase22 online per sonde del oligonucleotide rRNA-mirati e primer, come le sonde del RNA per alcuni generi batterici possono essere commercialmente disponibili. Nota: È importante selezionare regioni del gene che sono specifici per specifici generi e garantire che gli iniettori progettati non amplificare generi correlati batterici. Questo è fondamentale per ottenere l'ibridazione sonda gene/generi-specific.</li>
	<li>Mangime, zecche per 24, 48 o 72 h sui topi, sezionare budella tick e preparare il RNA e cDNA da budella di graduazione come descritto precedente23. CDNA di uso come modello per PCR amplificano ampliconi di generi specifici utilizzando un termociclatore. Eseguire un'aliquota del PCR-prodotto/amplicon su gel di agarosio 1.5% e confermare che l'amplicone corrisponde al formato previsto da visualizzazione sotto la luce ultravioletta (UV) usando un gel del sistema di imaging.</li>
	<li>Clonare l'amplicone di RNA ribosomiale batterica 16S di interesse in un vettore di TA commercialmente disponibile (Tabella materiali) contenenti promotori RNA polimerasi adatti a polimerasi del batteriofago (SP6, T7 o T3). Sequenza i cloni per confermare l'identità del amplicon e la direzionalità del clone con riferimento a ciascuno dei promotori. Su questa base, determinare il promotore di scelta per generare senso o RNA antisenso sonde (Figura 1).</li>
	<li>Linearizzare 1 mg del plasmide con un enzima di restrizione appropriato in un volume di reazione di fino a 30 µLfor 2 ore a temperature consigliate dal produttore. Scegliere gli enzimi di restrizione basati sul promotore che sarà utilizzato per generare il senso o la sonda antisenso (Figura 1). Verificare linearizzazione di visualizzazione di 2 µ l di reazione digest su gel di agarosio 1%.</li>
	<li>Purificare i restanti 28 µ l di DNA digerito utilizzando un kit di purificazione di PCR prodotto colonna disponibile in commercio e quantificare la concentrazione di DNA mediante lo spettrofotometro. Nota: Alcune sonde di senso possono causare una colorazione di fondo molto superiore la sonda antisenso corrispondente e potrebbero essere necessario essere esplorato altre opzioni. Controlli negativi alternativi includono plasmidi codifica di sequenze non rappresentati nel campione ovvero un'altra sonda che produce un modello distintivo di ibridazione.</li>
</ol>2. costruzione di sonde del RNA Digoxygenin-UTP
<ol><li>Preparare la miscela del nucleotide combinando 7,5 µ l di 100 mM UTP, 25 µ l di 10 mM digoxygenin-UTP e 10 μl di 100mm ATP e GTP CTP in una provetta da centrifuga da 1,5 mL.</li>
	<li>Eseguire la trascrizione in vitro utilizzando kit di polimerasi T7 o Sp6 RNA commercialmente disponibili, con 1 µ l della miscela del nucleotide (punto 2.1) e 0,25 - 1 µ g di DNA del modello. Portare il volume fino a 20 µ l con acqua. Scorri il tubo per combinare e impulsi spin. Incubare a 37 ° C per 2,5-3 ore. Nota: La sonda costruzione ha avuto successo con plasmide digerito concentrazioni basse quanto 7 ng / µ l, ma le concentrazioni tipiche in questa fascia di passaggio da 15-25 ng / µ l. La reazione di trascrizione può essere incubata anche durante la notte a 37 ° C, ma questo non aumenta significativamente il rendimento di RNA.</li>
	<li>Aggiungere 1 µ l di dnasi (2.000 unità / µ l) e incubare a 37 ° C per 10 min. Non superare i 10 minuti, o l'enzima può iniziare a degradare il RNA.</li>
	<li>Aggiungere 30 µ l di cloruro di litio ghiacciata 7,5-8 M e 30 µ l di acqua refrigerata senza nucleasi a precipitare il RNA. Scorri il tubo per mescolare. Consentire la precipitazione di RNA di procedere durante la notte a-20 ° C.</li>
	<li>Raccogliere RNA mediante centrifugazione a 17.000 x g per 20 min a 4 ° C. Lavare la pallina una volta con 1 mL di etanolo di 75% preparata in dietil pirocarbonato (DEPC) acqua, quindi ripetere la centrifugazione.</li>
	<li>Rimuovere e scartare il surnatante, capovolgere la provetta su una salvietta di carta pulita e lasciare per asciugare per 10 min. Risospendere il pellet in acqua priva di nucleasi. Se la pallina è facilmente visibile, risospendere in 25 µ l. Se il pellet è molto piccolo o non visibile, risospendere in 15-20 µ l. ottenere una stima della concentrazione di RNA mediante lo spettrofotometro. Note: Intervallo di concentrazioni di RNA tipiche da 200-500 ng / µ l.</li>
</ol>3. visualizzazione di RNA sonde tramite l'elettroforesi del Gel di formaldeide di RNA per valutare la purezza di RNA
Attenzione: Formaldeide pone un pericolo di inalazione; di conseguenza, generare le soluzioni necessarie per l'analisi di gel di RNA in una cappa aspirante. Il bromuro di etidio è un sospetto cancerogeno; maneggiare con cura.
<ol><li>Preparare un gel di agarosio 1% formaldeide come precedentemente descritto24 e ghisa il gel in una scatola di gel libera delle RNasi. Una volta fredda, riempire la vaschetta del gel con 1x tampone (1 x MOPS a pH 7,0, 5% formaldeide) di corsa.</li>
	<li>Preparare il tampone del campione (bromuro di etidio 400 mg/mL 5 µ l, 20 µ l 10 x MOPS, 35 formaldeide µ l e 100 µ l formammide). Combinare 2 µ l di sonda RNA (passo 2.6) con 8 µ l di Sample Buffer. Incubare a 70 ° C per 10 min.</li>
	<li>Preparare Buffer di caricamento del RNA dalla combinazione di glicerolo al 50% 5ml, formaldeide al 10% 1 mL, blu di bromofenolo 40 mg, 40 mg xilene cianolo e 20 µ l di EDTA 0.5 M (pH 7.5). Dopo l'uso, conservare questo buffer a-20 ° C.</li>
	<li>Aggiungere 3 µ l di tampone di caricamento per il campione di RNA da passo 3.2 e mescolare. Mantenere le provette dei campioni su ghiaccio.</li>
	<li>Caricare il volume del campione intero dal passo 3.4 nel gel. Caricare un'aliquota della scaletta di RNA singolo-incagliato a fianco per verificare la dimensione del RNA. Esegua il gel a 100 V o inferiore fino a quando il colorante blu migra circa il 75% di strada lungo il gel. Visualizzare il RNA sotto luce UV utilizza un sistema di imaging del gel. Nota: Una sonda del RNA di buona qualità dovrebbe apparire come una fascia discreta con una mobilità corrispondente alla dimensione prevista della sonda (Figura 2, corsia 1). Se la sonda viene visualizzato come una banda diffusa e untuosa (Figura 2lane 2) questo non dovrebbe essere usato.</li>
</ol>4. spuntare Gut accumulazione e fissazione
<ol><li>Raccogliere Ixodes scapularis ninfe che sono alimentati sui topi per i punti di tempo di interesse. Nota: Ai fini di questa tecnica, le zecche alimentati per 48 o 72 h lavoro meglio.</li>
	<li>Sezionare l'intestino dal segno di spunta in MEMFA (tabella 1) su un vetrino con un microscopio di dissezione, evitando di danneggiare l'organo per quanto possibile. Inserire un segno di spunta su un vetrino pulito in 20-30 µ l di MEMFA. Usando un paio di sterile alto tenore di carbonio acciaio rasoio lama #11 fetta regione capa a scuto della zecca lasciando il corpo della zecca. Premere delicatamente il corpo per spingere i diverticoli dell'intestino e delle ghiandole salivari fuori la cuticola del corpo. Separare le ghiandole salivari e nell'intestino e scoop il coraggio della lama di rasoio.</li>
	<li>Raccogliere le budella in una provetta da 1,5 mL contenente 500 µ l MEMFA. Incubare la provetta a temperatura ambiente con dolce dondolo per 1 h o durante la notte a 4 ° C. Nota: Ghiandole salivari Tick anche sezionate e similmente determinazione e possono essere macchiate.</li>
	<li>Disidratare il tessuto lavando delicatamente 3 volte con 1 mL di etanolo al 100% ghiacciata. Lasciate che le budella affondare naturalmente verso il basso del tubo tra ogni lavaggio, centrifugazione potrebbe danneggiare il tessuto. Per l'archiviazione a lungo termine, mantenere i campioni in etanolo al 100% a-20 ° C.</li>
</ol>5. costruzione di maglia campione cesti e Portacesto 24 pozzetti
<ol><li>Tagliare i fondi al largo di 2 mL o 5 mL provette da centrifuga snap-top utilizzando una lama di rasoio taglio singolo riscaldata su un bisturi. Attenzione: La lama potrebbe essere necessario essere riscaldato più volte prima che venga completato il taglio.</li>
	<li>Tagliare quadrati di una maglia di nylon 110 µm leggermente più grande apertura del nuovo. Bond la maglia alla parte inferiore del tubo premendo loro insieme leggermente su un piatto caldo su fuoco medio-basso finché non viene effettuata una buona tenuta. Lasciate raffreddare, assicurarsi che non ci siano lacune tra la maglia e il tubo e tagliare l'eccesso rete intorno ai bordi.</li>
	<li>Tagliare fori presenti sul coperchio di una piastra a 24 pozzetti, tale che il labbro del cestello campione fatto nel passo 5.2 siederà al foro e non cadere attraverso, producendo un set-up dove le parti inferiori dei cestelli campione siederà tutto nei pozzetti quando essi sono posti nella fori nella copertura.</li>
	<li>Utilizzare questo supporto cesto montato per trasferire cestini da un piatto a altro con relativa facilità per l'intero il protocollo di ibridazione in situ . Utilizzare due piastre da 24 pozzetti in modo che mentre si sta verificando una incubazione, l'altra piastra è pronta per il lavaggio successivo.</li>
</ol>6. ibridazione in Situ : giorno 1 (Timing: 4-5 h)
<ol><li>Coraggio di trasferimento di etichettato cesti di campione, separati da condizione sperimentale e inteso sonda del RNA. Nota: Macchia almeno 5 budella a condizione per influenzare la variazione naturale tra repliche.</li>
	<li>Reidratare i campioni delicatamente per evitare di introdurre bolle d'aria nel tessuto aumentando gradualmente il rapporto di tampone fosfato salino con 0,1% tensioattivi non ionici (PTw; Tabella 1) di etanolo nei lavaggi. Nota: Completare tutti i lavaggi nel supporto cesto 24 pozzetti a temperatura ambiente con agitazione delicata se non specificato diversamente. Aliquota di 500-600 µ l di soluzioni di lavaggio in ogni pozzetto del titolare tali che il coraggio in ogni cestino è completamente sommerse. Preparare tutte le soluzioni con acqua trattata con DEPC per evitare la degradazione del RNA.<ol>
<li>Lavare i campioni per 5 min in etanolo al 100% 500 µ l.</li>
		<li>Preparare almeno 500 µ l per cesto campione del 75%, 50% e 25% di etanolo in PTw. reidratare i campioni di lavaggio per 5 min in ogni soluzione di etanolo, lo spostamento dalla più alta concentrazione di etanolo al più basso.</li>
		<li>Lavare i campioni 4 volte per 5 minuti ciascuno in PTw.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Permeabilize i campioni con proteinasi K (10 µ g/mL) in PTw per 5 min.</li>
	<li>Preparare il tessuto per l'ibridazione con le sonde del RNA.<ol>
<li>Lavare i campioni due volte come descritto al punto 6.2 nel supporto cesto 24 pozzetti a temperatura ambiente con agitazione delicata per 5 minuti ciascuno, in 500 µ l di tampone di trietanolammina (0,1 M, pH 7,0-8,0) (tabella 1) per mantenere i campioni in un ambiente privo di ammine.</li>
		<li>Trattare i campioni due volte con 500 µ l 0,25% l'anidride acetica nel buffer di trietanolammina (0,1 M, pH 7,0-8,0) per 5 minuti ciascuno, quindi lavare i campioni due volte in PTw per 5 minuti ciascuno. Nota: L'anidride acetica acetila gratis ammine per neutralizzare la carica positiva, che è fondamentale per evitare interazioni elettrostatiche non specifici e garantire l'associazione specifica della sonda e mRNA.</li>
		<li>Difficoltà le budella per 20 min con paraformaldeide al 4% a 500 µ l di PTw, quindi lavare 5 volte in PTw per 5 minuti ciascuno.</li>
		<li>Prehybridize incubando i campioni in 500 µ l ibridazione buffer /in titolare del cestino 24 pozzetti della piastra ben 24 (tabella 1) per 1,5-2,5 ore a 60 ° C con agitazione delicata in un bagnomaria con agitazione. Salvare il tampone di ibridazione utilizzato per il passaggio di prehybridization per riutilizzare nel giorno 2 protocollo (punto 7.1).</li>
		<li>Preparare soluzioni di ibridazione sonda diluendo le sonde del RNA in tampone di ibridazione ad una concentrazione finale di 1 µ g/mL.  Incubare i campioni con soluzioni di ibridazione sonda nel supporto cesto 24 pozzetti a 60 ° C con agitazione delicata durante la notte in un bagnomaria con agitazione (tabella 2). Coprire la piastra che trasportano il cestello porta comodamente con carta stagnola per evitare l'evaporazione della soluzione di ibridazione.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. ibridazione in Situ : giorno 2 (Timing: 4.5-5.5 h)
<ol><li>Rimuovere i campioni dalle soluzioni di ibridazione della sonda e inserirli nel tampone di ibridazione riservati dal giorno precedente. Incubare a 60 ° C con agitazione delicata per 3 min. Nota: Sonda di ibridazione soluzioni possono essere conservati a-20 ° C per il riutilizzo fino a 3 volte.</li>
	<li>Preparare 2 x tampone salino-sodio citrato (SSC) diluendo 20 x SSC in acqua trattata con DEPC (tabella 1). Lavare i campioni due volte per 3 min con 2 x SSC, poi 3 volte per 20 min con 2 x SSC a 60 ° C per rimuovere tutte le tracce della sonda e tampone di ibridizzazione.</li>
	<li>Trattamento con RNasi A (20 µ g/mL) e RNasi T1 (10 µ g/mL) in 2X SSC per 30 min a 37 ° C per rimuovere singolo incagliato sonda RNA che rappresenta gratis RNA non ibridate.</li>
	<li>Lavare una volta con 2 x SSC per 10 min a temperatura ambiente. Preparare 0.2 x SSC di diluizione 2 x SSC in acqua trattata con DEPC, poi lavare due volte con 0,2 x SSC per 30 min a 60 ° C per rimuovere l'eccesso RNasi.</li>
	<li>Lavare due volte con 500 µ l di tampone di acido maleico (MAB; Tabella 1) per 10 min.</li>
	<li>Incubare i campioni con soluzione (2% di Reagente Bloccante in MAB) per 1,5-2 h di blocco. Nota: Il reagente bloccante può essere difficile da sciogliere; riscaldamento delicato aiuta la dissoluzione.</li>
	<li>Sostituire la soluzione bloccante con anti-digossigenina alcalino fosfatasi-coniugata 500 µ l di anticorpo ad una diluizione di 1:3,000 nella soluzione di blocco e incubare a temperatura ambiente per circa 4 h o a 4 ° C durante la notte.</li>
</ol>8. ibridazione in Situ : giorno 3 (Timing: 6 h a tutta la notte)
<ol><li>Lavare i campioni almeno 5 volte per 30 minuti ciascuno, con 500 µ l MAB per rimuovere l'anticorpo in eccesso. Nota: Questi lavaggi sono flessibili e possono essere prorogate per 1-2 h, o 3-4 lavaggi possono essere sostituiti per un lavaggio overnight a 4 ° C con un impatto minimo sull'efficacia.</li>
	<li>Lavare due volte per 5 min con tampone di fosfatasi alcalina pH 9.5 (buffer di AP; Tabella 1).</li>
	<li>Iniziare la reazione di colore, sostituendo l'ultimo lavaggio con 500 µ l di substrato cromogenico per la fosfatasi alcalina (Tabella materiali). Coprire la piastra campione con carta stagnola e lasciare che la macchiatura procedere a temperatura ambiente per 3 - 5 h o overnight a 4 ° C. Monitorare la reazione di macchiatura periodicamente esaminando il tessuto al microscopio per dissezione per evitare overstaining. Nota: Quando la colorazione è completa, una tinta viola è rilevabile dall'occhio nei campioni antisenso-sondato al microscopio, ma il tessuto non dovrebbe essere consentito di diventare molto scuro. La macchiatura procede molto lentamente a 4 ° C e può richiedere fino a 20-24 h.</li>
	<li>Arrestare la reazione al colore di lavaggio per 5 min in 500 µ l MAB, quindi fissare il tessuto durante la notte nella soluzione di Bouin. Attenzione: Maneggiare soluzione di Bouin in una cappa; è un agente cancerogeno corrosivo.</li>
</ol>9. ibridazione in Situ : giorno 4 (Timing: 3-3.5 h)
<ol><li>Preparare almeno 7 mL per cesto di campione di 1 x SSC di diluire 20 x SSC in acqua trattata con DEPC. Rimuovere la soluzione di Bouin lavando i campioni 4 a 6 volte con etanolo al 70% in 1 x SSC fino a quando il tessuto non è più giallo.</li>
	<li>Preparare 500 µ l per cesto di campione di 75%, 50% e 25% soluzioni di etanolo in 1 x SSC. Lavare i campioni per 5 min in ogni soluzione, dalla più alta concentrazione di etanolo in movimento al più basso per reidratare il tessuto. Lavare due volte per 5 min ogni 1 in x SSC.</li>
	<li>Incubare i campioni della soluzione di candeggina (tabella 1) per 90 min su una lightbox in una cappa aspirante. Nota: Questo passaggio consente qualsiasi pigmentazione nei campioni o la colorazione da Bouins la soluzione per essere rimosso e migliora il segnale di sonda per visualizzazione libera.</li>
	<li>Lavare i campioni due volte con 500 µ l di 1 x SSC per 5 min.</li>
	<li>Riposizionare le budella con minimo danno capovolgendo il cestello di campione in un pozzetto di una piastra a 24 pozzetti nuovo e lavare con etanolo al 70% attraverso il fondo di rete usando una pipetta di trasferimento. Conservare a-20 ° C se necessario.</li>
	<li>Per ottenere una panoramica dei modelli di macchiatura di campioni multipli, come illustrato nella Figura 3, mantenere il fegato in etanolo al 70% in 24-piastra e Mostra con qualsiasi microscopio a campo chiaro. Per esaminare i singoli budella con un microscopio a campo chiaro come mostrato in Figura 4, Figura 5, e nella figura 6, montare le budella in 100% glicerolo sotto vetrini coprioggetti. Utilizzare una spatola di plastica per manipolare delicatamente il tessuto con il minimo danno. Nota: L'elevata viscosità del glicerolo aiuta a proteggere i tessuti da danni da compressione e permette il posizionamento accurato dei diverticoli tale che il tessuto può essere visionato in modo ottimale a ingrandimenti superiori.</li>
	<li>Catturare immagini il microscopio usando software di acquisizione di immagini specifiche di microscopio (Tabella materiali) ed esportare come immagini Tiff a una generica immagine software di editing. Per quantificare le differenze relative di colorazione tra trattamenti sperimentali, scaricare un software di analisi di immagine generica (Tabella materiali). Aprire l'immagine all'interno del software di analisi e utilizzare le istruzioni all'interno del software per misurare pixel intensità della colorazione e calcolare trame istogramma della colorazione.</li>
</ol>

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K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+and+probes+for+the+study+of+Xenopus+tropicalis+development.">Techniques and probes for the study of Xenopus tropicalis development.</a> Developmental Dynamics. 225 (4), 499-510 (2002).</li><li>Jowett, T., Lettice, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-mount+in+situ+hybridizations+on+zebrafish+embryos+using+a+mixture+of+digoxigenin-+and+fluorescein-labelled+probes.">Whole-mount in situ hybridizations on zebrafish embryos using a mixture of digoxigenin- and fluorescein-labelled probes.</a> Trends in Genetics. 10 (3), 73-74 (1994).</li><li>Behnam, F., Vilcinskas, A., Wagner, M., Stoecker, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+straightforward+DOPE+(double+labeling+of+oligonucleotide+probes)-FISH+(fluorescence+in+situ+hybridization)+method+for+simultaneous+multicolor+detection+of+six+microbial+populations.">A straightforward DOPE (double labeling of oligonucleotide probes)-FISH (fluorescence in situ hybridization) method for simultaneous multicolor detection of six microbial populations.</a> Applied Environmental Microbiology. 78 (15), 5138-5142 (2012).</li><li>Pai, V. 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Gli autori non hanno conflitti di interesse a divulgare.

Questo è il primo uso di una tecnica di ibridazione (WMISH) intero-monta in situ per studiare il microbiota di un artropodo vettore di agenti patogeni. Il nostro protocollo è stato adattato da quello utilizzato nello studio dello sviluppo in Drosophila che in rana embrioni25,26. Intero-monta RNA in situ ibridazione venga ordinariamente utilizzato per localizzare le trascrizioni del gene spazialmente e temporalmente27 e visualizzazione delle trascrizioni può essere fatto da campo chiaro o da microscopia fluorescente. Abbiamo adottato il primo verso rilevamento del microbiota in budella di segni di graduazione. È importante notare che tenta di eseguire l'intero-monta in situ ibridazione utilizzando zecche intere in cui la regione capa è stato rimosso per consentire la penetrazione delle soluzioni di fissativo e ibridazione non ebbe successo. Il protocollo descritto qui utilizza budella dissecato ed è stato implementato per studiare gli effetti delle proteine specifiche tick su colonizzazione batterica nel midgut23. Informazioni ottenute da WMISH sono paragonabile a immunohistochemistry ma ha il vantaggio di non richiedere la generazione di anticorpi al gene e della proteina o proteina di interesse. Informazioni genomiche sono sufficiente per generare i reagenti per WMISH. PESCI (ibridazione in situ di fluorescenza) e WMISH in grado di rilevare l'espressione genica. Tuttavia, a causa essendo un dosaggio enzimatico e cromogeno-based, WMISH ha il vantaggio che lo sviluppo di colore possa essere monitorato attivamente e la reazione viene consentita di procedere fino al segnale desiderato e sensibilità è raggiunto. È pienamente favorevole alla automazione ed è facilmente scalabile in formato ad alta velocità. A differenza di pesci e immunohistochemistry, nessun taglio è necessario. Lo svantaggio di WMISH sopra pesci è che solo 2 differenti mRNA o geni possono essere affrontate simultaneamente e richiederebbero che sonde essere etichettati con gli analoghi del nucleotide diverso ad esempio digoxigenin-UTP e della fluorescina-UTP28. Con il pesce, fino a 6 diversi mRNA può essere esaminato in un dosaggio29. Mentre entrambe le analisi richiedono tempo comparabile, il costo di fluorescenza coloranti sono superiore a quello di substrati cromogeni. Saggi di pesce anche richiederebbe un microscopio a fluorescenza per la visualizzazione di immagini, mentre la visualizzazione di immagini WMISH possa essere eseguite con qualsiasi microscopio chiaro.
È fondamentale che il protocollo è seguito da vicino; Tuttavia, ci sono alcuni passaggi che richiedono cure particolari. Dissezione del midgut dal segno di spunta senza danneggiare il tessuto richiede destrezza. Può essere prudente raccogliere le zecche supplementare per praticare le dissezioni e acquisire competenza. A causa dell'eterogeneità di macchiatura in diversi diverticoli di coraggio individuale (Figura 3), è importante esaminare tutti i diverticoli di ogni budello per derivare la prova conclusiva dell'abbondanza batterica. È anche importante elaborare diversi budella (almeno 5) per ogni condizione sperimentale al fine di ottenere informazioni conclusive sulla presenza, distribuzione spaziale e abbondanza di batteri specifici all'interno di diversi diverticoli. Produzione di alta qualità le sonde del RNA è anche fondamentale per colorazione tissutale efficace. È indispensabile inoltre confermare la sequenza del modello sonda nel vettore di clonazione per garantire quel antisenso e senso sonde vengono generati in modo appropriato. Una reazione di trascrizione produttiva in vitro richiede sufficiente DNA del modello; un minimo di 100 ng possono essere utilizzati, ma 0,5 - 1 µ g è raccomandato per la generazione di sonda ottimale.
L'uso di campione cesti e piastre da 24 pozzetti in questo protocollo evita la manipolazione diretta del tessuto in ogni fase di lavaggio, che minimizza il danno durante il processo di colorazione. Tuttavia, i campioni sono ancora occasionalmente perso o danneggiati; budella da zecche unfed o 24h-Federazione, in particolare, è difficili da vedere e facile da perdere durante il trasferimento dai cesti campione in un contenitore di stoccaggio a lungo termine. Ulteriori dovrebbe prestare attenzione durante la manipolazione di questi campioni. A causa di questa limitazione, abbiamo utilizzato principalmente budella h-Federazione tick 48 e 72. La presenza di grandi quantità di farine di sangue nelle budella a questi intervalli di tempo (più di 72 h) interferisce con la colorazione e la visualizzazione a causa di fondo dal pasto di sangue e presenta anche una limitazione di questa tecnica. È probabile che l'uso di sonde con etichetta fluorescente potrebbe aggirare questo problema.
L'aspetto più importante della procedura di colorazione è quello di ristabilire l'equilibrio tra macchiatura robusta e fondo basso segnale. I tempi di sviluppo di colore ideale possono variare a seconda delle condizioni sperimentali. Pertanto, si consiglia di eseguire la reazione di colore a temperatura ambiente e monitorare lo sviluppo di colore circa ogni 30 min. La reazione può anche essere impostata procedere durante la notte a 4 ° C per rallentare lo sviluppo del colore. Tuttavia, è estremamente critica per non lasciare che questa reazione procedere per lungo tempo. La reazione di macchiatura può essere difficile monitorare dall'occhio, in modo che i campioni devono essere esaminati sotto un microscopio di dissezione. Una tinta viola dovrebbe essere visibile su campioni sondati con RNA antisenso, mentre i campioni sondato con senso RNA dovrebbe mantenere colore minima. Se i campioni di RNA-sondato senso macchia brillantemente, risoluzione dei problemi deve iniziare con riducendo il tempo di incubazione con BM viola e aumentando il tempo di blocco. A volte senso sonde possono causare anomalamente elevato background rispetto alle sonde antisense; in questi casi, diverse regioni del gene potrebbero essere necessario essere considerato per la generazione di sonde del RNA. Sequenze di DNA non rappresentate in un dato campione possono essere considerate anche come modelli per generare le sonde di controllo negativo. Ad esempio, un modello di DNA che codifica una regione della proteina fluorescente verde, non rappresentata nel genoma di segni di graduazione o sua microbiome, può essere utilizzato.
Una limitazione di questa tecnica è che l'analisi è in gran parte qualitativa; Tuttavia, software di analisi di immagine (Tabella materiali) potrebbe essere utilizzato per misurare la quantità di segnale colorazione in ciascun campione. Questo permetterebbe un confronto semi-quantitativo dell'abbondanza di varie specie batteriche diverse condizioni sperimentali. Mentre questo è un protocollo che richiede tempo che prende 3-4 giorni per completare, non è faticoso; ogni giorno hands-on tempo solo è in media circa 3-5 h. Tuttavia, la capacità di elaborare molti campioni in parallelo con l'uso dei cestini di campione e titolari consente analisi di alto-rendimento. Inoltre, questo processo può essere automatizzato utilizzando gli strumenti disponibili in commercio (tabella materiali) se questo protocollo è previsto per essere un componente essenziale e di routine del laboratorio di ricerca utilizzando commercialmente disponibili piattaforme compatibili con l'automazione (Tabella materiali) ulteriormente riducono i tempi di hands-on.
Il protocollo descritto si avvale di sonde digoxygenin-etichetta che permettono la produzione di un segnale colorimetrico che può essere imaged utilizzando la microscopia a campo chiaro. Mentre abbiamo utilizzato un substrato cromogenico per rilevare il RNA ibridizzata sonde specifiche per singoli obiettivi, è anche possibile rilevare bersagli multipli simultaneamente dall'etichettatura sonde con gli analoghi del nucleotide diverso, quali digoxigenin-UTP e Fluorescina-UTP e diversi substrati cromogeni30. I campioni di tessuto possono quindi incubati con anticorpi accoppiato di fosfatasi alcalina di digossigenina e della fluorescina, con reazioni differenti cromogeniche per i due passaggi in sequenza. Questa tecnica potrebbe anche essere adattata per sonde fluorescente contrassegnate, che possono facilitare la formazione immagine ad alta risoluzione usando la microscopia confocal31 e fornire la possibilità di utilizzare sonde multiple di colori diversi in parallelo. Questa tecnica è in grado di valutare in modo specifico solo pochi microrganismi in una sola volta in un campione. Tuttavia, parecchi campioni possono essere valutati in saggi di alto-rendimento per affrontare molteplici microrganismi che possono essere rappresentati in tick microbiota.
Infine, questa tecnica non è limitata allo studio delle interazioni tra zecche e loro microbiota associato. Sonde complementari a qualsiasi gene di interesse all'interno del genoma di graduazione possono essere generati ed usati per esaminare l'abbondanza e la localizzazione dei geni specifici in tessuti differenti. Le ghiandole salivari della zecca possono essere elaborate e analizzate allo stesso modo per l'intestino. Nel complesso, questa tecnica ha ampio potenziale di adattamento agli studi sulla dinamica delle comunità microbiche all'interno di altri vettori di malattia artropodi di interesse.

Gli agenti patogeni umani e bestiame, trasmessi da artropodi vettori si trovano in tutto il mondo e rappresentano circa il 20% delle malattie infettive a livello globale1, ma efficace e sicuro vaccini contro la maggior parte di questi agenti patogeni non sono disponibili. Nostra comprensione dell'importanza del ruolo dei microrganismi commensali, simbiotici e patogeni, conosciuti collettivamente come il microbioma2, modulante e plasmare la salute di quasi tutti i metazoi3 si sta espandendo. Ora è evidente che anche Porto di artropodi vettori di agenti patogeni microbiota dell'intestino e questi microbiota vettoriale-collegata hanno dimostrato di influenzare diversi agenti patogeni vettore4,5. Il microbioma dell'artropodo è composto di eubatteri, archaea, virus e microbi eucarioti come protozoi, nematodi e funghi6. Tuttavia, il focus della ricerca predominante è stato il eubatteri dovuta, in parte, alla disponibilità di geni marcatori e banche dati di riferimento per identificare i membri batterici specifici.
Con un focus su Ixodes scapularis, tick vettoriale di agenti patogeni umani multipli compreso Borrelia burgdorferi7, l'agente eziologico della malattia di Lyme, l'ottimizzazione di una tecnica di visualizzazione microbica mirava a miglioramento della nostra comprensione del microbiota dell'intestino tick nel contesto delle interazioni di vettore-patogeno. Parecchie domande rimangono da risolvere nel campo microbiome tick. L'intestino è il sito del primo incontro esteso tra il segno di spunta e l'agente patogeno in arrivo nel contesto degli agenti patogeni orizzontalmente trasferiti; Pertanto, la comprensione del ruolo del microbiota dell'intestino vettoriale nel modulare le interazioni di vettore-patogeno rivelerà significativi approfondimenti. Le zecche hanno una modalità unica di digestione del pasto di sangue, dove l'elaborazione del pasto di sangue componenti prende posto intracellulare8. Lume dell'intestino apparentemente serve come recipiente per contenere il pasto di sangue come i feed di tick, e assimilazione e digestione nutriente derivarne durante i diversi giorni di alimentazione e continuare post replezione. Gli agenti patogeni acquisiti dal segno di spunta durante l'alimentazione Inserisci lume dell'intestino con le farine di sangue e il lume diventa così un sito primario delle interazioni tra il tick, agente patogeno e microbiota residente. Come digestione procede attraverso la replezione e zecche Ixodidae molting, intestino subisce modificazioni strutturali e funzionali9. È anche probabile che variano in concerto con il milieu di intestino cambiando la composizione e l'organizzazione spaziale dei batteri dell'intestino. Pertanto, è importante capire l'architettura di batteri residenti nell'intestino tick per comprendere appieno l'interazione di tick, agente patogeno e microbiota dell'intestino.
Tecniche molecolari per descrivere il microbiota host associato abitualmente utilizzano high throughput sequenziamento parallelo strategie10 per amplificare e sequenza DNA ribosomal 16S batterica (rDNA). Queste strategie di sequenziamento eludere la necessità di ottenere colture axeniche di batteri specifici e forniscono una descrizione approfondita di tutti i membri batterici rappresentata nel campione. Tuttavia, tali strategie sono confusi dall'incapacità di distinguere contaminazioni ambientali da residenti di bona fide . Ulteriormente, quando valutare i campioni, come le zecche, che sono di piccole dimensioni e quindi contengono DNA microbiota-specific basso cede, la probabilità di amplificazione di contaminanti ambientali è aumentato11 e risultati nell'interpretazione ambigua della microbioma composizione. Caratterizzazione funzionale in combinazione con la visualizzazione di specifici batteri vitali, pertanto, sarà fondamentale per definire e discernere il microbioma del battito temporalmente e spazialmente. Verso questo obiettivo, abbiamo approfittato dell'intero-monta RNA in situ ibridazione. Questa tecnica è usata ordinariamente per valutare il pattern di espressione genica in organi ed embrioni12,13,14 e permette l'analisi semiquantitativa dell'espressione sopra l'intero campione di interesse. Questo comportamento differisce da tecniche tradizionali in situ di ibridazione che utilizzano sezioni di tessuto e spesso richiedono un'approfondita analisi di materiale sezionato con un assembly computazionale per predire l'espressione in organi interi15. Mentre intero-monta si riferisce generalmente a interi organismi12, qui intero-monta si riferisce all'intero fegato o organi. I vantaggi di utilizzare l'intero-monta RNA in situ ibridazione approccio per valutare l'architettura del microbiota dell'intestino tick sono molteplici. L'intestino di graduazione è composto da 7 paia di diverticoli, ogni coppia variano in dimensione16. Le differenze funzionali, se qualcuno, tra questi diverticoli, non sono compresi nell'ambito della biologia di tick, tick interazioni microbiota o tick-patogeno. Manipolazioni dell'intestino che rompersi i diverticoli intestino sarebbero spostare il microbiota presente nel lume dell'intestino o quelle associate senza bloccare l'intestino e il risultato in un'interpretazione errata della localizzazione spaziale del microbiota. Fluorescenza-identificato RNA in situ ibridazione è stata utilizzata in precedenza per esaminare tick gut trascrizioni17 fissando e diverticoli intestino individuali per garantire l'ibridazione della sonda e per localizzare b. burgdorferi di apertura trascrizioni sezionando paraffina tutta zecche18. Entrambi questi approcci richiedono manipolazioni dei tessuti tick prima dell'ibridazione che interesserebbero l'architettura del microbiota intestinale.
In questo rapporto, descriviamo in dettaglio il protocollo per esaminare il battito vitale microbiota dell'intestino intero-monta in situ ibridazione (WMISH). L'uso dell'intero-monta RNA in situ ibridazione consente una comprensione globale della presenza e abbondanza di batteri dell'intestino specifici nelle diverse regioni dell'intestino e può stimolare nuove intuizioni biologia di intestino tick nel contesto della colonizzazione del patogeno e trasmissione. Ulteriormente, l'uso di sonde di RNA nei confronti di specifico RNA batterico permette la rilevazione di batteri vitali nell'intestino tick.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1079px;" width="1079">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Sefar NITEX Nylon Mesh, 110 micron</td>
			<td style="width:220px;">Amazon</td>
			<td style="width:348px;">03-110/47</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">pGEM-T Easy Vector System</td>
			<td style="width:220px;">Promega</td>
			<td style="width:348px;">A1360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Digoxygenin-11-UTP</td>
			<td style="width:220px;">Roche</td>
			<td align="right" style="width:348px;">1209256910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">dNTP</td>
			<td style="width:220px;">New England Biolabs&#160;</td>
			<td style="width:348px;">N0447S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">DNAse I(RNAse-free)</td>
			<td style="width:220px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:348px;">M0303S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">HiScribe SP6 RNA synthesis kit</td>
			<td style="width:220px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:348px;">E2070S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit</td>
			<td style="width:220px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:348px;">E2040S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Water, RNase-free, DEPC-treated</td>
			<td style="width:220px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:348px;">AB02128-00500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">EDTA, 0.5M, pH 8.0</td>
			<td style="width:220px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:348px;">AB00502-01000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Formaldehyde, 37%</td>
			<td style="width:220px;">JT Baker</td>
			<td style="width:348px;">2106-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Formamide</td>
			<td style="width:220px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:348px;">AB00600-00500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">EGTA</td>
			<td style="width:220px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:348px;">E-4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">DPBS, 10X</td>
			<td style="width:220px;">Gibco</td>
			<td style="width:348px;">14300-075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Tween-20</td>
			<td style="width:220px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:348px;">P1379-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Proteinase K</td>
			<td style="width:220px;">Sigma Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:348px;">3115879001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Triethanolamine HCl</td>
			<td style="width:220px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:348px;">T1502-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Acetic anhydride</td>
			<td style="width:220px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:348px;">320102-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:220px;">ThermoScientific/Pierce</td>
			<td align="right" style="width:348px;">28906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">SSC, 20X</td>
			<td style="width:220px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:348px;">AB13156-01000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">RNA from torula yeast</td>
			<td style="width:220px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:348px;">R3629-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Heparin, sodium salt</td>
			<td style="width:220px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:348px;">H3393-10KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Denhardt&#39;s Solution, 50X</td>
			<td style="width:220px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:348px;">D2532-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">CHAPS hydrate</td>
			<td style="width:220px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:348px;">C3023-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">RNase A</td>
			<td style="width:220px;">Sigma Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:348px;">10109142001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">RNase T1</td>
			<td style="width:220px;">ThermoScientific&#160;</td>
			<td style="width:348px;">EN0541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Maleic acid</td>
			<td style="width:220px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:348px;">M0375-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Blocking reagent</td>
			<td style="width:220px;">Sigma Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:348px;">11096176001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments</td>
			<td style="width:220px;">Sigma Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:348px;">11093274910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Levamisol hydrochloride</td>
			<td style="width:220px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:348px;">31742-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:320px;">Chromogenic substrate for alkaline phosphatase</td>
			<td style="width:220px;">Sigma Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:348px;">11442074001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Bouin&#39;s solution</td>
			<td style="width:220px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:348px;">HT10132-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Hydrogen peroxide</td>
			<td style="width:220px;">Mallinkrodt Baker, Inc</td>
			<td style="width:348px;">2186-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Single stranded RNA ladder</td>
			<td style="width:220px;">Ambion -Millenium</td>
			<td style="width:348px;">AM7151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">&#160;#11 High-Carbon steel blades&#160;</td>
			<td style="width:220px;">C and A Scientific Premiere</td>
			<td style="width:348px;">#11-9411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Thermocycler</td>
			<td style="width:220px;">BioRad, CA</td>
			<td align="right" style="width:348px;">1851148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:220px;">ThermoScientific&#160;</td>
			<td style="width:348px;">NanoDrop 2000C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Orbital shaker</td>
			<td style="width:220px;">VWR</td>
			<td style="width:348px;">DS-500E Digital Orbital shaker</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Shaking water bath</td>
			<td style="width:220px;">BELLCO Glass, Inc</td>
			<td style="width:348px;">Hot Shaker-7746-12110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Gel&#160; documentation system</td>
			<td style="width:220px;">BioRad</td>
			<td style="width:348px;">Gel Doc XR+ Gel documentation system</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Bright-field Microscope&#160;</td>
			<td style="width:220px;">Nikon</td>
			<td style="width:348px;">NikonSM2745T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Bright-field Microscope&#160;</td>
			<td style="width:220px;">Zeiss</td>
			<td style="width:348px;">AXIO Scope.A1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Dissection microscope&#160;</td>
			<td style="width:220px;">Zeiss</td>
			<td style="width:348px;">STEMI 2000-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">&#160;Light box</td>
			<td style="width:220px;">VWR</td>
			<td style="width:348px;">102097-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">PCR purification kit&#160;</td>
			<td style="width:220px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:348px;">28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Image capture software</td>
			<td style="width:220px;">Zeiss</td>
			<td style="width:348px;">Zen lite</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Image editing software&#160;</td>
			<td style="width:220px;">Adobe&#160;</td>
			<td style="width:348px;">Adobe Photoshop CS4 version 11.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Image analysis software</td>
			<td style="width:220px;">National Institutes of Health</td>
			<td>ImageJ-NIH /imagej.nih.gov/ij/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;">Automation compatible instrumentation</td>
			<td style="width:220px;">Intavis Bioanalytical Instruments, Tubingen, Germany).&#160;</td>
			<td style="width:348px;">Intavis, Biolane HT1.16v</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of microbiota in tick guts by whole-mount in situ hybridization

Malattie infettive trasmesse da artropodi vettori continuano a costituire una grave minaccia per la salute umana in tutto il mondo. Gli agenti patogeni che causano queste malattie, non esistono in isolamento quando essi colonizzano il vettore; piuttosto, essi probabilmente impegnarsi nelle interazioni con microrganismi residenti nel lume dell'intestino. Il microbiota di vettore ha dimostrato di giocare un ruolo importante nella trasmissione di patogeni per parecchie malattie trasmesse da vettori. Se i batteri residenti nell'intestino della zecca Ixodes scapularis , il vettore di agenti patogeni umani diversi tra cui burgdorferi di Borrelia, influenzano trasmissione di graduazione degli agenti patogeni non è determinato. Abbiamo bisogno di metodi per caratterizzare la composizione dei batteri associati con l'intestino di graduazione per agevolare una migliore comprensione delle interazioni potenziali interspecie nell'intestino tick. Utilizzo intero-monta in situ ibridazione di visualizzare trascrizioni del RNA associate a particolari specie batteriche consente la raccolta dei dati qualitativi per quanto riguarda l'abbondanza e la distribuzione del microbiota in tessuto intatto. Questa tecnica può essere utilizzata per esaminare le modifiche il milieu di microbiota dell'intestino nel corso del tick alimentazione e può essere applicata anche per analizzare l'espressione dei geni di segni di graduazione. Macchiatura di zecca tutta budella informazioni rendimento lorda distribuzione spaziale del target RNA nel tessuto senza la necessità di ricostruzione tridimensionale e risente meno di contaminazione ambientale, che spesso confonde il sequenziamento-based Metodi frequentemente utilizzati per lo studio di comunità microbiche complesse. Nel complesso, questa tecnica è uno strumento prezioso che può essere utilizzato per meglio capire vettoriale-patogeno-microbiota interazioni e il loro ruolo nella trasmissione della malattia.

La misurazione e la valutazione della qualità delle sonde del RNA sono fondamentali prima di iniziare la colorazione. In vitro trascrizione efficienza dipende altamente la quantità e la qualità del modello del DNA. Abbiamo visualizzato ordinariamente le sonde del RNA su un gel di formaldeide per verificare la purezza e la quantità di sonda generata dalle reazioni di trascrizione. Le sonde dovrebbero essere visualizzato come bande luminose, discreti (Figura 2). Misura spettrofotometrica della concentrazione di RNA era altamente indicativi della qualità di sonda e correlato bene con l'aspetto delle bande sul gel. Così, il punto di visualizzazione gel vengano ignorato se si desidera una volta familiarità con il protocollo sia stato raggiunto. In entrambi i casi, è importante assicurare che sia prodotto sufficiente RNA di alta qualità, come tutte le fasi a valle dipendono la robustezza delle sonde.
La forza di questa tecnica è nel facilitare ampie osservazioni circa il microbiota di graduazione, tra cui la presenza o l'assenza di specie batteriche, cambiamenti in abbondanza di batteri nel tempo come i feed di tick e localizzazione delle specie all'interno del tessuto intero. Qualche variazione nella macchiatura quantità e la distribuzione è normale tra repliche biologiche così come tra le 7 coppie di diverticoli di coraggio individuale (Figura 3), di conseguenza, che è preferibile di macchia almeno cinque budella a condizione per avere un'idea della media modello di macchiatura. Il successo globale del protocollo è meglio calibrato confrontando la colorazione dei campioni senso e antisenso per ogni condizione. I campioni di senso, importanti controlli negativi per questo tipo di analisi, dovrebbero avere minimo a nessun colore viola (Figura 4). Al contrario, campioni antisenso dovrebbero visualizzare macchiatura robusta con fondo minimo, la cui intensità dipenderà l'abbondanza delle trascrizioni batteriche specifiche presi di mira. Il modello di macchiatura all'interno del tessuto anche variano in base a questi parametri. D'importanza, il senso e antisenso campioni devono essere sviluppati per la stessa quantità di tempo per poter confrontare direttamente loro, pertanto questi esempi dovrebbero essere elaborati in parallelo. Eccessivo sviluppo della reazione colore può comportare una quantità elevata di priorità bassa che macchia, dove i campioni di senso cominciano a guardare simili a antisenso (Figura 5). Particolare cura dovrebbe adottare a questo passaggio nel protocollo per evitare overstaining, come non c'è nessun modo per invertire la reazione una volta che si verifica.
È fondamentale per assicurarsi che tutte le budella sono completamente sommerse in ciascun reagente durante ogni passo; un aumento nella variazione attraverso campioni può essere dovuto l'esposizione irregolare ai reagenti. La quantità di tempo che le zecche sono nutrite prima le budella sono raccolti inoltre ha un effetto significativo sui risultati. Le zecche che erano tale o alimentate solo per 24h erano difficili da lavorare; le budella erano anche più facilmente danneggiato e non ha macchiato così (Figura 6) ed è una limitazione di questo approccio in questo momento. Le zecche alimentate per 48-72 h erano più facili da lavorare, a causa delle dimensioni più grandi di queste budella rispetto al fegato da zecche alimentate per 24 h. budella da successivi intervalli di tempo anche macchiato meglio di 24 h-Federazione zecche, probabilmente a causa di aumento della carica batterica durante le successive fasi o f alimentazione. Il tessuto di 72 h ha avuto spesso un leggero sfondo di tinta marrone dal sangue, ma la colorazione viola era chiaramente visibile sopra la tinta (Figura 4). Le budella sono meglio visualizzate a basso ingrandimento (5x o 10x) per poter visualizzare il pattern di colorazione in tutta l'intero tessuto usando un microscopio a campo chiaro. Visualizzazione di tessuto intero-monta al più alto ingrandimento, come con un 63 X obiettivo olio, corre il rischio di danneggiare il tessuto come l'obiettivo sarebbe premere contro la diapositiva e comprimere il tessuto a causa dello spessore dei campioni. Se si desidera maggiore formazione immagine ad alta risoluzione, il potenziale per il taglio di tessuto dovrebbe essere esaminato.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57758/57758fig1.jpg"> Figura 1 . Schematica di preparazione del modello per la generazione di sonda. Duplicare l'amplicone di rRNA 16S in un vettore che contiene i promotori di T7 e Sp6 di clonazione di TA. Linearizzare il costrutto usando gli enzimi di restrizione per tagliare a siti a o b per trascrizione in vitro utilizzando promotore T7 o Sp6 per generare senso o antisenso sonde rispettivamente. <a href="/files/ftp_upload/57758/57758fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57758/57758fig2.jpg"> Figura 2 . Visualizzazione della sonda RNA mediante elettroforesi in gel. Le sonde del RNA (~ 700 ng) sono stati electrophoresed su un gel di agarosio di formaldeide, visualizzate sotto luce UV ed Imaging utilizzando un gel commerciale sistema di imaging. Una buona qualità rappresentative, vicolo 1; e sonda RNA di scarsa qualità, corsia 2.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57758/57758fig3.jpg"> Figura 3 . Un quadro rappresentativo dell'intero-monta in situ di ibridazione di 48 h-Federazione budella. Budella da zecche alimentati per 48h macchiato con antisenso RNA complementare ad una sequenza di RNA ribosomiale 16S conservato Mostra colorazione differenziale dei diverticoli dell'intestino. Barra della scala rappresenta 200 µm. <a href="/files/ftp_upload/57758/57758fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57758/57758fig4.jpg"> Figura 4 . Immagini rappresentative di successo intero-monta l'ibridazione in situ in Ixodes scapularis budella. Budella da zecche alimentate per la quantità indicata di tempo era macchiate usando entrambi senso (controllo negativo) o sonde di RNA antisenso. Sonde antisenso erano complementari a una sequenza di RNA ribosomiale 16S conservata (Universal 16S) o una sequenza di RNA 16S specifica di un particolare genere di batteri (come indicato). Enterococcus non cedettero macchiatura robusta a 48 h. scala bar rappresentano 140 µm. <a href="/files/ftp_upload/57758/57758fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57758/57758fig5.jpg"> Figura 5 . Tempo di reazione cromogenica prolungato porta alla colorazione aspecifica. Budella da zecche alimentate per 48 h sono stati sondati con una sonda del RNA di senso o una sonda antisenso complementare ad una sequenza di RNA 16S conservata. Il tessuto è stato incubato con il substrato fosfatasi alcalina BM viola durante la notte a 4 ° C e quindi a temperatura ambiente per circa 4 h prima di arrestare la reazione. Barre della scala rappresentano 140 µm. <a href="/files/ftp_upload/57758/57758fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57758/57758fig6.jpg"> Figura 6 . Intero-monta in situ ibridazione utilizzando tale o 24h alimentato tick budella. Budella da zecche unfed o 24 h-Federazione era macchiate usando le sonde senso RNA o antisenso sonde complementari per una sequenza di RNA 16S conservata o una sequenza specifica al genere Rickettsia. La colorazione nei campioni antisenso è meno robusto rispetto a quanto osservato in momenti successivi e il coraggio è anche più facilmente danneggiabili. Barre della scala rappresentano 60 µm. <a href="/files/ftp_upload/57758/57758fig6large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Nome</td>
			<td>Concentrazioni finali</td>
			<td>PH finale</td>
			<td>Note di archiviazione</td>
		</tr>
<tr>
<td>MEMFA</td>
			<td>0,1 MOPS M</td>
			<td>-</td>
			<td>Temperatura ambiente</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>2 mM EGTA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>solfato di magnesio 1 mM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>3,7% formaldeide</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS-Tween (PTw)</td>
			<td>1x PBS, 0.1% Tween-20</td>
			<td>7.0</td>
			<td>Temperatura ambiente</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>0.1% Tween-20</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Buffer di trietanolammina</td>
			<td>1x PBS</td>
			<td>7.0-8.0</td>
			<td>Temperatura ambiente</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>0.1 trietanolammina M</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Tampone di ibridazione</td>
			<td>50% formammide</td>
			<td>-</td>
			<td>-20 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>5 x SSC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>1 mg/mL Torula RNA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>eparina di 100 µ g/mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>1 x soluzione di Denhart</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>0.1% Tween-20</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>0,1% CHAPS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>10 mM EDTA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Tampone acido maleico (MAB)</td>
			<td>acido maleico 100 mM</td>
			<td>7.0</td>
			<td>Temperatura ambiente</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>150 mM di cloruro di sodio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Buffer di fosfatasi alcalina (AP)</td>
			<td>100 mM Tris</td>
			<td>9.5</td>
			<td>-20 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>cloruro di magnesio 50 mM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>100 mM di cloruro di sodio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>0.1% Tween-20</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>levamisolo 5 mM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Soluzione di candeggina</td>
			<td>1% di perossido di idrogeno</td>
			<td>-</td>
			<td>Preparare fresco</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>5% formammide</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>0.5 x SSC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1. Ricette delle soluzioni utilizzate nel protocollo.

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Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Visualizzazione del Microbiota in Tick budella di intero-monta In Situ di ibridazione

Qui, presentiamo un protocollo per spazialmente e temporalmente valutare la presenza del microbiota praticabile nelle viscere di segno di spunta utilizzando un approccio modificato intero-monta l'ibridazione in situ.

Infectious diseases transmitted by arthropod vectors continue to pose a significant threat to human health worldwide. The pathogens causing these ...

visualization-microbiota-tick-guts-whole-mount-situ

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

9.5K Views.  Yale University School of Medicine. Qui, presentiamo un protocollo per spazialmente e temporalmente valutare la presenza del microbiota praticabile nelle viscere di segno di spunta utilizzando un approccio modificato intero-monta l'ibridazione in situ.

Video: Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and transmitted from one generation to the next through the female oocyte is of fundamental importance. Because of the genetic tractability, and the elegant, ordered simplicity by which oocyte development proceeds, Drosophila oogenesis has become an invaluable system for mitochondrial study. An EdU (5-ethynyl-2&#180;-deoxyuridine) labeling method was utilized to detect mitochondrial DNA (mtDNA) replication in Drosophila ovaries. This method is superior to the BrdU (5-bromo-2'-deoxyuridine) labeling method in that it allows for good structural preservation and efficient fluorescent dye penetration of whole-mount tissues.
Here we describe a detailed protocol for labeling replicating mitochondrial DNA in Drosophila adult ovaries with EdU. Some technical solutions are offered to improve the viability of the ovaries, maintain their health during preparation, and ensure high-quality imaging. Visualization of newly synthesized mtDNA in the ovaries not only reveals the striking temporal and spatial pattern of mtDNA replication through oogenesis, but also allows for simple quantification of mtDNA replication under various genetic and pharmacological perturbations.

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

Drosophila oogenesis continues to be exceptionally useful in the study of mitochondrial proliferation and inheritance. This manuscript describes a detailed protocol used to label the replicating mitochondrial DNA (mtDNA) in Drosophila adult ovaries with 5-ethynyl-2&#180;-deoxyuridine (EdU), which facilitates uncovering mechanisms associated with mitochondrial inheritance that were previously debatable.

In Situ etichettatura di DNA mitocondriale di replica in Drosophila adulti ovaie di Edu colorazione

The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and ...

Ricerca

Genetica

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most mutagenesis-based screens, researchers have relied on the use of toxic chemicals, carcinogens, or irradiation, which requires designated equipment, safety setup, and/or disposal of hazardous materials. We have developed a simple approach to induce heritable mutations in C. elegans using germline-expressed histone-miniSOG, a light-inducible potent generator of reactive oxygen species. This mutagenesis method is free of toxic chemicals and requires minimal laboratory safety and waste management. The induced DNA modifications include single-nucleotide changes and small deletions, and complement those caused by classical chemical mutagenesis. This methodology can also be used to induce integration of extrachromosomal transgenes. Here, we provide the details of the LED setup and protocols for standard mutagenesis and transgene integration.

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Genetically-encoded histone-miniSOG induces genome-wide heritable mutations in a blue&#160;light-dependent manner. This mutagenesis method is simple, fast, free of toxic chemicals, and well-suited for forward genetic screening and transgene integration.

Optogenetic caso Mutagenesi Utilizzando istone-miniSOG in<em&gt; C. elegans</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization (mFISH) and Spectral Karyotyping (SKY) in Irradiated Mice

Ionizing radiation (IR) induces numerous stable and unstable chromosomal aberrations. Unstable aberrations, where chromosome morphology is substantially compromised, can easily be identified by conventional chromosome staining techniques. However, detection of stable aberrations, which involve exchange or translocation of genetic materials without considerable modification in the chromosome morphology, requires sophisticated chromosome painting techniques that rely on in situ hybridization of fluorescently labeled DNA probes, a chromosome painting technique popularly known as fluorescence in situ hybridization (FISH). FISH probes can be specific for whole chromosome/s or precise sub-region on chromosome/s. The method not only allows visualization of stable aberrations, but it can also allow detection of the chromosome/s or specific DNA sequence/s involved in a particular aberration formation. A variety of chromosome painting techniques are available in cytogenetics; here two highly sensitive methods, multiple fluorescence in situ hybridization (mFISH) and spectral karyotyping (SKY), are discussed to identify inter-chromosomal stable aberrations that form in the bone marrow cells of mice after exposure to total body irradiation. Although both techniques rely on fluorescent labeled DNA probes, the method of detection and the process of image acquisition of the fluorescent signals are different. These two techniques have been used in various research areas, such as radiation biology, cancer cytogenetics, retrospective radiation biodosimetry, clinical cytogenetics, evolutionary cytogenetics, and comparative cytogenetics.

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization mFISH and Spectral Karyotyping SKY in Irradiated Mice

The present protocol describes the usefulness of multiple fluorescence in situ hybridization (mFISH) and spectral karyotyping (SKY) in identifying inter-chromosomal stable aberrations in the bone marrow cells of mice after exposure to total body irradiation.

Rilevazione di Inter-aberrazioni cromosomiche stabili per fluorescenza multipla<em&gt; In Situ</em&gt; Ibridazione (mFISH) e spettrale cariotipo (SKY) in topi irradiati

Ionizing radiation (IR) induces numerous stable and unstable chromosomal aberrations. Unstable aberrations, where chromosome morphology is substantially ...

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting mutant alleles reside at their endogenous genomic sites and no exogenous DNA sequences are left in the genome following the procedure. Since in haploid yeast cells each of the four core histone proteins is encoded by two non-allelic genes with highly homologous open reading frames (ORFs), targeting mutagenesis specifically to one of two genes encoding a particular histone protein can be problematic. The strategy we describe here bypasses this problem by utilizing sequences outside, rather than within, the ORF of the target genes for the homologous recombination step. Another feature of this system is that the regions of DNA driving the homologous recombination steps can be made to be very extensive, thus increasing the likelihood of successful integration events. These features make this strategy particularly well-suited for histone gene mutagenesis, but can also be adapted for mutagenesis of other genes in the yeast genome.

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

A strategy for generating mutations in histone genes at their endogenous location in Saccharomyces cerevisiae is presented.

Mirata<em&gt; In Situ</em&gt; mutagenesi dell&#39;istone geni in germogliamento lievito

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting ...

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of tissues, we have developed numerous modifications and improvements to our original fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol. To facilitate throughput and cost effectiveness, all steps, from probe generation to signal detection, are performed using exon 96-well microtiter plates. Digoxygenin (DIG)-labelled antisense RNA probes are produced using either cDNA clones or genomic DNA as templates. After tissue fixation and permeabilization, probes are hybridized to transcripts of interest and then detected using a succession of anti-DIG antibody conjugated to biotin, streptavidin conjugated to horseradish peroxidase (HRP) and fluorescently conjugated tyramide, which in the presence of HRP, produces a highly reactive intermediate that binds to electron dense regions of immediately adjacent proteins. These amplification and localization steps produce a robust and highly localized signal that facilitates both cellular and subcellular transcript localization. The protocols provided have been optimized to produce highly specific signals in a variety of tissues and developmental stages. References are also provided for additional variations that allow the simultaneous detection of multiple transcripts, or transcripts and proteins, at the same time.

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

The described RNA in situ hybridization protocol allows the detection of RNA in whole Drosophila embryos or dissected tissues. Using 96-well microtiter plates and tyramide signal amplification, transcripts can be detected at high resolution, sensitivity, and throughput, and at a relatively low cost.

Ibridazione fluorescente In Situ ad alta risoluzione in embrioni della drosofila e tessuti mediante amplificazione del segnale Tyramide

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect and count individual RNA molecules. Complementary to deep sequencing-based methods, smFISH provides information about the cell-to-cell variation in transcript abundance and the subcellular localization of a given RNA. Recently, we have used smFISH to study the expression of the gene&#160;NDC80&#160;during meiosis in budding yeast, in which two transcript isoforms exist and the short transcript isoform has its entire sequence shared with the long isoform. To confidently identify each transcript isoform, we optimized known smFISH protocols and obtained high consistency and quality of smFISH data for the samples acquired during budding yeast meiosis. Here, we describe this optimized protocol, the criteria that we use to determine whether high quality of smFISH data is obtained, and some tips for implementing this protocol in&#160;other yeast strains and growth conditions.

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

This single molecule fluorescence in situ hybridization protocol is optimized to quantify the number of RNA molecules in budding yeast during vegetative growth and meiosis.

Singola molecola l'ibridazione In Situ (smFISH) analisi in crescita vegetativa lievito germogliante e meiosi

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell type-specific fashion. AS expression patterns are typically analyzed by RT-PCR and RNA-seq using RNA samples isolated from a population of cells. In situ examination of AS expression patterns for a particular biological structure can be carried out by RNA in situ hybridization (ISH) using exon-specific probes. However, this particular use of ISH has been limited because alternative exons are generally too short to design exon-specific probes. In this report, the use of BaseScope, a recently developed technology that employs short antisense oligonucleotides in RNA ISH, is described to analyze AS expression patterns in mouse brain sections. Exon 23a of neurofibromatosis type 1 (Nf1) is used as an example to illustrate that short exon-exon junction probes exhibit robust hybridization signals with high specificity in RNA ISH analysis on mouse brain sections. More importantly, signals detected with exon inclusion- and skipping-specific probes can be used to reliably calculate the percent spliced in values of Nf1 exon 23a expression in different anatomical areas of a mouse brain. The experimental protocol and calculation method for AS analysis are presented. The results indicate that BaseScope provides a powerful new tool to assess AS expression patterns in situ.

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

An in situ hybridization (ISH) protocol that uses short antisense oligonucleotides to detect alternative pre-mRNA splicing patterns in mouse brain sections is described.

Analisi quantitativa di impionbatura alternativo Pre-mRNA nelle sezioni del cervello del Mouse usando analisi di RNA In Situ di ibridazione

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

micro-RNAs (miRNAs) are single-stranded RNA transcripts that bind to messenger RNAs (mRNAs) and inhibit their translation or promote their degradation. To date, miRNAs have been implicated in a large number of biological and disease processes, which has signified the need for the reliable detection methods of miRNA transcripts. Here, we describe a detailed protocol for digoxigenin-labeled (DIG) Locked Nucleic Acid (LNA) probe-based miRNA detection, combined with protein immunostaining on mouse heart sections. First, we performed an in situ hybridization technique using the probe to identify miRNA-182 expression in heart sections from control and cardiac hypertrophy mice. Next, we performed immunostaining for cardiac Troponin T (cTnT) protein, on the same sections, to co-localize miRNA-182 with the cardiomyocyte cells. Using this protocol, we were able to detect miRNA-182 through an alkaline phosphatase based colorimetric assay, and cTnT through fluorescent staining. This protocol can be used to detect the expression of any miRNA of interest through DIG-labeled LNA probes, and relevant protein expression on mouse heart tissue sections.

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

micro-RNAs (miRNAs) are short and highly homologous RNA sequences, serving as post-transcriptional regulators of messenger RNAs (mRNAs). Current miRNA detection methods vary in sensitivity and specificity. We describe a protocol that combines in situ hybridization and immunostaining for concurrent detection of miRNA and protein molecules on mouse heart tissue sections.

Tessuto-specifici miRNA Expression Profiling in Mouse cuore sezioni mediante ibridazione In Situ

micro-RNAs (miRNAs) are single-stranded RNA transcripts that bind to messenger RNAs (mRNAs) and inhibit their translation or promote their degradation. To ...

Raising the Mexican Tetra Astyanax mexicanus for Analysis of Post-larval Phenotypes and Whole-mount Immunohistochemistry

River and cave-adapted populations of Astyanax mexicanus show differences in morphology, physiology, and behavior. Research focused on comparing adult forms has revealed the genetic basis of some of these differences. Less is known about how the populations differ at post-larval stages (at the onset of feeding). Such studies may provide insight into how cavefish survive through adulthood in their natural environment. Methods for comparing post-larval development in the laboratory require standardized aquaculture and feeding regimes. Here we describe how to raise fish on a diet of nutrient-rich rotifers in non-recirculating water for up to two-weeks post fertilization. We demonstrate how to collect post-larval fish from this nursery system and perform whole-mount immunostaining. Immunostaining is an attractive alternative to transgene expression analysis for investigating development and gene function in A. mexicanus. The nursery method can also be used as a standard protocol for establishing density-matched populations for growth into adults.

Raising the Mexican Tetra Astyanax mexicanus for Analysis of Post-larval Phenotypes and Whole-mount Immunohistochemistry

In this protocol, we demonstrate how to breed Astyanax mexicanus adults, raise the larvae, and perform whole-mount immunohistochemistry on post-larval fish to compare the phenotypes of surface and cave morphotypes.

Alzando la Tetra messicano Astyanax mexicanus per analisi di Post-larval fenotipi e Immunohistochemistry intero-monta

River and cave-adapted populations of Astyanax mexicanus show differences in morphology, physiology, and behavior. Research focused on comparing adult ...

Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives each year. Effective treatment options able to halt disease progression are lacking. Despite the extensive sequencing efforts in large patient populations, the majority of ALS and PD cases remain unexplained by genetic mutations alone. Epigenetics mechanisms, such as the post-translational modification of histone proteins, may be involved in neurodegenerative disease etiology and progression and lead to new targets for pharmaceutical intervention. Mammalian in vivo and in vitro models of ALS and PD are costly and often require prolonged and laborious experimental protocols. Here, we outline a practical, fast, and cost-effective approach to determining genome-wide alterations in histone modification levels using Saccharomyces cerevisiae as a model system. This protocol allows for comprehensive investigations into epigenetic changes connected to neurodegenerative proteinopathies that corroborate previous findings in different model systems while significantly expanding our knowledge of the neurodegenerative disease epigenome.

This protocol outlines experimental procedures to characterize genome-wide changes in the levels of histone post-translational modifications (PTM) occurring in connection with the overexpression of proteins associated with ALS and Parkinson&#39;s disease in Saccharomyces cerevisiae models. After SDS-PAGE separation, individual histone PTM levels are detected with modification-specific antibodies via Western blotting.

Alterazioni di modificazione post-traduzionale istone caratterizzante nel lievito Neurodegenerative Proteinopathy modelli

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives ...