Biz içtenlikle Dr. Mustafa Khokha, Yale Üniversitesi, onun laboratuvar kaynaklarının kullanımını sağlamak için teşekkür ederiz. Mükemmel teknik yardım için Bay Ming-Jie Wu için sana şükrediyoruz. EF HHMI dedektif olduğunu. Bu eser bir hediyesi John Monsky ve Jennifer Weis Monsky Lyme hastalığı araştırma fonu tarafından desteklenmiştir.

1. DNA şablonları hazırlanması
<ol><li>16S rRNA sıra belirli bakteriyel her cins NCBI veritabanını ve tasarım polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) uyumlu ileri download ve cins özel bölgeler (~ 200-250 baz çifti uzun) daha önce anlatıldığı gibi yükseltmek astar ters 19. RNA probları bakteriyel bazı cinsler için ticari olarak olsa da aynı zamanda açık kaynak veritabanlarının SILVA20,probeBase ve21 22 için çevrimiçi kaynaklar rRNA hedefli oligonükleotid sonda ve astarlar, bakın kullanılabilir. Not: Özel-özel cins olan gen bölgeleri seçin ve tasarlanmış astar ilgili bakteriyel cins yükseltmek değil emin olmak önemlidir. Bu gen/cins özel sonda hibridizasyon elde etmek için önemlidir.</li>
	<li>Fareler, 24, 48 veya 72 h kene cesaret teşrih ve RNA ve açıklanan önceki23olarak kene bağırsaklar dan cDNA hazırlamak için keneler besleme. PCR şablonuna yükseltmek gibi bir thermocycler kullanarak cins özel amplicons cDNA kullanın. PCR-ürün/amplicon bir aliquot üzerinde % 1.5 özel jel çalıştırın ve amplicon için beklenen boyut görüntüleme sistemi bir jel kullanarak ultraviyole (UV) ışık altında görselleştirme tarafından karşılık geldiğini onaylayın.</li>
	<li>Bakteriyel 16S ribozomal RNA amplicon ilgi RNA polimeraz Rehberleri bakteriyofaj polimerazlar (SP6, T7 veya T3) uygun içeren bir piyasada bulunan TA vektör içine (Tablo reçetesi) klon. Amplicon kimliğini ve yön ile ilgili her Rehberleri bir klonu onaylamak için klonlar sıra. Buna göre duygusu veya antianlamlı RNA oluşturmak için seçim organizatörü (Şekil 1) probları belirlemek.</li>
	<li>Plazmid 30 µLfor üretici tarafından önerilen sıcaklıklarda 2 h reaksiyon hacmine uygun bir Restriksiyon enzimi ile 1 mg linearize. Enzimleri duygusu veya antianlamlı sonda (Şekil 1) oluşturmak için kullanılması gereken organizatörü göre seçin. 2 µL % 1'özel jel üzerinde Özet tepki görselleştirme tarafından doğrusallaştırma doğrulayın.</li>
	<li>Bir piyasada bulunan PCR ürün sütun arıtma kiti kullanılarak sindirilir DNA'ın kalan 28 µL arındırmak ve DNA toplama spektrofotometre tarafından ölçmek. Not: Arka plan karşılık gelen antianlamlı sonda çok daha yüksek boyama bazı anlamda probları neden olabilir ve diğer seçenekleri keşfedilmeyi gerekebilir. Alternatif negatif denetimleri örneği veya hibridizasyon kendine özgü bir model verir başka bir robot temsil edilmeyen dizileri kodlama plazmid içerir.</li>
</ol>2. Digoxygenin-UTP RNA probları inşaatı
<ol><li>100 mm UTP, 10 mM digoxygenin-UTP 25 µL ve 10 µL her 100 mM ATP, GTP ve CTP 1,5 mL santrifüj tüpü içinde 7,5 µL birleştirerek nükleotit karışımı hazırlayın.</li>
	<li>Vitro transkripsiyon gerçekleştirmek piyasada bulunan T7 veya Sp6 RNA polimeraz kitleri kullanarak, 1 µL nükleotit Mix (adım 2.1) ve 0,25 - kullanarak 1 µg şablonunun DNA. Birim su ile 20 µL kadar getir. Birleştirmek ve spin darbe tüpü hafifçe vur. 2.5-3 h 37 ° C'de kuluçkaya. Not: Sonda inşaat sindirilir plazmid konsantrasyonları 7 ng/µL düşük ama 15-25 ng/µL Bu adım mesafeden tipik konsantrasyonları ile başarılı olmuştur. Transkripsiyon tepki de gecede 37 ° C'de inkübe, ama bu önemli ölçüde RNA verim artırmaz.</li>
	<li>DNaz 1 µL ekleyin (2.000 adet/µL) ve 10 dk 37 ° C'de kuluçkaya. 10 dk fazla olamaz veya enzim RNA aşağılayıcı başlayabilir.</li>
	<li>Buz gibi 7.5-8 M Lityum klorür 30 µL ve 30 µL RNA çökelti nükleaz ücretsiz soğutulmuş su ekleyin. Karıştırmak için tüp fiske. Yağış RNA gecede-20 ° C'de devam etmek için izin</li>
	<li>Santrifüjü 17.000 x g 4 ° C'de 20 dk için de tarafından RNA toplamak Pelet kez 1 mL taze hazırlanmış % 75 etanol dietil pyrocarbonate (DEPC) su ile yıkayın, sonra aralıklarla tekrarlayın.</li>
	<li>Kaldırmak ve süpernatant atmak, tüp temiz kağıt havlu üzerine ters çevir ve 10 dk. Resuspend için Pelet nükleaz ücretsiz su kurumasını sağlar. Pelet kolayca görünür durumdaysa, 25 µL resuspend. Pelet içinde 15-20 µL. çok küçük veya görünür değil, resuspend ise RNA konsantrasyon tahmini spektrofotometre tarafından elde etmek. Not: 200-500 ng/µL tipik RNA konsantrasyonları arasındadır.</li>
</ol>3. görsel olarak RNA RNA saflık değerlendirmek için RNA formaldehit jel elektroforez tarafından probları
Dikkat: Formaldehit bir inhalasyon tehlike teşkil etmektedir; Bu nedenle, RNA jel analiz bir duman Hood için gerekli çözümler üretmek. Etidyum bromür şüpheli bir kanserojen olduğu; özenle hallederim.
<ol><li>% 1 formaldehit özel jel24 daha önce açıklanan ve jel RNases ücretsiz bir jel kutusunda döküm olarak hazırlamak. Serin bir kez, arabellek (1 x bezleri pH 7,0, %5 formaldehit) çalıştıran x 1 jel kutusunu doldurun.</li>
	<li>Örnek arabellek (5 µL 400 mg/mL arasında etidyum bromür, bezleri, 35 µL formaldehit ve 100 µL formamide x 20 µL 10) hazırlayın. RNA inceleyebilirsek (adım 2.6) 2 µL örnek arabellek 8 µL ile birleştirin. 10 dk 70 ° C'de kuluçkaya.</li>
	<li>RNA yükleme arabellek 5 mL % 50 gliserol, 1 mL % 10 formaldehit, 40 mg bromophenol mavi, 40 mg ksilen cyanol ve 0,5 M EDTA (pH 7.5) 20 µL birleştirerek hazırlayın. Bu arabellek-20 ° C'de kullandıktan sonra saklamak</li>
	<li>Yükleme arabelleği 3 µL RNA örnek adım 3.2 ekleyip karıştırın. Örnek tüpler buz üzerinde tutun.</li>
	<li>Bütün numune hacmi adım 3.4 jel yükleyin. Bir aliquot tek iplikçikli RNA merdivenin alongside RNA boyutu doğrulamak için yükleyin. Jel 100 V çalıştırmak veya mavi boya jel aşağı yaklaşık % 75'i geçirir dek indirin. Bir jel görüntüleme sistemi kullanarak UV ışık altında RNA görselleştirin. Not: Kaliteli RNA prob prob (Şekil 2, lane 1) beklenen boyutuna karşılık gelen bir hareketlilik ile ayrı bir grup olarak görünmesi gerekir. Eğer soruşturma bu kullanılmaması gereken bir yaygın ve smeary band (Şekil 2lane 2) görünür.</li>
</ol>4. Gut koleksiyonu ve fiksasyon kene
<ol><li>Zaman ilgi için fareler üzerinde beslenen Ixodes scapularis perileri toplamak. Not: Bu teknik amacı gereği, 48 veya 72 s iş için en iyi keneler beslenir.</li>
	<li>Kene gelen bağırsak MEMFA (Tablo 1) mümkün olduğunca çok organ hasar kaçınarak bir diseksiyon mikroskop altında bir cam slayt üzerinde incelemek. Bir kene MEMFA 20-30 µL içinde temiz mikroskop slayttaki bir yer. Steril yüksek karbon çelik tıraş bıçağı #11 dilim baş bölge çifti kene kene vücut bırakarak kalkan kullanarak. Gut divertikül ve tükürük bezleri vücut kütikül dışarı itmek için vücut hafifçe bastırın. Tükrük bezleri ve gut ayırmak ve cesareti jilet üzerinde oymak.</li>
	<li>Cesaret 500 µL MEMFA içeren bir 1,5 mL tüp içine toplamak. Nazik 1 h için sallanan ile Oda sıcaklığında tüp kuluçkaya veya bir gece 4 ° C'de Not: Kene tükürük bezleri de disseke ve benzer şekilde sabit lekeli ve.</li>
	<li>Doku yavaşça 1 mL buz gibi % 100 etanol ile 3 kez yıkayarak kurutmak. Santrifüjü doku zarar verebilir gibi doğal olarak her yıkama arasında tüp altına lavabo cesaret ver. Uzun süreli depolama için örnekleri-20 ° C'de % 100 etanol içinde tutmak</li>
</ol>5. inşaat kafes örnek sepetleri ve 24-şey sepet tutucu
<ol><li>Dipleri 2 mL veya 5 mL kapalı ısıtmalı tek taraflı jilet bir neşter kullanarak ek alıcı santrifüj tüpleri kesti. Dikkat: Bıçak kesim tamamlamadan önce birkaç kez yeniden isitilan gerekebilir.</li>
	<li>110 µm naylon mesh karelerinin biraz yeni tüp açılış daha büyük kesti. Tüp altına mesh iyi bir mühür yapılana kadar onları birlikte hafifçe sıcak bir tabak orta-düşük ateşte basarak bond. Soğumaya bırakın, mesh ve tüp arasında boşluk olduğundan emin olun ve aşırı kafes kenarları kırpın.</li>
	<li>Öyle ki adım 5,2 yapılan örnek sepet dudak Hole'da oturmak ve aracılığıyla, nerede örnek sepetleri dipleri oturup ta wells içinde konulduğunda bir set-up verimli değil düşmek bir 24-şey plaka kapak delik kesme kapak delik.</li>
	<li>Bu monte sepet tutucu sepetleri bir tabak içinde in situ hibridizasyon Protokolü tamamı için göreli kolaylıkla diğerine aktarmak için kullanın. Bir kuluçka meydana gelen iken, diğer plaka için sonraki yıkama hazırlanan iki 24-şey tabak kullanın.</li>
</ol>6. in Situ hibridizasyon: 1. gün (zamanlama: 4-5 h)
<ol><li>Transfer cesareti için örnek sepetleri etiketli, deneysel koşulla ayrılmış ve RNA sonda amaçlanan. Not: koşul çoğaltır arasında doğal varyasyon için hesap başına en az 5 cesaret leke.</li>
	<li>Yavaşça hava kabarcıkları dokusu içine yavaş yavaş serum fosfat tamponlu %0.1 non-iyonik yüzey aktif (PTw; oranını artırarak tanıtımı önlemek için örnekleri suyla temasa Tablo 1) etanol için yıkar. Not: Komple tüm 24-şey sepet sahibi nazik ajitasyon ile ortam sıcaklığı, aksi belirtilmediği sürece yıkar. Aliquot 500-600 µL yıkama çözümler içine cesaret her sepette tamamen batık her tür sahibinin. RNA yıkımı önlemek için su DEPC tedavi ile tüm çözümleri hazırlayın.<ol>
<li>Örnekleri 5 min için 500 µL % 100 etanol içinde yıkayın.</li>
		<li>% 75'i örnek sepet başına en az 500 µL hazırlamak, % 50 ve % 25 etanol içinde PTw. örnekleri 5 dakika içinde en yüksek etanol konsantrasyon en düşük hareket her etanol çözüm yıkanmasında tarafından suyla temasa.</li>
		<li>4 kere 5 min için örnekleri PTw içinde yıkayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Örnekleri İndinavir K ile permeabilize (10 µg/mL) PTw 5 dk içinde.</li>
	<li>Doku hibridizasyon için RNA probları ile hazırlayın.<ol>
<li>İki kez 6.2 500 µL trietanolamin tampon (0.1 M, pH 7,0-8.0) her 5 min için nazik ajitasyon ile ortam sıcaklığında 24-şey sepet tutucu (örnekleri Amin-Alerjik bir ortamda korumak için,Tablo 1) açıklandığı gibi örnekleri yıkayın.</li>
		<li>Trietanolamin tampon (0.1 M, pH 7,0-8.0) 5 min için örnekleri iki kez 500 µL % 0,25 asetik anhidrit ile tedavi, sonra örnekleri PTw 5 min için iki kez yıkayın. Not: Non-spesifik elektrostatik etkileşimler önlemek ve mRNA için sondanın özel bağlayıcı emin olmak çok önemlidir olumlu şarj etkisiz hale getirmek için ücretsiz aminler asetik anhidrit acetylates.</li>
		<li>PTw 500 µL % 4 paraformaldehyde ile 20 dk için cesaret düzeltmek, daha sonra 5 kere 5 dk her PTw içinde yıkayın.</li>
		<li>500 µL hibridizasyon arabellek /in titreyen bir su banyosu içinde nazik ajitasyon ile 24-şey sepet sahibi için 1,5-2,5 h 60 ° C'de 24 iyi plaka (Tablo 1) örneklerinde kuluçka tarafından prehybridize. Gün 2 Protokolü (adım 7.1) yeniden kullanmak için prehybridization adım hibridizasyon arabelleği kaydedin.</li>
		<li>Sonda hibridizasyon çözümleri RNA sondalar son konsantrasyonu 1 µg/ml hibridizasyon arabellekte sulandrarak hazırlayın.  Kuluçkaya gecede, titreyen bir su banyosu (Tablo 2) nazik ajitasyon ile 60 ° C'de 24-şey sepet tutucu prob hibridizasyon çözümleri ile örnekleri. Hibridizasyon çözüm buharlaşma önlemek için sepet tutucu alüminyum folyo ile rahatça taşıyan plaka kapak.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. in Situ hibridizasyon: 2. gün (zamanlama: 4.5-5.5 h)
<ol><li>Örnekleri sonda hibridizasyon çözümlerinden kaldırmak ve önceki gün ayrılmış hibridizasyon arabelleğinden içine koyun. 3 min için nazik ajitasyon ile 60 ° C'de kuluçkaya. Not: Sonda hibridizasyon çözümleri-20 ° c yeniden kullanım için ilâ 3 kere depolanabilir.</li>
	<li>Serum sodyum sitrat arabellek (SSC) x 2 sulandrarak 20 tarafından hazırlamak x SSC DEPC tedavi su (Tablo 1). Örnekleri 3 dk ile 2 x SSC için iki kez, o zaman 2 ile 20 dk için 3 kez yıkayın x SSC 60 ° C'de sonda ve hibridizasyon arabelleği tüm izlerini silmek için.</li>
	<li>Bir (20 µg/mL) ve RNase T RNase ile tedavi1 (10 µg/mL) 2 x SSC 37 ° C'de 30 dk için tek kaldırmak için zor durumda RNA prob ücretsiz temsil eden sigara-melezleşmiştir RNA.</li>
	<li>2 ile bir kez yıkama x SSC oda sıcaklığında 10 dakika için. 0,2 hazırlamak sulandrarak 2 tarafından x SSC suda DEPC tedavi x SSC sonra iki kez 0,2 ile yıkayın aşırı RNases kaldırmak için x SSC 60 ° C'de 30 dk için.</li>
	<li>Maleik asit tampon (MAB; 500 µL ile iki kez yıkamak Tablo 1) 10 dakikadır her.</li>
	<li>1.5-2 h için çözüm (MAB % 2 engelleme reaktif) engelleme ile örnekleri kuluçkaya. Not: Engelleme reaktif çözülmeye zor olabilir; nazik Isıtma dağılmasına yardımcı olur.</li>
	<li>Anti-digoxigenin alkalin fosfataz Birleşik 500 µL çözüm engelleme 1:3,000 seyreltme, antikor, engelleme çözüm yerine ve yaklaşık 4 h için oda sıcaklığında veya 4 ° C'de gecede kuluçkaya.</li>
</ol>8. in Situ hibridizasyon: 3. gün (zamanlama: bir gecede 6 h)
<ol><li>Örnekleri ile 500 µL MAB aşırı antikor kaldırmak için her 30 dk için en az 5 kez yıkayın. Not: Bu yıkama esnektir ve 1-2 h için uzatılabilir veya 3-4 yıkama etkinliği en az düzeyde etkisi ile 4 ° C'de bir gecede yıkama için yerine olabilir.</li>
	<li>Alkalen fosfataz arabelleği, pH 9,5 (AP arabellek; ile 5 min için iki kez yıkamak Tablo 1).</li>
	<li>Son yıkama chromogenic substrat alkalen fosfataz (Tablo reçetesi) için 500 µL değiştirerek renk reaksiyon başlar. Alüminyum folyo ile örnek plaka kapak ve 3 - 5 s veya 4 ° C'de gece için oda sıcaklığında devam boyama izin Boyama reaksiyonu belirli aralıklarla overstaining önlemek için diseksiyon mikroskop altında doku görüntüleyerek izlemek. Not: boyama tamamlandığında, bir mor renk tonu gözlerinin içine mikroskop altında antisens probed örnekleri tarafından algılanabilir ama doku çok karanlık olmak için izin verilmemelidir. Boyama 4 ° C'de çok yavaş devam eder ve en fazla 20-24 saat sürebilir.</li>
	<li>5 dakika içinde 500 µL MAB yıkanmasında tarafından renk reaksiyonu ve ardından doku gecede Bouin'ın çözümde düzeltmek. Dikkat: Bouin'ın çözüm bir duman başlıklı işlemek; aşındırıcı bir kanserojen olduğu.</li>
</ol>9. in Situ hibridizasyon: 4 gün (zamanlama: 3-3.5 h)
<ol><li>1 örnek sepet başına en az 7 mL hazırlamak sulandrarak 20 x SSC su DEPC tedavi x SSC. Bouin'ın çözüm 1'örnekleri 4-6 kez % 70 etanol ile yıkayarak çıkarın doku artık sarı olana x SSC.</li>
	<li>%1 75, % 50 ve % 25 etanol çözümlerinde örnek sepet başına 500 µL hazırlamak x SSC. Örnekleri 5 min için en yüksek etanol konsantrasyon en düşük için doku rehydrate hareketli her çözümde yıkayın. İki kez 5 dk içinde her 1 yıkama x SSC.</li>
	<li>Çamaşır suyu çözüm (Tablo 1) örneklerinde bir duman başlıklı bir lightbox üzerinde 90 dk için kuluçkaya. Not: Bu adım herhangi bir pigmentasyon örnekleri veya Bouins eriyik-e doğru var olmak çıkarmak--dan renklendirme sağlar ve sonda sinyal açık görselleştirme için geliştirir.</li>
	<li>1 500 µL iki kez örnekleriyle yıkama x SSC 5 min için.</li>
	<li>Çok az hasar bağırsaklarıyla örnek sepet yeni bir 24-şey plaka bir kuyunun içine ters çevirme tarafından yeniden konumlandırmak ve % 70 etanol transfer pipet kullanarak kafes alt aracılığıyla ile yıkayın. -20 ° C'de gerekirse depolar.</li>
	<li>Şekil 3' te, gösterildiği gibi birden fazla örnekleri boyama şekillerinin genel bir bakış elde etmek için herhangi bir alan parlak mikroskopla % 70 etanol 24 iyi-plaka ve görünüm cesaret korumak. Şekil 4, Şekil 5' de gösterildiği gibi bireysel cesaret alan parlak mikroskop altında incelemek için, ve Şekil 6, %100 gliserol coverslips altında cesaret dağ. Bir plastik spatula yavaşça en az hasarla doku işlemek için kullanın. Not: Gliserol yüksek viskozite doku sıkıştırma tarafından neden olduğu zararlara karşı korunmasına yardımcı olur ve doku daha yüksek büyütme oranlarında en iyi şekilde görüntülenebilir öyle ki divertikül dikkatli konumlandırma sağlar.</li>
	<li>Esir alma imge üstünde mikroskop mikroskop belirli görüntü yakalama yazılımı (Tablo reçetesi) kullanarak ve genel bir resim düzenleme yazılımı için TIFF görüntü olarak dışa aktarın. Deneysel tedaviler göreli Boyama farklılıkları ölçmek için genel görüntü analiz yazılımı (Tablo reçetesi) yükleyin. Görüntüyü analiz yazılımı içinde açın ve boyama piksel yoğunluğu ölçümü ve boyama çubuk grafik araziler hesaplamak için belgili tanımlık öğretim içinde belgili tanımlık bilgisayar yazılımı kullanın.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Leitner, W. W., Wali, T., Kincaid, R., Costero-Saint Denis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arthropod+Vectors+and+Disease+Transmission:+Translational+Aspects.">Arthropod Vectors and Disease Transmission: Translational Aspects.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (11), e0004107 (2015).</li><li>Hooper, L. V., Gordon, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Commensal+host-bacterial+relationships+in+the+gut.">Commensal host-bacterial relationships in the gut.</a> Science. 292 (5519), 1115-1118 (2001).</li><li>Ley, R. E., Lozupone, C. A., Hamady, M., Knight, R., Gordon, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Worlds+within+worlds:+evolution+of+the+vertebrate+gut+microbiota.">Worlds within worlds: evolution of the vertebrate gut microbiota.</a> Nature Review Microbiology. 6 (10), 776-788 (2008).</li><li>Narasimhan, S., Fikrig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tick+microbiome:+the+force+within.">Tick microbiome: the force within.</a> Trends in Parasitology. 31 (7), 315-323 (2015).</li><li>Weiss, B., Aksoy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbiome+influences+on+insect+host+vector+competence.">Microbiome influences on insect host vector competence.</a> Trends in Parasitoly. 27 (11), 514-522 (2011).</li><li>Degli Esposti, M., Martinez Romero, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functional+microbiome+of+arthropods.">The functional microbiome of arthropods.</a> PLoS One. 12 (5), e0176573 (2017).</li><li>Radolf, J. D., Caimano, M. J., Stevenson, B., Hu, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+ticks,+mice+and+men:+understanding+the+dual-host+lifestyle+of+Lyme+disease+spirochaetes.">Of ticks, mice and men: understanding the dual-host lifestyle of Lyme disease spirochaetes.</a> Nature Reviews Microbiology. 10 (2), 87-99 (2012).</li><li>Sojka, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+machinery+of+blood+digestion+by+ticks.">New insights into the machinery of blood digestion by ticks.</a> Trends in Parasitology. 29 (6), 276-285 (2013).</li><li>Grigor'eva, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphofunctional+changes+in+the+midgut+of+Ixodid+ticks+during+the+life+cycle.">Morphofunctional changes in the midgut of Ixodid ticks during the life cycle.</a> Entomological Review. 90, 405-409 (2010).</li><li>Goodrich, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conducting+a+microbiome+study.">Conducting a microbiome study.</a> Cell. 158 (2), 250-262 (2014).</li><li>Salter, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reagent+and+laboratory+contamination+can+critically+impact+sequence-based+microbiome+analyses.">Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses.</a> BMC Biology. 12, 87 (2014).</li><li>Hemmati-Brivanlou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+specific+mRNAs+in+Xenopus+embryos+by+whole-mount+in+situ+hybridization.">Localization of specific mRNAs in Xenopus embryos by whole-mount in situ hybridization.</a> Development. 110 (2), 325-330 (1990).</li><li>Frank, D., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+expression+of+XMyoD+in+non-somitic+mesoderm+of+Xenopus+gastrulae.">Transient expression of XMyoD in non-somitic mesoderm of Xenopus gastrulae.</a> Development. 113 (4), 1387-1393 (1991).</li><li>Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization:+an+improved+whole-mount+method+for+Xenopus+embryos.">In situ hybridization: an improved whole-mount method for Xenopus embryos.</a> Methods in Cell Biology. 36, 685-695 (1991).</li><li>Kernohan, K. D., Berube, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+dimensional+dual+labelled+DNA+fluorescent+in+situ+hybridization+analysis+in+fixed+tissue+sections.">Three dimensional dual labelled DNA fluorescent in situ hybridization analysis in fixed tissue sections.</a> MethodsX. 1, 30-35 (2014).</li><li>Sonenshine, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biology of ticks. , (1991).</li><li>Narasimhan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut+microbiota+of+the+tick+vector+Ixodes+scapularis+modulate+colonization+of+the+lyme+disease+spirochete.">Gut microbiota of the tick vector Ixodes scapularis modulate colonization of the lyme disease spirochete.</a> Cell Host Microbe. 15 (1), 58-71 (2014).</li><li>Hammer, B., Moter, A., Kahl, O., Alberti, G., Gobel, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+Borrelia+burgdorferi+sensu+lato+by+fluorescence+in+situ+hybridization+(FISH)+on+whole-body+sections+of+Ixodes+ricinus+ticks+and+gerbil+skin+biopsies.">Visualization of Borrelia burgdorferi sensu lato by fluorescence in situ hybridization (FISH) on whole-body sections of Ixodes ricinus ticks and gerbil skin biopsies.</a> Microbiology. 147 (Pt 6), 1425-1436 (2001).</li><li>Harmsen, H. J., Raangs, G. C., He, T., Degener, J. E., Welling, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+set+of+16S+rRNA-based+probes+for+detection+of+bacteria+in+human+feces.">Extensive set of 16S rRNA-based probes for detection of bacteria in human feces.</a> Applied Environmental Microbiology. 68 (6), 2982-2990 (2002).</li><li>Quast, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SILVA+ribosomal+RNA+gene+database+project:+improved+data+processing+and+web-based+tools.">The SILVA ribosomal RNA gene database project: improved data processing and web-based tools.</a> Nucleic Acids Research. 41 (Database issue), D590-D596 (2013).</li><li>Yilmaz, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SILVA+and+&amp;#34;All-species+Living+Tree+Project+(LTP)&amp;#34;+taxonomic+frameworks.">The SILVA and &amp;#34;All-species Living Tree Project (LTP)&amp;#34; taxonomic frameworks.</a> Nucleic Acids Research. 42, D643-D648 (2014).</li><li>Greuter, D., Loy, A., Horn, M., Rattei, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=probeBase--an+online+resource+for+rRNA-targeted+oligonucleotide+probes+and+primers:+new+features+2016.">probeBase--an online resource for rRNA-targeted oligonucleotide probes and primers: new features 2016.</a> Nucleic Acids Research. 44, D586-D589 (2016).</li><li>Narasimhan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+the+tick+gut+milieu+by+a+secreted+tick+protein+favors+Borrelia+burgdorferi+colonization.">Modulation of the tick gut milieu by a secreted tick protein favors Borrelia burgdorferi colonization.</a> Nature Communication. 8 (1), 184 (2017).</li><li>Bryant, S., Manning, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formaldehyde+gel+electrophoresis+of+total+RNA.">Formaldehyde gel electrophoresis of total RNA.</a> Methods Molecular Bioliogy. 86, 69-72 (1998).</li><li>Tautz, D., Pfeifle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-radioactive+in+situ+hybridization+method+for+the+localization+of+specific+RNAs+in+Drosophila+embryos+reveals+translational+control+of+the+segmentation+gene+hunchback.">A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback.</a> Chromosoma. 98 (2), 81-85 (1989).</li><li>Robson, A., Owens, N. D., Baserga, S. J., Khokha, M. K., Griffin, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+ribosomopathy+genes+during+Xenopus+tropicalis+embryogenesis.">Expression of ribosomopathy genes during Xenopus tropicalis embryogenesis.</a> BMC Development Biology. 16 (1), 38 (2016).</li><li>Khokha, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+and+probes+for+the+study+of+Xenopus+tropicalis+development.">Techniques and probes for the study of Xenopus tropicalis development.</a> Developmental Dynamics. 225 (4), 499-510 (2002).</li><li>Jowett, T., Lettice, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-mount+in+situ+hybridizations+on+zebrafish+embryos+using+a+mixture+of+digoxigenin-+and+fluorescein-labelled+probes.">Whole-mount in situ hybridizations on zebrafish embryos using a mixture of digoxigenin- and fluorescein-labelled probes.</a> Trends in Genetics. 10 (3), 73-74 (1994).</li><li>Behnam, F., Vilcinskas, A., Wagner, M., Stoecker, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+straightforward+DOPE+(double+labeling+of+oligonucleotide+probes)-FISH+(fluorescence+in+situ+hybridization)+method+for+simultaneous+multicolor+detection+of+six+microbial+populations.">A straightforward DOPE (double labeling of oligonucleotide probes)-FISH (fluorescence in situ hybridization) method for simultaneous multicolor detection of six microbial populations.</a> Applied Environmental Microbiology. 78 (15), 5138-5142 (2012).</li><li>Pai, V. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HCN4+ion+channel+function+is+required+for+early+events+that+regulate+anatomical+left-right+patterning+in+a+nodal+and+lefty+asymmetric+gene+expression-independent+manner.">HCN4 ion channel function is required for early events that regulate anatomical left-right patterning in a nodal and lefty asymmetric gene expression-independent manner.</a> Biology Open. 6 (10), 1445-1457 (2017).</li><li>Legendre, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+mount+RNA+fluorescent+in+situ+hybridization+of+Drosophila+embryos.">Whole mount RNA fluorescent in situ hybridization of Drosophila embryos.</a> JoVE. (71), e50057 (2013).</li></ol>

Yazarlar hiçbir ifşa etmek çıkar çatışması var.

Bu bir eklem bacaklılar vektör patojenlerin microbiota çalışmaya bir bütün-mount situ hibridizasyon (WMISH) tekniği ilk kullanmaktır. Bizim iletişim kuralı bir geliştirme Drosophila ve kurbağa embriyosu25,26çalışırdım adapte oldu. Bütün Dağı RNA in situ hibridizasyon gen transkript dağınık şekilde yerelleştirmek için rutin olarak kullanılmıştır ve geçici27 ve transkript görselleştirme parlak alana göre veya floresan mikroskopi yapılabilir. Kene cesaret microbiota tespiti doğru eski benimsedik. Bu hangi baş bölgesi penetrasyon sabitleştirici ve hibridizasyon çözümleri başarılı olmadı izin kaldırıldı tüm keneler kullanarak bütün-mount situ hibridizasyon gerçekleştirmeye çalışır unutmamak gerekir. Burada açıklanan protokol disseke cesaret kullanır ve midgut23yılında bakteriyel kolonizasyon belirli kene proteinler etkilerini incelemek için uygulamaya konmuştur. WMISH elde edilen bilgilerle immünhistokimya için karşılaştırılabilir ama protein ve gen antikor üretimi veya protein ilgi gerektiren değil avantajı vardır. Genomik bilgi reaktifleri WMISH için oluşturmak yeterlidir. WMISH ve balık (floresans in situ hibridizasyon) gen ekspresyonu algılayabilir. Ancak, o bir enzimatik ve Kromojen tabanlı tahlil varlık nedeniyle, WMISH renk geliştirme aktif olarak takip edilebilir ve tepki kadar istenen sinyal devam etmek için izin ve hassasiyet elde avantajı vardır. Bu Otomasyon için tam mükellef ve yüksek üretilen iş biçimine kolayca ölçeklenebilir. Balık ve immünhistokimya aksine, hiçbir kesit gereklidir. WMISH balık üzerinde sadece 2 farklı mRNA'ların veya genlerin aynı anda ele alınması ve sondalar digoxigenin-UTP ve floresein-UTP28gibi farklı nükleotid analogları ile etiketlenmesi gerekir dezavantajdır. Balık ile en fazla 6 farklı mRNA'ların bir tahlil29incelenebilir. Her iki deneyleri karşılaştırılabilir zaman gerektirirken, floresan boyalar maliyetini chromogenic yüzeylerde daha yüksek. WMISH görüntü görselleştirme herhangi bir ışık mikroskobu ile yapılabilir süre balık deneyleri de floresan mikroskop görüntü görselleştirme için gerektirir.
Bu protokol yakından takip çok önemlidir; Ancak, özel dikkat gerektiren bazı adımlar vardır. Diseksiyon midgut doku zarar olmadan kene gelen bazı beceri gerektirir. Gruptakiler pratik ve yeterlik kazanmak için ilave keneler toplamak ihtiyatlı olabilir. Bireysel cesareti (Şekil 3) farklı divertikül içinde boyama heterojenite nedeniyle, bakteriyel bereket kesin kanıtlar türetmek için her gut tüm divertikül incelemek önemlidir. Varlığı, kayma dağıtım ve bereket farklı divertikül içinde belirli bakterilerin kesin bilgi elde etmek için deneysel her koşul için birkaç cesaret (en az 5) işlemek önemlidir. Yüksek kaliteli RNA probları üretiminde etkili doku boyama için önemlidir. Ayrıca o antisens sağlamak için klonlama vektör sonda şablonunda dizisi onaylamak çok önemlidir ve anlamda probları uygun şekilde üretilir. Bir üretken vitro transkripsiyon tepki yeterli şablonu DNA gerektirir; en az 100 ng-var olmak kullanılmış, ancak 0,5 - 1 µg en iyi sonda üretimi için tavsiye edilir.
Örnek sepetleri ve bu iletişim kuralı 24-şey levha boyama işlemi sırasında zarar en aza indirir her yıkama adımında doku doğrudan manipülasyonu önler. Ancak, örnekler hala zaman zaman kaybolması veya zarar görmesi; bağırsaklar dan tartılı veya 24h beslemeli keneler, özellikle, zor görmek ve örnek sepetleri için uzun vadeli bir saklama kabı aktarırken kaybetmek kolay. Bu örnekleri taşıma sırasında ek bakım alınmalıdır. Bu sınırlama nedeniyle, esas olarak 48 ve 72 h beslemeli kene cesaret kullandık. Bu zaman-puan (72 h uzun) bağırsağına kan yemek büyük miktarda varlığı boyama ve görselleştirme kan unu belirsiz arka plan nedeniyle etkilemektedir ve de bir sınırlama bu tekniğin sunar. Probları fluorescently etiketli kullanımı bu sorunu aşmak muhtemeldir.
Boyama yordam en önemli sağlam boyama ve düşük arka plan sinyal arasındaki dengeyi kurmak için olanıdır. İdeal renk geliştirme zamanlaması deneysel koşullarına bağlı olarak değişebilir. Böylece, oda sıcaklığında ve monitör renk gelişim yaklaşık her 30 dakika renk reaksiyonu gerçekleştirmek en iyisidir. Tepki de gecede 4 ° C renk geliştirme yavaşlatmaya devam etmek için ayarlanmış olabilir. Ancak, uzun süre devam Bu reaksiyon değil izin vermek için son derece önemlidir. Boyama reaksiyonu örneklere diseksiyon mikroskop altında incelenmesi gerekir bu yüzden göz göre izlemek zor olabilir. Bir mor renk örnekleri RNA minimal renk tutmak gerekir duygusu ile probed iken antianlamlı RNA ile probed örnekleri üzerinde görünür olmalıdır. RNA probed anlamda örnekleri parlak leke, sorun giderme adımlarını BM mor ile kuluçka süresini azaltmak ve engelleme zaman artan ile başlamalıdır. Bazen anlam probları antianlamlı probları göre anormal derecede yüksek arka plan neden olabilir; Bu gibi durumlarda, farklı bölgelerde genin RNA probları üretmek için dikkate alınması gerekebilir. Verilen örnekte temsil edilmeyen DNA dizileri de negatif kontrol probları oluşturmak için şablon olarak düşünülebilir. Örneğin, bir bölge kene genom veya onun microbiome temsil edilmeyen yeşil flüoresan protein kodlama DNA şablon-ebilmek var olmak kullanmak.
Bu teknik bir sınırlama analizi büyük ölçüde nitel olmasıdır; Ancak, görüntü analiz yazılımı (Tablo reçetesi) her örnek içinde boyama sinyal miktarını ölçmek için kullanılabilir. Bu bakteri türleri çeşitli deneysel koşullarda bolluk yarı kantitatif karşılaştırılması sağlayacak. Bu 3-4 gün tamamlamak için alır zaman alıcı bir iletişim kuralı olmakla birlikte, zahmetli değildir; Her gün eller sadece yaklaşık 3-5 h ortalama zamanı. Ancak, pek çok örnekleri örnek sepetleri ve sahipleri ile paralel işleme yeteneği yüksek üretilen iş analiz için izin verir. Ayrıca, bu işlem piyasada bulunan aletler kullanarak otomatik hale getirilebilir (malzemeler tablo) bu iletişim kuralı bir temel ve rutin bileşeni kullanarak araştırma laboratuvarı piyasada olması bekleniyor Eğer Otomasyon uyumlu platformlar (Tablo reçetesi) daha fazla uygulamalı süresini azaltın.
Açıklanan protokolü kullanarak parlak alan mikroskobu görüntüsü kolorimetrik bir sinyal üretimini sağlayan digoxygenin etiketli probları kullanır. Bir chromogenic substrat melezleşmiştir RNA probları belirli bireysel hedefleri algılamak için kullanılan iken, sonda digoxigenin-UTP gibi farklı nükleotid analogları ile etiketleme tarafından aynı anda birden çok hedef algılamaya mümkündür ve Fluoresein-UTP ve farklı chromogenic yüzeylerde30. Doku örnekleri sonra sırayla digoxigenin ve iki adımı için farklı chromogenic tepkiler ile floresein karşı antikor alkalin fosfataz birleştiğinde ile inkübe. Bu teknik aynı zamanda daha yüksek çözünürlükte görüntüleme confocal mikroskobu31 kullanarak kolaylaştırmak ve farklı renklerde birden fazla probları paralel olarak kullanma seçeneği sağlar fluorescently etiketli probları için adapte olabilir. Bu teknik yalnızca özellikle birkaç mikroorganizmaların bir anda bir örnek olarak değerlendirebilirsiniz. Ancak, çeşitli örnekleri kene microbiota temsil birden fazla mikroorganizmaların adrese yüksek üretilen iş deneyleri içinde değerlendirilebilir.
Son olarak, bu teknik keneler ve onların ilişkili microbiota arasındaki etkileşimler incelenmesi için sınırlı değildir. Sonda tamamlayıcı kene genom içinde ilgi herhangi bir gen için oluşturulan ve bolluk ve yerelleştirme belirli genlerin farklı dokularda incelemek için kullanılan. Kene tükürük bezleri de işlenen ve benzer şekilde gut için analiz edilebilir. Genel olarak, bu teknik mikrobiyal topluluklar diğer eklem bacaklılar hastalık vektör ilgi içinde dinamikleri üzerinde uyum çalışmaları için geniş potansiyele sahiptir.

İnsan ve hayvan patojenler eklem bacaklılar vektörel çizimler tarafından aktarılan dünya çapında bulunur ve bulaşıcı hastalıklar yaklaşık % 20 genel olarak1, ama etkili hesap ve çoğu bu patojenlerin karşı güvenli aşı mevcut değildir. Oransal ve hemen hemen tüm metazoans3 sağlık şekillendirme ve microbiome2, topluca bilinen komensal, simbiyotik ve patojen mikroorganizmaların önemli rol anlayışımızı genişletiyor. Şimdi eklem bacaklılar vektörel çizimler patojenlerin Ayrıca gut microbiota liman ve çeşitli vektör kaynaklı patojenler4,5etkilemek için bu vektör ilişkili microbiota gösterilmiştir açıkça anlaşılmaktadır. Eklem bacaklılar microbiome eubacteria, Arkeler, virüsler, ökaryotik mikroplar gibi tek hücreli, nematodlar ve mantarlar6oluşur. Ancak, baskın araştırma odak eubacteria üzerinde nedeniyle, kısmen, işaretleyici genler ve belirli bakteriyel üyelerini tanımlamak için başvuru veritabanları kullanılabilirliğini olmuştur.
Ixodes scapularis, kene vektör Borrelia burgdorferi7, de dahil olmak üzere birden çok insan patojenlerin ile bir odak hastalığının Lyme hastalığı, bir mikrobiyal görselleştirme teknik optimizasyonu amaçlı yapıldı. kene gut microbiota vektör-patojen etkileşimleri bağlamında anlayışımızı geliştirmek. Kene microbiome alanında cevaplanması gereken birkaç soru kalır. Gut kene ve yatay olarak aktarılan patojenler bağlamında gelen patojen arasındaki ilk genişletilmiş karşılaşma sitesidir; Bu nedenle, vektör vektör-patojen etkileşimleri oransal olarak gut microbiota rolünün anlaşılması anlamlı yorumlara ortaya çıkaracaktır. Kene kan yemek sindirim, burada kan yemek bileşenleri alır işlenmesi intracellularly8yer benzersiz bir moduna sahip. Gut lümen görünüşte kene beslemeleri kan yemek içerecek bir gemi olarak hizmet vermektedir ve besin sindirim ve asimilasyon besleme birkaç gün doğmak ve sonrası repletion devam etmek. Kene tarafından besleme sırasında alınan patojenler gut lümen bloodmeal ile birlikte girin ve böylece lümen kene, patojen ve ikamet microbiota arasındaki etkileşimlerin birincil bir site olur. Sindirim repletion ve deri değiştirme iksodid kene ile devam ederken, gut yapısal ve işlevsel değişiklikler9uğrar. Kompozisyon ve gut bakteri mekansal organizasyonu değişen gut çevre ile uyum içinde değişebilir olasılığı mevcuttur. Bu, bu nedenle, yerleşik bakteri tamamen kene, patojen ve gut microbiota etkileşimi anlamak için kene gut mimarisini anlamak önemlidir.
Ana bilgisayar ilişkili microbiota rutin olarak açıklamak için moleküler teknikleri yükseltmek ve bakteriyel 16S ribozomal DNA (rDNA) sıra ile yüksek-den geçerek paralel sıralama stratejileri10 kullanmaktadır. Bu sıralama stratejileri aşmak gerek axenic belirli bakteri kültürleri elde etmek ve tüm bakteriyel Üyeler örnek temsil ayrıntılı bir açıklamasını sağlar. Yine de, bu stratejileri bona fide sakinleri çevre contaminations ayırt etmek için yetersizlik tarafından şaşırmış. Ayrıca, örnekleri, keneler, küçük içinde büyüklük ve bu nedenle düşük microbiota özgü DNA içeren gibi değerlendirmek verir, çevre kirletici amplifikasyon olasılığı artan11 olduğunu ve belirsiz yorumlanmasında sonuçları microbiome kompozisyon. Bu nedenle, belirli uygun bakteri görselleştirme ile birlikte işlev karakterizasyonu tanımlamak ve kene microbiome geçici ve dağınık şekilde ayırt için önemli olacaktır. Bu hedef doğrultusunda, biz bütün Dağı RNA in situ hibridizasyon kullandı. Bu teknik gen ifade desenleri, organ ve embriyo12,13,-14 değerlendirmek için rutin olarak kullanılan ve ilgi tüm örnek ifade semiquantitative analiz sağlar. Bu doku bölümleri kullanmak ve genellikle kesitli malzeme tüm organları15ifadede tahmin etmek için sayısal bir derleme ile geniş Analizi gerektirir geleneksel in situ hibridizasyon teknikleri farklıdır. Burada bütün Dağı genelde bütün organizmalar12' ye anlamına gelir iken, Bütün Dağı bütün cesaret veya organları belirtir. Kene gut microbiota mimarisini değerlendirmek için bütün Dağı RNA in situ hibridizasyon yaklaşımı kullanmanın yararları kesişmeyi. Kene gut boyutu16' değişen her çifti, divertikül, 7 çiftlerinden oluşur. Eğer bu divertikül arasında herhangi bir kene biyoloji, bağlamında anladım değil işlevsel farklılıklar microbiota veya kene-patojen etkileşimleri kene. Gut divertikül rüptürü manipülasyonlar, gut microbiota gut lümen veya gevşek gut microbiota kayma lokalizasyonu yanlış yorumlanmasına sonucu ile ilişkili mevcut yerinden. RNA in situ hibridizasyon floresans etiketli daha önce kene gut transkript17 sabitleme ve bireysel gut divertikül sonda hibridizasyon, B. burgdorferi yerelleştirmek üzere açma incelemek için kullanıldığında vardır transkript parafin gömülü tüm keneler18kesit tarafından. Bu her iki yaklaşımın gut microbiota mimari etkilerdi hibridizasyon önce kene dokuların manipülasyon gerektirir.
Bu raporda, Bütün-mount situ hibridizasyon (WMISH) kullanarak uygun kene gut microbiota incelemek için iletişim kuralı biz ayrıntılı olarak tarif. Bütün Dağı RNA in situ hibridizasyon varlığı küresel bir anlayış ve belirli gut bakteri gut değişik bölgelerinde bolluk sağlar ve kene gut biyoloji patojen kolonizasyon bağlamında yeni görüşler teşvik ve iletim. Ayrıca, algılama kene gut uygun bakterilerin RNA probları karşı belirli bakteriyel RNA yönetmen kullanımına izin verir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1079px;" width="1079">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Sefar NITEX Nylon Mesh, 110 micron</td>
			<td style="width:220px;">Amazon</td>
			<td style="width:348px;">03-110/47</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">pGEM-T Easy Vector System</td>
			<td style="width:220px;">Promega</td>
			<td style="width:348px;">A1360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Digoxygenin-11-UTP</td>
			<td style="width:220px;">Roche</td>
			<td align="right" style="width:348px;">1209256910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">dNTP</td>
			<td style="width:220px;">New England Biolabs&#160;</td>
			<td style="width:348px;">N0447S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">DNAse I(RNAse-free)</td>
			<td style="width:220px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:348px;">M0303S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">HiScribe SP6 RNA synthesis kit</td>
			<td style="width:220px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:348px;">E2070S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit</td>
			<td style="width:220px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:348px;">E2040S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Water, RNase-free, DEPC-treated</td>
			<td style="width:220px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:348px;">AB02128-00500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">EDTA, 0.5M, pH 8.0</td>
			<td style="width:220px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:348px;">AB00502-01000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Formaldehyde, 37%</td>
			<td style="width:220px;">JT Baker</td>
			<td style="width:348px;">2106-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Formamide</td>
			<td style="width:220px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:348px;">AB00600-00500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">EGTA</td>
			<td style="width:220px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:348px;">E-4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">DPBS, 10X</td>
			<td style="width:220px;">Gibco</td>
			<td style="width:348px;">14300-075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Tween-20</td>
			<td style="width:220px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:348px;">P1379-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Proteinase K</td>
			<td style="width:220px;">Sigma Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:348px;">3115879001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Triethanolamine HCl</td>
			<td style="width:220px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:348px;">T1502-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Acetic anhydride</td>
			<td style="width:220px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:348px;">320102-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:220px;">ThermoScientific/Pierce</td>
			<td align="right" style="width:348px;">28906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">SSC, 20X</td>
			<td style="width:220px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:348px;">AB13156-01000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">RNA from torula yeast</td>
			<td style="width:220px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:348px;">R3629-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Heparin, sodium salt</td>
			<td style="width:220px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:348px;">H3393-10KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Denhardt&#39;s Solution, 50X</td>
			<td style="width:220px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:348px;">D2532-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">CHAPS hydrate</td>
			<td style="width:220px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:348px;">C3023-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">RNase A</td>
			<td style="width:220px;">Sigma Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:348px;">10109142001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">RNase T1</td>
			<td style="width:220px;">ThermoScientific&#160;</td>
			<td style="width:348px;">EN0541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Maleic acid</td>
			<td style="width:220px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:348px;">M0375-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Blocking reagent</td>
			<td style="width:220px;">Sigma Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:348px;">11096176001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments</td>
			<td style="width:220px;">Sigma Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:348px;">11093274910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Levamisol hydrochloride</td>
			<td style="width:220px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:348px;">31742-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:320px;">Chromogenic substrate for alkaline phosphatase</td>
			<td style="width:220px;">Sigma Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:348px;">11442074001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Bouin&#39;s solution</td>
			<td style="width:220px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:348px;">HT10132-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Hydrogen peroxide</td>
			<td style="width:220px;">Mallinkrodt Baker, Inc</td>
			<td style="width:348px;">2186-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Single stranded RNA ladder</td>
			<td style="width:220px;">Ambion -Millenium</td>
			<td style="width:348px;">AM7151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">&#160;#11 High-Carbon steel blades&#160;</td>
			<td style="width:220px;">C and A Scientific Premiere</td>
			<td style="width:348px;">#11-9411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Thermocycler</td>
			<td style="width:220px;">BioRad, CA</td>
			<td align="right" style="width:348px;">1851148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:220px;">ThermoScientific&#160;</td>
			<td style="width:348px;">NanoDrop 2000C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Orbital shaker</td>
			<td style="width:220px;">VWR</td>
			<td style="width:348px;">DS-500E Digital Orbital shaker</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Shaking water bath</td>
			<td style="width:220px;">BELLCO Glass, Inc</td>
			<td style="width:348px;">Hot Shaker-7746-12110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Gel&#160; documentation system</td>
			<td style="width:220px;">BioRad</td>
			<td style="width:348px;">Gel Doc XR+ Gel documentation system</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Bright-field Microscope&#160;</td>
			<td style="width:220px;">Nikon</td>
			<td style="width:348px;">NikonSM2745T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Bright-field Microscope&#160;</td>
			<td style="width:220px;">Zeiss</td>
			<td style="width:348px;">AXIO Scope.A1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Dissection microscope&#160;</td>
			<td style="width:220px;">Zeiss</td>
			<td style="width:348px;">STEMI 2000-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">&#160;Light box</td>
			<td style="width:220px;">VWR</td>
			<td style="width:348px;">102097-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">PCR purification kit&#160;</td>
			<td style="width:220px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:348px;">28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Image capture software</td>
			<td style="width:220px;">Zeiss</td>
			<td style="width:348px;">Zen lite</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Image editing software&#160;</td>
			<td style="width:220px;">Adobe&#160;</td>
			<td style="width:348px;">Adobe Photoshop CS4 version 11.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Image analysis software</td>
			<td style="width:220px;">National Institutes of Health</td>
			<td>ImageJ-NIH /imagej.nih.gov/ij/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;">Automation compatible instrumentation</td>
			<td style="width:220px;">Intavis Bioanalytical Instruments, Tubingen, Germany).&#160;</td>
			<td style="width:348px;">Intavis, Biolane HT1.16v</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of microbiota in tick guts by whole-mount in situ hybridization

Bulaşıcı hastalıklar eklem bacaklılar vektörel çizimler tarafından iletilen insan sağlığı dünya çapında önemli bir tehdit devam. Bu hastalıklar neden patojenleri yok yalıtım modunda vektör kolonize zaman; Bunun yerine, onlar büyük olasılıkla etkileşimleri gut lümen içinde ikamet mikroorganizmalar ile meşgul. Vektör microbiota patojen iletim birkaç vektör kaynaklı hastalıklar için önemli bir rol oynamak için kanıtlanmıştır. Ixodes scapularis kene, Borrelia burgdorferi, dahil olmak üzere birçok insan patojenleri vektör gut yerleşik bakteri kene iletim patojenlerin etkisi olup olmadığını tespit değil. Biz yöntemleri olası türler arası etkileşimler kene gut daha iyi anlaşılmasını kolaylaştırmak için kene gut ile ilişkili bakteriler bileşimi karakterize için gerektirir. Bütün Dağı in situ kullanarak özellikle bakteriyel tür ile ilişkili RNA transkript görselleştirmek için hibridizasyon bereket ile ilgili nitel veri toplama ve sağlam doku microbiota dağıtımını sağlar. Bu teknik değişiklikler gut microbiota ortamında besleme kene boyunca incelemek için kullanılan ve kene genlerin ifade analiz etmek için de uygulanabilir. Bütün kene boyama hedef RNA dokusunda üç boyutlu yeniden yapılandırma için gerek kalmadan brüt mekansal dağılımı hakkında verim bilgi cesaret ve kez sıralama tabanlı zihnimi karıştıran çevresel kirlenme tarafından daha az etkilenir karmaşık mikrobiyal topluluklar çalışma için sık kullanılan bir yöntem. Genel olarak, bu tekniği daha iyi kullanılabilmesi için değerli bir araç vektör-patojen-microbiota etkileşimleri ve hastalık iletim içindeki rolü anlamak olduğunu.

Ölçüm ve RNA probları kalitesinin tahmini boyama başlamadan önce kritik öneme sahiptir. Vitro transkripsiyon verimliliği yüksek miktar ve kalite meydana bağlıdır. Biz düzenli olarak RNA probları saflık ve sonda transkripsiyon reaksiyonlar tarafından oluşturulan miktarı doğrulamak için bir formaldehit jel üzerinde görüntülenir. Sondalar parlak, ayrı gruplar (Şekil 2) görünmesi gerekir. RNA konsantrasyon spektrofotometrik ölçümler jel bands görünümü ile de son derece sonda kalite göstergesidir ve ilişkili idi. Böylece, jel görselleştirme adım protokol ile aşinalık elde sonra istenirse atlanabilir. Her iki durumda da yeterli RNA yüksek kalitede üretilen tüm akış yönündeki adımlar sondalar sağlamlık bağlıdır gibi emin olmak önemlidir.
Bu teknik gücü varlığı ya da yokluğu bakteriyel türler, bereket kene akışları olarak zamanla bakterilerin ve yerelleştirme türlerin bütün doku içinde değişiklikler de dahil olmak üzere kene microbiota hakkında geniş gözlemler kolaylaştırmak olduğunu. Bu nedenle, iyisi ortalama bir fikir edinmek için koşul başına en az beş cesaret leke tutar ve dağıtım boyama içinde biraz değişme miktarı normal biyolojik çoğaltır arasında yanı sıra bireysel cesaret ister (Şekil 3), divertikül 7 çiftleri arasında boyama desen. Protokol genel başarısı her koşul için anlam ve antisens örnekleri boyama karşılaştırarak en iyi ölçülür. Anlamda örnekleri, analiz, bu tür için önemli negatif denetimleri mor renk (Şekil 4) için en az olmalıdır. Diğer taraftan, antianlamlı örnekleri hangi yoğunluğunu hedeflenmiş belirli bakteriyel transkript bereket on bağlı olacaktır en az arka plan ile sağlam boyama görüntülenmelidir. Boyama desen doku içinde de bu parametrelere göre değişir. Önemlisi, anlam ve antianlamlı örnekleri aynı süre için doğrudan bu örnekler paralel işlenmesi bu yüzden onları karşılaştırmak için geliştirilmelidir. Overdevelopment renk tepki arka plan boyama, anlam örnekleri antisens (Şekil 5) benzer başladığı yüksek miktarda neden olabilir. Gerçekleştiği bir kez tepki ters yolu olarak belirli iletişim kuralı bu aşamada overstaining, önlemek için özen gösterilmelidir.
Tüm cesaret tamamen her reaktif her adımı sırasında batık emin olmak önemlidir; değişim örnekleri arasında bir artış reaktifler düzensiz maruz olabilir. Tutarı zaman cesaret toplanan önce keneler beslenir da sonuçları üzerinde önemli bir etkisi vardır. Tartılı veya sadece 24 saat beslenir keneler ile çalışmak zor; cesareti vardı da daha kolayca zarar görebilir ve leke değil de (Şekil 6) ve bu yaklaşım şu anda bir kısıtlamadır. 48-72 saat için bu cesur cesaret için 24 h cesaret için daha sonra zaman puan beslenen keneler üzerinden karşılaştırıldığında daha büyük boyutu nedeniyle çalışmak en kolay beslenen keneler da büyük olasılıkla daha sonraki aşamaları o sırasında bakteriyel yük artışlar nedeniyle 24 h beslemeli keneler daha iyi lekeli f besleme. 72-h doku kez kan gelen kahverengi renk tonu hafif bir arka plan vardı ama mor boyama renk tonu (Şekil 4) üzerinde açıkça görülebiliyordu. Cesaretin en iyi düşük büyütmede (5 X veya 10 X) bir alan parlak mikroskop kullanarak tüm doku arasında boyama desenleri görüntülemek için görüntülenebilir. Bütün-dağ dokusu yüksek büyütmede gibi petrol amaç, X 63 görüntüleme amacı karşı slayt tuşuna basın ve doku örnekleri kalınlığı nedeniyle sıkıştırmak gibi doku zarar riski çalışır. Daha yüksek kararlılık düşsel isterseniz, doku kesit için potansiyel incelenmesi gerekir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57758/57758fig1.jpg"> Resim 1 . Sonda üretimi için şablon hazırlanması şematik. 16S rRNA amplicon T7 ve Sp6 Rehberleri içeren vektör klonlama bir TA kopyalayın. Siteleri bir veya b vitro transkripsiyon T7 veya Sp6 organizatörü duygusu veya antisens probları sırasıyla üretmek için kullanma için kesmek için enzimleri kullanarak yapı linearize. <a href="/files/ftp_upload/57758/57758fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57758/57758fig2.jpg"> Resim 2 . RNA yoklama jel elektroforez ile görselleştirme. RNA problar (~ 700 ng) UV ışık altında görüntülenir ve ticari bir jel görüntüleme sistemi kullanarak yansıma bir formaldehit özel jel, electrophoresed. Bir temsilci kaliteli, lane 1; ve kalitesiz RNA prob, lane 2.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57758/57758fig3.jpg"> Şekil 3 . 48 h beslemeli cesaret bütün-mount situ hibridizasyon temsilcisi bir bakış. Cesaret keneler üzerinden beslenen 48 h antisens RNA ile bir korunmuş 16S ribozomal RNA dizisine tamamlayıcı lekeli fark gut divertikül boyama gösterir. Ölçek çubuğu temsil eden 200 µm. <a href="/files/ftp_upload/57758/57758fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57758/57758fig4.jpg"> Şekil 4 . Başarılı temsilcisi görüntüleri tüm- in situ hibridizasyon Ixodes scapularis cesaret içinde monte edin. Belirtilen süreyi için beslenen keneler gelen cesaret lekeli her iki anlamda (negatif kontrol) kullanarak veya antisens RNA sondalar. Antianlamlı probları korunmuş 16S ribozomal RNA dizisi (Evrensel 16S) veya belirli bir bakteriyel cins (belirtildiği gibi) belirli bir 16S RNA dizisi için tamamlayıcı. Enterokok değil sağlam 48 h'de ölçek çubukları temsil 140 µm. boyama verim <a href="/files/ftp_upload/57758/57758fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57758/57758fig5.jpg"> Şekil 5 . Uzun süreli chromogenic reaksiyon zamanı yol non-spesifik boyama için. Bağırsaklar için 48 h beslenen keneler üzerinden bir anlamda RNA sonda veya bir antianlamlı sonda bir korunmuş 16S RNA dizisine tamamlayıcı probed. Doku reaksiyonu durdurmadan önce alkalen fosfataz substrat BM gecede 4 ° C'de ve oda sıcaklığında yaklaşık 4 h için mor ile inkübe. Ölçek çubukları temsil 140 µm. <a href="/files/ftp_upload/57758/57758fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57758/57758fig6.jpg"> Şekil 6 . Bütün-mount situ hibridizasyon tartılı kullanarak veya 24 h beslenen kene cesaret. Cesaret tartılı veya 24 h beslemeli keneler üzerinden lekeli anlamda RNA problar kullanarak veya antisens probları korunmuş 16S RNA dizisi veya cins için belirli bir sıra için tamamlayıcı Rickettsia'nin. Antianlamlı örnekleri boyama sonraki zaman noktalarda gözlenen daha az sağlam ve cesareti de daha kolayca zarar görebilir. Ölçek çubukları temsil 60 µm. <a href="/files/ftp_upload/57758/57758fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Adı</td>
			<td>Son konsantrasyonları</td>
			<td>Son pH</td>
			<td>Depolama notlar</td>
		</tr>
<tr>
<td>MEMFA</td>
			<td>0,1 M BEZLERİ</td>
			<td>-</td>
			<td>Oda sıcaklığında</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>2 mM EGTA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>1 mM magnezyum sülfat</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>%3.7 formaldehit</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS-ara (PTw)</td>
			<td>1 x PBS, % 0,1 ara-20</td>
			<td>7.0</td>
			<td>Oda sıcaklığında</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>% 0.1 ara-20</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Trietanolamin arabellek</td>
			<td>1 x PBS</td>
			<td>7.0-8.0</td>
			<td>Oda sıcaklığında</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>0,1 M trietanolamin</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Hibridizasyon arabellek</td>
			<td>% 50 formamide</td>
			<td>-</td>
			<td>-20 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>5 x SSC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>1 mg/mL Torula RNA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>100 µg/mL heparin</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Denhart'ın çözüm x 1</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>% 0.1 ara-20</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>%0.1 DERİ PANTOLON</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>10 mM EDTA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Maleik asit tampon (MAB)</td>
			<td>100 mM Maleik asit</td>
			<td>7.0</td>
			<td>Oda sıcaklığında</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>150 mM sodyum klorür</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Alkalen fosfataz (AP) arabellek</td>
			<td>100 mM Tris</td>
			<td>9.5</td>
			<td>-20 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>50 mM magnezyum klorür</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>100 mM sodyum klorür</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>% 0.1 ara-20</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>5 mM levamisol</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Çamaşır suyu çözüm</td>
			<td>%1 hidrojen peroksit</td>
			<td>-</td>
			<td>Taze hazırlamak</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>%5 formamide</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>0,5 x SSC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1. Yemek tarifleri iletişim kuralında kullanılan çözümler.

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization at JoVE.com

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Kene bağırsaklar tarafından bütün-mount Situ hibridizasyon Microbiota görselleştirme

Burada, dağınık şekilde ve geçici kene cesaret bir değiştirilmiş bütün-mount In situ hibridizasyon yaklaşım kullanarak uygun microbiota varlığı değerlendirmek için bir protokol mevcut.

Infectious diseases transmitted by arthropod vectors continue to pose a significant threat to human health worldwide. The pathogens causing these ...

visualization-microbiota-tick-guts-whole-mount-situ

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

9.5K Görüntüleme.  Yale University School of Medicine. Burada, dağınık şekilde ve geçici kene cesaret bir değiştirilmiş bütün-mount In situ hibridizasyon yaklaşım kullanarak uygun microbiota varlığı değerlendirmek için bir protokol mevcut.

Video: Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and transmitted from one generation to the next through the female oocyte is of fundamental importance. Because of the genetic tractability, and the elegant, ordered simplicity by which oocyte development proceeds, Drosophila oogenesis has become an invaluable system for mitochondrial study. An EdU (5-ethynyl-2&#180;-deoxyuridine) labeling method was utilized to detect mitochondrial DNA (mtDNA) replication in Drosophila ovaries. This method is superior to the BrdU (5-bromo-2'-deoxyuridine) labeling method in that it allows for good structural preservation and efficient fluorescent dye penetration of whole-mount tissues.
Here we describe a detailed protocol for labeling replicating mitochondrial DNA in Drosophila adult ovaries with EdU. Some technical solutions are offered to improve the viability of the ovaries, maintain their health during preparation, and ensure high-quality imaging. Visualization of newly synthesized mtDNA in the ovaries not only reveals the striking temporal and spatial pattern of mtDNA replication through oogenesis, but also allows for simple quantification of mtDNA replication under various genetic and pharmacological perturbations.

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

Drosophila oogenesis continues to be exceptionally useful in the study of mitochondrial proliferation and inheritance. This manuscript describes a detailed protocol used to label the replicating mitochondrial DNA (mtDNA) in Drosophila adult ovaries with 5-ethynyl-2&#180;-deoxyuridine (EdU), which facilitates uncovering mechanisms associated with mitochondrial inheritance that were previously debatable.

Edu Boyama tarafından Drosophila Yetişkin Yumurtalıkların Mitokondriyal DNA replikasyonu Yerinde Etiketlenmesi içinde

The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and ...

Genetik

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most mutagenesis-based screens, researchers have relied on the use of toxic chemicals, carcinogens, or irradiation, which requires designated equipment, safety setup, and/or disposal of hazardous materials. We have developed a simple approach to induce heritable mutations in C. elegans using germline-expressed histone-miniSOG, a light-inducible potent generator of reactive oxygen species. This mutagenesis method is free of toxic chemicals and requires minimal laboratory safety and waste management. The induced DNA modifications include single-nucleotide changes and small deletions, and complement those caused by classical chemical mutagenesis. This methodology can also be used to induce integration of extrachromosomal transgenes. Here, we provide the details of the LED setup and protocols for standard mutagenesis and transgene integration.

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Genetically-encoded histone-miniSOG induces genome-wide heritable mutations in a blue&#160;light-dependent manner. This mutagenesis method is simple, fast, free of toxic chemicals, and well-suited for forward genetic screening and transgene integration.

Histon-miniSOG Kullanılan optogenetic rastgele mutagenez<em&gt; C. elegans</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization (mFISH) and Spectral Karyotyping (SKY) in Irradiated Mice

Ionizing radiation (IR) induces numerous stable and unstable chromosomal aberrations. Unstable aberrations, where chromosome morphology is substantially compromised, can easily be identified by conventional chromosome staining techniques. However, detection of stable aberrations, which involve exchange or translocation of genetic materials without considerable modification in the chromosome morphology, requires sophisticated chromosome painting techniques that rely on in situ hybridization of fluorescently labeled DNA probes, a chromosome painting technique popularly known as fluorescence in situ hybridization (FISH). FISH probes can be specific for whole chromosome/s or precise sub-region on chromosome/s. The method not only allows visualization of stable aberrations, but it can also allow detection of the chromosome/s or specific DNA sequence/s involved in a particular aberration formation. A variety of chromosome painting techniques are available in cytogenetics; here two highly sensitive methods, multiple fluorescence in situ hybridization (mFISH) and spectral karyotyping (SKY), are discussed to identify inter-chromosomal stable aberrations that form in the bone marrow cells of mice after exposure to total body irradiation. Although both techniques rely on fluorescent labeled DNA probes, the method of detection and the process of image acquisition of the fluorescent signals are different. These two techniques have been used in various research areas, such as radiation biology, cancer cytogenetics, retrospective radiation biodosimetry, clinical cytogenetics, evolutionary cytogenetics, and comparative cytogenetics.

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization mFISH and Spectral Karyotyping SKY in Irradiated Mice

The present protocol describes the usefulness of multiple fluorescence in situ hybridization (mFISH) and spectral karyotyping (SKY) in identifying inter-chromosomal stable aberrations in the bone marrow cells of mice after exposure to total body irradiation.

Çoklu Floresan Inter-kromozomal Kararlı sapmaları Algılama<em&gt; In Situ</em&gt; Hibridizasyon (mFISH) ve ışınlanmış Farelerde Spektral Karyotipik (SKY)

Ionizing radiation (IR) induces numerous stable and unstable chromosomal aberrations. Unstable aberrations, where chromosome morphology is substantially ...

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting mutant alleles reside at their endogenous genomic sites and no exogenous DNA sequences are left in the genome following the procedure. Since in haploid yeast cells each of the four core histone proteins is encoded by two non-allelic genes with highly homologous open reading frames (ORFs), targeting mutagenesis specifically to one of two genes encoding a particular histone protein can be problematic. The strategy we describe here bypasses this problem by utilizing sequences outside, rather than within, the ORF of the target genes for the homologous recombination step. Another feature of this system is that the regions of DNA driving the homologous recombination steps can be made to be very extensive, thus increasing the likelihood of successful integration events. These features make this strategy particularly well-suited for histone gene mutagenesis, but can also be adapted for mutagenesis of other genes in the yeast genome.

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

A strategy for generating mutations in histone genes at their endogenous location in Saccharomyces cerevisiae is presented.

Hedeflenen<em&gt; In situ</emBudding Maya&gt; Mutajenezis Histon ve Genler

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting ...

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of tissues, we have developed numerous modifications and improvements to our original fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol. To facilitate throughput and cost effectiveness, all steps, from probe generation to signal detection, are performed using exon 96-well microtiter plates. Digoxygenin (DIG)-labelled antisense RNA probes are produced using either cDNA clones or genomic DNA as templates. After tissue fixation and permeabilization, probes are hybridized to transcripts of interest and then detected using a succession of anti-DIG antibody conjugated to biotin, streptavidin conjugated to horseradish peroxidase (HRP) and fluorescently conjugated tyramide, which in the presence of HRP, produces a highly reactive intermediate that binds to electron dense regions of immediately adjacent proteins. These amplification and localization steps produce a robust and highly localized signal that facilitates both cellular and subcellular transcript localization. The protocols provided have been optimized to produce highly specific signals in a variety of tissues and developmental stages. References are also provided for additional variations that allow the simultaneous detection of multiple transcripts, or transcripts and proteins, at the same time.

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

The described RNA in situ hybridization protocol allows the detection of RNA in whole Drosophila embryos or dissected tissues. Using 96-well microtiter plates and tyramide signal amplification, transcripts can be detected at high resolution, sensitivity, and throughput, and at a relatively low cost.

Yüksek çözünürlüklü Floresan Situ hibridizasyon Drosophila embriyo ve Tyramide sinyal güçlendirme kullanarak doku

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect and count individual RNA molecules. Complementary to deep sequencing-based methods, smFISH provides information about the cell-to-cell variation in transcript abundance and the subcellular localization of a given RNA. Recently, we have used smFISH to study the expression of the gene&#160;NDC80&#160;during meiosis in budding yeast, in which two transcript isoforms exist and the short transcript isoform has its entire sequence shared with the long isoform. To confidently identify each transcript isoform, we optimized known smFISH protocols and obtained high consistency and quality of smFISH data for the samples acquired during budding yeast meiosis. Here, we describe this optimized protocol, the criteria that we use to determine whether high quality of smFISH data is obtained, and some tips for implementing this protocol in&#160;other yeast strains and growth conditions.

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

This single molecule fluorescence in situ hybridization protocol is optimized to quantify the number of RNA molecules in budding yeast during vegetative growth and meiosis.

Tek molekül floresans In Situ hibridizasyon (smFISH) analizi Budding Maya bitkisel büyüme ve mayoz

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell type-specific fashion. AS expression patterns are typically analyzed by RT-PCR and RNA-seq using RNA samples isolated from a population of cells. In situ examination of AS expression patterns for a particular biological structure can be carried out by RNA in situ hybridization (ISH) using exon-specific probes. However, this particular use of ISH has been limited because alternative exons are generally too short to design exon-specific probes. In this report, the use of BaseScope, a recently developed technology that employs short antisense oligonucleotides in RNA ISH, is described to analyze AS expression patterns in mouse brain sections. Exon 23a of neurofibromatosis type 1 (Nf1) is used as an example to illustrate that short exon-exon junction probes exhibit robust hybridization signals with high specificity in RNA ISH analysis on mouse brain sections. More importantly, signals detected with exon inclusion- and skipping-specific probes can be used to reliably calculate the percent spliced in values of Nf1 exon 23a expression in different anatomical areas of a mouse brain. The experimental protocol and calculation method for AS analysis are presented. The results indicate that BaseScope provides a powerful new tool to assess AS expression patterns in situ.

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

An in situ hybridization (ISH) protocol that uses short antisense oligonucleotides to detect alternative pre-mRNA splicing patterns in mouse brain sections is described.

Kantitatif analiz alternatif Pre-mRNA RNA In Situ hibridizasyon tahlil kullanarak fare beyin bölümlerde Uçbirleştirme

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

micro-RNAs (miRNAs) are single-stranded RNA transcripts that bind to messenger RNAs (mRNAs) and inhibit their translation or promote their degradation. To date, miRNAs have been implicated in a large number of biological and disease processes, which has signified the need for the reliable detection methods of miRNA transcripts. Here, we describe a detailed protocol for digoxigenin-labeled (DIG) Locked Nucleic Acid (LNA) probe-based miRNA detection, combined with protein immunostaining on mouse heart sections. First, we performed an in situ hybridization technique using the probe to identify miRNA-182 expression in heart sections from control and cardiac hypertrophy mice. Next, we performed immunostaining for cardiac Troponin T (cTnT) protein, on the same sections, to co-localize miRNA-182 with the cardiomyocyte cells. Using this protocol, we were able to detect miRNA-182 through an alkaline phosphatase based colorimetric assay, and cTnT through fluorescent staining. This protocol can be used to detect the expression of any miRNA of interest through DIG-labeled LNA probes, and relevant protein expression on mouse heart tissue sections.

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

micro-RNAs (miRNAs) are short and highly homologous RNA sequences, serving as post-transcriptional regulators of messenger RNAs (mRNAs). Current miRNA detection methods vary in sensitivity and specificity. We describe a protocol that combines in situ hybridization and immunostaining for concurrent detection of miRNA and protein molecules on mouse heart tissue sections.

Doku özgü miRNA ifade profil oluşturma In Situ hibridizasyon fareyle kalp bölümleri içinde

micro-RNAs (miRNAs) are single-stranded RNA transcripts that bind to messenger RNAs (mRNAs) and inhibit their translation or promote their degradation. To ...

Raising the Mexican Tetra Astyanax mexicanus for Analysis of Post-larval Phenotypes and Whole-mount Immunohistochemistry

River and cave-adapted populations of Astyanax mexicanus show differences in morphology, physiology, and behavior. Research focused on comparing adult forms has revealed the genetic basis of some of these differences. Less is known about how the populations differ at post-larval stages (at the onset of feeding). Such studies may provide insight into how cavefish survive through adulthood in their natural environment. Methods for comparing post-larval development in the laboratory require standardized aquaculture and feeding regimes. Here we describe how to raise fish on a diet of nutrient-rich rotifers in non-recirculating water for up to two-weeks post fertilization. We demonstrate how to collect post-larval fish from this nursery system and perform whole-mount immunostaining. Immunostaining is an attractive alternative to transgene expression analysis for investigating development and gene function in A. mexicanus. The nursery method can also be used as a standard protocol for establishing density-matched populations for growth into adults.

Raising the Mexican Tetra Astyanax mexicanus for Analysis of Post-larval Phenotypes and Whole-mount Immunohistochemistry

In this protocol, we demonstrate how to breed Astyanax mexicanus adults, raise the larvae, and perform whole-mount immunohistochemistry on post-larval fish to compare the phenotypes of surface and cave morphotypes.

Meksika Tetra Astyanax mexicanus analiz Post-larval fenotipleri ve bütün Dağı immünhistokimya için yetiştirme

River and cave-adapted populations of Astyanax mexicanus show differences in morphology, physiology, and behavior. Research focused on comparing adult ...

Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives each year. Effective treatment options able to halt disease progression are lacking. Despite the extensive sequencing efforts in large patient populations, the majority of ALS and PD cases remain unexplained by genetic mutations alone. Epigenetics mechanisms, such as the post-translational modification of histone proteins, may be involved in neurodegenerative disease etiology and progression and lead to new targets for pharmaceutical intervention. Mammalian in vivo and in vitro models of ALS and PD are costly and often require prolonged and laborious experimental protocols. Here, we outline a practical, fast, and cost-effective approach to determining genome-wide alterations in histone modification levels using Saccharomyces cerevisiae as a model system. This protocol allows for comprehensive investigations into epigenetic changes connected to neurodegenerative proteinopathies that corroborate previous findings in different model systems while significantly expanding our knowledge of the neurodegenerative disease epigenome.

This protocol outlines experimental procedures to characterize genome-wide changes in the levels of histone post-translational modifications (PTM) occurring in connection with the overexpression of proteins associated with ALS and Parkinson&#39;s disease in Saccharomyces cerevisiae models. After SDS-PAGE separation, individual histone PTM levels are detected with modification-specific antibodies via Western blotting.

Histon translasyonel modifikasyon değişiklikler Maya nörodejeneratif Proteinopathy modellerinde karakterize

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives ...