Il lavoro è stato supportato dal premio numero P30DK056336 da nazionale Istituto di diabete e digestivo e rene malattie attraverso una sovvenzione pilota dalla nutrizione e obesità Research Center presso la University of Alabama a Birmingham per NCR.

Il REQS consiste di un'unità di Drosophila Activity Monitor (per informazioni di origine, vedere Tabella materiali) montato su un braccio rotante che è controllato da un gruppo motore (Figura 1). Monitor attività determina la frequenza in un determinato intervallo di tempo la matrice di raggi laser al centro del tubo dosaggio di dissezione è interrotta. Per le illustrazioni dettagliate e una caratterizzazione approfondita, vedere la nostra precedente pubblicazione9. Mentre il nostro sistema utilizza l'unità di LAM25H, il REQS può essere modificato per accogliere anche altre unità di Drosophila Activity Monitor.
1. Verifica dell'installazione della REQS
<ol><li>Test di carico mosche in provette di vetro da anestetizzare gli animali con CO2 o altro metodo scelto per movimentazione, spostandoli nelle provette vuote e i tubi di tappatura.</li>
	<li>Inserire provette di vetro rinforzata negli slot dell'unità monitor attività. Fissare i tubi utilizzando gomma O-ring (17-18 gauge) e/o bande di gomma su entrambi i lati dell'unità per garantire i tubi non si muovono durante la rotazione:<ol>
<li>Infilare un o-ring la provetta del campione e posizionare l'o-ring vicino il punto centrale del tubo. Inserire la provetta del campione in un alloggiamento del monitor attività dalla parte anteriore e centrarlo.</li>
		<li>Spostare l'o-ring come necessario e garantire che, una volta la provetta del campione è centrata, l'o-ring è scivolata come vicino all'unità di monitoraggio di attività possibili. Fissare la provetta del campione di scivolare un secondo o-ring del tubo di vetro dal retro, spostare nuovamente l'o-ring come vicino all'unità di monitoraggio di attività possibili.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Avviare la rotazione della REQS spostando l'interruttore di alimentazione sulla parte anteriore dell'unità. Regolare la velocità di rotazione con la manopola sulla parte anteriore dell'unità per la velocità desiderata (4 rpm (giri al min) in questo esempio). Nota: La velocità di rotazione in questo esempio è stato scelto per abbinare un studio precedentemente pubblicato7. Come diverse velocità di rotazione si tradurrà in livelli differenti attività degli animali, quando si inizia un nuovo studio, ottimizzazione della velocità di rotazione per lo specifico set-up sperimentale (genotipo, la durata del periodo di esercizio, ecc.) può essere necessario. Nota: È importante per assicurarsi che i tubi siano correttamente posizionati affinché essi non trascinare lungo la parte inferiore dell'unità REQS durante la rotazione.</li>
	<li>Testare la connessione al sistema di raccolta di dati fornito con l'unità di Drosophila Activity Monitor aprendo il software DAMSystem308 e garantire che la luce di connessione rimane verde per varie rotazioni. Il software inizierà registrazione dati in un file di testo "monitorX" (X è il numero di unità se si utilizzano più monitor) immediatamente all'atto dell'apertura. Frequenza di registrazione può essere regolato nella scheda "Preferenze"; registriamo in genere in intervalli di 5 min.</li>
	<li>Esaminare il file di testo generato dal software DAMSystem308 per garantire che la connessione dati funziona correttamente. Problemi con la connessione causare ritagli, punti di tempo dove 0 attività viene registrata per tutte le posizioni nel REQS (Vedi Risultati rappresentante e tabella 2). Se si verificano ritagli, regolare le connessioni dati che porta alla presa del telefono rotante, come durante la rotazione, questa connessione può diventare sciolti o intrecciati. Troviamo che stabilizzare la connessione con nastro aiuta a prevenire questo problema.</li>
</ol>2. preparazione degli animali
Nota: Tutti gli animali erano sollevati e testati in condizioni standard in un'incubatrice (25 ° C, umidità 60-70%, ciclo luce/buio di 12 h) su melassa/farina di mais media10.
<ol><li>Due settimane prima dell'esperimento previsto, impostare fiale con densità degli animali è controllata per raccogliere le mosche sperimentale da; in genere abbiamo istituito fiale con 7 maschi e 10 femmine. Con uno stock sano, da un singolo flaconcino, circa 15 vergini maschi e 15 femmine possono essere raccolti nel corso di un periodo di 4 giorni. Regolare il numero di flaconcini impostare basato sul numero di animali necessari per l'analisi; un dosaggio tipico nel nostro laboratorio include 10 insiemi di 10 vergini maschi e femmine per genotipo (100 maschi e 100 femmine). Nota: Non-Vergine mosche possono essere utilizzati a seconda la domanda specifica che sperimentale. Se conducendo esperimenti a lungo termine con gli animali non-vergine, striscianti larve possono interferire con accurata attività di monitoraggio.</li>
	<li>Rimuovere le mosche di padre una settimana dopo aver impostato le fiale.</li>
	<li>A partire dal giorno 10 dopo l'impostazione le fiale, raccogliere mosche Vergine dai flaconcini e archiviarli separati per sesso.</li>
	<li>Raccogliere gli animali sufficienti per l'esperimento e l'età loro come necessario, in questo esempio 3 giorni. Nota: Abbiamo in genere anestetizzare gli animali con CO2 per la movimentazione. CO2 è conosciuto per influenzare i livelli di attività degli animali per lunghi periodi di tempo dopo il trattamento (ad esempio, Vedi Bartolomeo et al 201511). Se l'effetto di2 CO interferisce con saggi a valle previsti o analisi, utilizzare un metodo diverso anestesia come amputate di ghiaccio.</li>
</ol>3. raccolta dei dati con il Rich
<ol><li>Anestetizzare gli animali da utilizzare per lo studio di quantificazione di esercizio con CO2 o un altro metodo di anestesia. Dividerli in gruppi secondo le necessità e caricare i gruppi di animali in tubi di vetro vuota di activity monitor; in questo esempio, 10 animali della stessa età sono caricati al tubo di vetro, con 10 ripetizioni per ogni tipo di animale (genotipo/sesso). Assicurarsi di prendere nota di quale tipo di animale viene caricato in ogni provetta. Nota: Per gli esperimenti più lunghi, alimentare può essere incluso nelle provette dei campioni. In questo caso, è essenziale che il cibo sia sicuro e non diventare sloggiato durante la rotazione.</li>
	<li>Caricare le provette di vetro nell'unità REQS e fissarli con la gomma O-ring. Se si lavora con più di un genotipo/sesso, utilizzando un disegno di blocco randomizzato o randomizzazione della posizione degli animali nella REQS eliminerà i potenziali effetti di posizione. Randomizzazione può essere raggiunto assegnando ogni flaconcino un numero casuale, ad esempio da un web-based generatore di numeri casuali (ad esempio, https://www.randomizer.org/) o in un foglio di calcolo, e poi ordinare le fiale sulla base del numero casuale.</li>
	<li>Inserire il REQS l'incubatrice per garantire la temperatura costante, umidità e luce condizioni. Assicurarsi che i cavi dati e di alimentazione siano collegati correttamente.</li>
	<li>Consentire agli animali di recuperare dall'anestesia e di acclimatarsi al nuovo ambiente per 1 h.</li>
	<li>Iniziare l'esperimento avviando rotazione di REQS alla velocità desiderata. Nota: Un'altra opzione è in primo luogo raccogliere i dati di attività di base dagli animali prima dell'inizio della rotazione, seguita registrando livelli di attività in risposta a stimolazione rotazionale.</li>
	<li>Avviare la raccolta dei dati aprendo il software DAMsystem308 (semplicemente aprendo la raccolta di dati software iniziati). I dati vengono scritti in un file di testo l'intervallo impostato (qui, 5 min); Se necessario, modificare le impostazioni di intervallo nella scheda "Preferenze" (Vedi punto 1.4).</li>
	<li>Per garantire che i dati sono trasmessi con successo al computer, aprire il file di testo generato dal software DAMsystem308 dopo uno o due intervalli di tempo sono passati e confermano che i dati vengano scritti nel file. Chiudere e riaprire il file per visualizzare dati da eventuali punti di tempo aggiuntivo. Raccogliere dati per la quantità desiderata di tempo; in questo esempio, 2h. Nota: Non aprire l'incubatrice durante il periodo di test, come gli animali sono molto sensibili a qualsiasi tipo di disturbo e probabilmente risponderà con attività aumentata.</li>
	<li>Alla fine dell'esercizio assay, terminare la raccolta di dati chiudendo il software DAMsystem308, poi si spegne il reqs Rimuovere gli animali dalle provette di vetro e pulire i tubi. Gli animali possono essere spostati indietro in fiale di cibo se ripetuti sono necessarie misure a diverse età. Nota: In caso di decessi durante il regime di esercizio, e dovrebbe essere registrato, come la presenza di mosche morte può avere un impatto attività conteggi. Nella nostra esperienza con le DGRP2 linee fly12,13, esercizio a 4 giri per 2 h non ha provocato morti, ma più debole ceppi potrebbero rispondere in modo diverso.</li>
</ol>4. analisi dei dati
<ol><li>Aprire il file. txt con l'etichetta "Monitor1" prodotte dal software DAMSystem308.</li>
	<li>Esaminare il file di dati per eventuali problemi che possono verificarsi durante l'acquisizione dei dati (tempo perso punti, ecc.; Tabella 1). Se necessario, censurare il file rimuovendo dati punti all'inizio e alla fine della registrazione.</li>
	<li>Utilizzando il software statistico di vostra scelta (ad es., R), analizzare i dati raccolti. Genera statistiche descrittive e realizza analisi della varianza (ANOVA) per studiare effetti come il sesso e il genotipo, se i dati sono normalmente distribuiti. Se i dati non sono distribuiti normalmente, è possibile utilizzare metodi non parametrici, come test di Kruskal-Wallis, per confrontare i gruppi. Le analisi specifiche necessarie dipenderà la questione scientifica specifica e il disegno sperimentale.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Rieder, L. E., Larschan, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wisdom+from+the+fly.">Wisdom from the fly.</a> Trends Genet. 30 (11), 479-481 (2014).</li><li>Ugur, B., Chen, K., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+tools+and+assays+for+the+study+of+human+diseases.">Drosophila tools and assays for the study of human diseases.</a> Dis Model Mech. 9 (3), 235-244 (2016).</li><li>Hales, K. G., Korey, C. A., Larracuente, A. M., Roberts, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+on+the+fly:+A+primer+on+the+Drosophila+Model+System.">Genetics on the fly: A primer on the Drosophila Model System.</a> Genetics. 201 (3), 815-842 (2015).</li><li>Piazza, N., Gosangi, B., Devilla, S., Arking, R., Wessells, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exercise-training+in+young+Drosophila+melanogaster+reduces+age-related+decline+in+mobility+and+cardiac+performance.">Exercise-training in young Drosophila melanogaster reduces age-related decline in mobility and cardiac performance.</a> PLoS One. 4 (6), e5886 (2009).</li><li>Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+iterative+negative+geotaxis+(RING):+a+new+method+for+assessing+age-related+locomotor+decline+in+Drosophila.">Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila.</a> Exp Gerontol. 40 (5), 386-395 (2005).</li><li>Tinkerhess, M. J., Ginzberg, S., Piazza, N., Wessells, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endurance+training+protocol+and+longitudinal+performance+assays+for+Drosophila+melanogaster.">Endurance training protocol and longitudinal performance assays for Drosophila melanogaster.</a> J Vis Exp. (61), (2012).</li><li>Mendez, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+TreadWheel:+A+novel+apparatus+to+measure+genetic+variation+in+response+to+gently+induced+exercise+for+Drosophila.">The TreadWheel: A novel apparatus to measure genetic variation in response to gently induced exercise for Drosophila.</a> PLoS One. 11 (10), e0164706 (2016).</li><li>Katzenberger, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Drosophila+model+of+closed+head+traumatic+brain+injury.">A Drosophila model of closed head traumatic brain injury.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (44), E4152-E4159 (2013).</li><li>Watanabe, L. P., Riddle, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+Rotating+Exercise+Quantification+System+(REQS),+a+novel+Drosophila+exercise+quantification+apparatus.">Characterization of the Rotating Exercise Quantification System (REQS), a novel Drosophila exercise quantification apparatus.</a> PLoS One. 12 (10), e0185090 (2017).</li><li>Reed, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotype-by-diet+interactions+drive+metabolic+phenotype+variation+in+Drosophila+melanogaster.">Genotype-by-diet interactions drive metabolic phenotype variation in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 185 (3), 1009-1019 (2010).</li><li>Bartholomew, N. R., Burdett, J. M., VandenBrooks, J. M., Quinlan, M. C., Call, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+climbing+and+flight+behaviour+in+Drosophila+melanogaster+following+carbon+dioxide+anaesthesia.">Impaired climbing and flight behaviour in Drosophila melanogaster following carbon dioxide anaesthesia.</a> Sci Rep. 5, 15298 (2015).</li><li>Huang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+variation+in+genome+architecture+among+205+Drosophila+melanogaster+Genetic+Reference+Panel+lines.">Natural variation in genome architecture among 205 Drosophila melanogaster Genetic Reference Panel lines.</a> Genome Res. 24 (7), 1193-1208 (2014).</li><li>Mackay, T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+melanogaster+Genetic+Reference+Panel.">The Drosophila melanogaster Genetic Reference Panel.</a> Nature. 482 (7384), 173-178 (2012).</li><li>Berlandi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swing+Boat:+Inducing+and+recording+locomotor+activity+in+a+Drosophila+melanogaster+model+of+Alzheimer's+disease.">Swing Boat: Inducing and recording locomotor activity in a Drosophila melanogaster model of Alzheimer's disease.</a> Front Behav Neurosci. 11, 159 (2017).</li><li>Faville, R., Kottler, B., Goodhill, G. J., Shaw, P. J., van Swinderen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+deeply+does+your+mutant+sleep?+Probing+arousal+to+better+understand+sleep+defects+in+Drosophila.">How deeply does your mutant sleep? Probing arousal to better understand sleep defects in Drosophila.</a> Sci Rep. 5, 8454 (2015).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Come illustrano i risultati rappresentativi, il REQS è in grado di misurare accuratamente l'attività di esercizio Drosophila. Il REQS è flessibile e permette ai ricercatori di affrontare una serie di domande di ricerca relazionati all'esercizio biologia o interventi di esercizio. Ci sono due passaggi critici nel protocollo per evidenziare. In primo luogo, è essenziale per verificare l'installazione di REQS per garantire che la trasmissione dati dalla REQS alla DAMSystem308 sta funzionando correttamente. Se non impostato correttamente, il cavo dati possa impigliarsi durante la rotazione, e a volte la connessione tra il REQS e il DAMSystem308 è interrotta presso la connessione rotante a causa di usura (anche se, con l'uso quasi quotidiano della REQS, abbiamo dovuto sostituire il connettore una volta in due anni). È prudente tenere pezzi di ricambio in mano. In secondo luogo, la coerenza dei parametri ambientali è essenziale per il successo degli esperimenti. Drosofila sono molto sensibili al rumore o vibrazioni, e quindi, è importante che l'esperimento non è disturbato durante la raccolta dati. Quindi, idealmente, gli esperimenti vengono eseguiti in un incubatore dedicato che non è accessibile durante un'esecuzione sperimentale. Attenzione a questi due passaggi critici farà in modo che i dati di alta qualità raccolti dalla reqs
Mentre qui dimostriamo come la REQS può essere utilizzato per misurare l'attività degli animali durante un trattamento di 2 ore di esercizio continuo da gruppi di animali, il REQS è flessibile in quanto il tempo e l'intensità dell'esercizio può essere regolate per una varietà di trattamenti di esercizio. Inoltre, a seconda dell'unità di monitoraggio di attività utilizzato, può essere modificato per misurare l'attività da mosche singoli o molto grandi popolazioni di animali. Inoltre, il REQS può essere utilizzato per testare la progettazione e l'ottimizzazione dei regimi di esercizio. Può anche essere utilizzato per misurare gli effetti delle variabili aggiuntive come il tempo del giorno, età dell'animale, dieta, dimensione della popolazione o trattamento farmacologico su risposte indotte di attività ed esercizio fisico. A seconda dell'esatta messa a punto sperimentale, cioè, la lunghezza del regime di esercizio e la tempistica, il Rich utilizzabile anche per interferire con il sonno naturale di Drosophila. Questi esempi illustrano la natura versatile del REQS e alcuni usi potenziali nella ricerca di Drosophila. Altre comunità di ricerca animale piccolo potrebbe anche essere interessati nell'adattare i requisiti per i loro scopi, ampliando così l'utilità di questo nuovo strumento.
Attualmente, una limitazione della REQS è il numero limitato di campioni che possono essere elaborati in un dato momento, che è dettato dai monitor attività utilizzato, che un massimo di 32 campioni di analisi. Mentre l'uso di più unità di REQS è possibile, per consentire la REQS da utilizzarsi per schermi genetici su larga scala o applicazioni simili, lo sviluppo di una versione dei requisiti di throughput elevato sarebbe l'ideale.
Grazie alla sua capacità di misurare i livelli di attività indotti in maniera identica per il Treadwheel, il REQS può essere utilizzato in combinazione con il Treadwheel, che consente una velocità un po' superiore (48 campioni possono essere elaborati in un momento). Protocolli di esercizio possono essere ottimizzati utilizzando il Rich e quindi implementato il Treadwheel per ulteriori studi. Così, il Treadwheel e REQS può essere utilizzato complementari come necessario per i disegni di studio specifico.
Il REQS è un importante passo avanti nella ricerca di esercizio Drosophila quanto consente di quantificare l'attività indotta. Avere una macchina che contemporaneamente possa indurre l'esercizio e la misura di che questo esercizio è stato che un chiaro bisogno di esercitare nella drosofila campo, come un gruppo di scienziati tedesco sviluppato indipendentemente un dispositivo molto simile, chiamato "swing barca," che utilizza anche un'attività Monitor per misurare l'attività durante l'esercizio indotta dalla rotazione14. La "barca di swing" non utilizzare rotazioni complete, ma oscilla invece l'unità monitor attività indietro e indietro circa 30 gradi intorno a un asse di rotazione. Così, la "swing barca," come i Rich, utilizza la rotazione per indurre una risposta negativa geotassi e aumentare l'attività degli animali continuamente. La REQS e il complemento "swing barca" esistenti metodi di video-monitoraggio utilizzati al dosaggio di Drosophila dopo stimolazione, come la drosofila eccitazione Tracking system (DART)15. Sia il REQS e la "barca di oscillazione" migliorare su sistemi come la DART, che traccia l'attività solo dopo la cessazione dello stimolo. Così, il Rich e "swing barca" sono nuovi importanti strumenti per i ricercatori in ambito di esercizio della drosofila, che può essere utilizzato in combinazione con i dispositivi esistenti di Treadwheel e Power Tower.

Recentemente, i ricercatori hanno iniziato a utilizzare il moscerino della frutta Drosophila melanogaster a studiare biologia di esercizio. D. melanogaster è stato un sistema di modello genetico per oltre 100 anni1,2. Tuttavia, ricerca di Drosophila ha contribuito non solo la genetica, ma anche ad una varietà di altre discipline tra cui neurobiologia, biologia del comportamento e fisiologia3. Nel 2009, la Power Tower, la prima macchina di esercizio per Drosophila fu descritto4. La Power Tower si avvale della risposta geotassi negativa degli animali. Quando sono disturbati, Drosophila tendono a spostarsi nella parte superiore del loro recinto. Questa risposta è ben consolidata ed è la base del saggio popolare "anello" (geotassi negativa iterativo rapido5) che viene utilizzato per stimare la capacità di arrampicata e/o idoneità fisica in Drosophila. La Power Tower utilizza un braccio meccanico collegato ad un'unità motore per sollevare ripetutamente una serie di animali nei loro recinti da molti pollici e farli cadere indietro a terra per indurre la risposta negativa geotassi (Tinkerhess et al. 20126 fornire un video che illustra l'utilizzo di Power Tower). Trattamento prolungato sulla Torre di potere così aumenta la quantità di attività fisica (in esecuzione o volare) gli animali eseguire rispetto agli animali di controllo non trattata e sopra tempo porta al miglioramento delle prestazioni nell'analisi della anello per idoneità fisica4. Così, questo lavoro ha dimostrato la fattibilità dell'utilizzo di Drosophila come modello per la biologia di esercizio.
Per espandere il repertorio degli strumenti disponibili per la ricerca di esercizio Drosophila, nel 2016, Mendez e colleghi descritto una seconda macchina di esercitazione di Drosophila, il Treadwheel7. Simile alla Power Tower, il Treadwheel sfrutta la risposta negativa geotassi di Drosophila. Tuttavia, questa risposta è indotta dalla rotazione continua dei recinti degli animali, piuttosto che di sollevamento e farli cadere come la Power Tower. Questo metodo di induzione è più delicato e permette per un regime di esercizio orientato endurance più che evita qualsiasi trauma fisico che potrebbe verificarsi durante l'esercizio nella Power Tower (Vedi Katzenberger, R. J. et al 20138 per l'impatto del ripetuto fisico trauma sulla salute di Drosophila). Simile al Power Tower4, trattamento di esercizio degli animali sul Treadwheel conduce ad una varietà di risposte fisiologiche, compresi cambiamenti di forma fisica, i livelli del trigliceride e corpo peso7. Così, due metodi complementari sono disponibili per i biologi di Drosophila studiando esercizio.
Una limitazione di sia la Power Tower e il Treadwheel è l'impossibilità di misurare la quantità di attività indotta dal trattamento di esercizio. L'analisi di video-registrazioni dal vivo tratte dal Treadwheel ha dimostrato che c'erano differenze significative tra i vari ceppi di Drosophila in come rispondono al trattamento esercizio7. In particolare, i ceppi studiati hanno differito da in quanto attività ulteriori che animali eseguita quando stimolato7. Questa osservazione ci ha spinti a sviluppare un terzo sistema di esercizio, la rotazione esercitare quantificazione sistema (Rich), che permette di misurare i livelli di attività degli animali durante esercizio indotta da rotazione9. Il REQS utilizza un commercialmente disponibili attività Monitoraggio unità che è installato su un braccio girevole per stimolare esercizio mediante rotazione come il Treadwheel. Il lavoro iniziale con il Rich conferma che geneticamente diversi ceppi di Drosophila — e i sessi - può avere significativamente differenti risposte alla stimolazione rotazionale e quindi la quantità di esercizio indotta non è identica tra differenti genotipi9 . Così, il REQS consente ora i biologi della drosofila misurare la quantità di esercizio indotta dal trattamento, aprendo una varietà di nuove vie di ricerca nel campo di esercizio.
Qui descriviamo in dettaglio come utilizzare i requisiti per la quantificazione dell'esercizio rotazionale. Il REQS induce esercizio rotazionale e misura contemporaneamente i livelli di attività degli animali trattati. Il REQS è in grado di ospitare una grande varietà di programmi di esercizio, che vanno dal semplice 2h regime di esercizio continuo dimostrato qui ai più complessi metodi di addestramento di intervallo come descritto da Mendez e colleghi7e la stimolazione può essere regolata tramite velocità di rotazione (tra circa 1-13 di rotazioni al minuto). A seconda dell'unità di monitor attività utilizzato per produrre il REQS, questo metodo è adattabile per l'analisi delle singole mosche o grandi popolazioni di animali. A causa di questa versatilità, la REQS fornisce ai ricercatori di Drosophila con una serie di opportunità di studiare, ad esempio, regimi di esercizio differenti, interventi di dieta o impatto della densità della popolazione.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="769">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Drosophila Activity Monitor&#160;</td>
			<td style="width:147px;">Trikinetics</td>
			<td style="width:119px;">LAM25H</td>
			<td style="width:287px;">REQS component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Telephone Cord Detangler</td>
			<td style="width:147px;">Uvital</td>
			<td>uv20170719</td>
			<td>REQS component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vial closures (flugs)</td>
			<td style="width:147px;">Genesee Scientific</td>
			<td style="width:119px;">49-102</td>
			<td style="width:287px;">Drosophila culture supplies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vials&#160;</td>
			<td style="width:147px;">Genesee Scientific</td>
			<td>32-120</td>
			<td style="width:287px;">Drosophila culture supplies</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Drosophila culture netting</td>
			<td style="width:147px;">Carolina Biological Supply</td>
			<td style="width:119px;">173090</td>
			<td style="width:287px;">Drosophila culture supplies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cornmeal</td>
			<td style="width:147px;">Pepsico</td>
			<td>43375</td>
			<td>Drosophila media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Molasses</td>
			<td style="width:147px;">Golden Barrel</td>
			<td>BLA-GAL</td>
			<td>Drosophila media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Agar</td>
			<td style="width:147px;">Apex Bioresearch</td>
			<td style="width:119px;">66-103</td>
			<td>Drosophila media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Inactive Dry Yeast</td>
			<td style="width:147px;">Genesee Scientific</td>
			<td style="width:119px;">62-106</td>
			<td>Drosophila media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tegosept</td>
			<td style="width:147px;">Apex Bioresearch</td>
			<td style="width:119px;">20-258</td>
			<td>Drosophila media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Propionic acid</td>
			<td style="width:147px;">Genesee Scientific</td>
			<td style="width:119px;">20-271</td>
			<td>Drosophila media</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring exercise levels in drosophila melanogaster using the rotating exercise quantification system (reqs)

Drosophila melanogaster è un nuovo organismo modello per studi di biologia di esercizio. Fin qui, due sistemi di esercizio principale, la Power Tower e il Treadwheel sono stati descritti. Tuttavia, un metodo per misurare la quantità di ulteriori attività animale indotta attraverso il trattamento di esercizio è stato carente. La rotazione esercitare quantificazione sistema (Rich) riempie questa esigenza, fornendo una misura di attività degli animali per gli animali vivendo esercizio rotazionale. Questo protocollo dettagli come usare il REQS per valutare l'attività degli animali durante l'esercizio rotazionale e illustra il tipo di dati che possono essere generati. Qui, dimostriamo come la REQS è utilizzata per misurare le differenze di sesso - e ceppo-specifici nell'attività indotta da esercizio. Il REQS è utilizzabile anche per valutare l'impatto di vari altri parametri sperimentali quali età, dieta o popolazione dimensioni sull'attività indotta da esercizio. Inoltre, può essere utilizzato per confrontare l'efficacia di differenti protocolli di training. D'importanza, essa consente di standardizzare trattamenti di esercizio tra i ceppi, che permette al ricercatore di raggiungere gli importi uguali di attività tra gruppi se necessario. Così, il REQS è una nuova risorsa notevole per esercizio biologi che lavorano con il sistema di modello di Drosophila e integra i sistemi esistenti di esercizio.

L'output di un singolo tratto con il Rich è una tabella di dati prodotta dal software DAMSystem308, che sarà contrassegnata con "Monitor1.txt" per impostazione predefinita (per vedere un esempio supplementare File 1). Un Estratto da una tabella di questo tipo è illustrato nella tabella 1. Ogni colonna contiene i dati da un tubo di dosaggio individuale, mentre le righe contengono l'attività misurata in ogni intervallo di tempo dall'inizio dell'esperimento (in alto) fino alla fine (in basso). I primi punti tre dati dovrebbero essere controllati nel caso in cui ci sono ritagli di dati (come quelli visti in tabella 2), in cui caso il cavo deve essere regolata.
La figura 2 Mostra i risultati da un esperimento confrontando quattro linee geneticamente distinte di Drosophila (DGRP2 linee 371, 703, 810 e 89712,13). Per ciascuna delle quattro linee, replicare dieci misurazioni da gruppi di dieci mosche Vergine di entrambi i sessi sono stati raccolti come descritto nella sezione protocollo. Dal file di output del software DAMSystem308, "Attività media al 5 min per 10 mosche" è stato calcolato facendo la media delle misure di attività lungo tutto l'arco di tutto il tempo 2 ore. Questa media da ogni colonna produce così una sola misura per ciascuna camera di dosaggio. Tabella di riepilogo nella figura 2 si basa è fornita nella tabella 3.
I dati forniti nella tabella 3 sono stati analizzati mediante ANOVA, test per gli effetti del genotipo, il sesso e l'interazione tra il sesso e il genotipo. Come solo l'effetto del genotipo era significativo (p < 2 x 10-16), i due sessi sono stati combinati nel grafico mostrato nella Figura 2. L'ANOVA ha rilevato un forte effetto del genotipo, che è evidente nel grafico. I livelli di attività di esercizio media tra tutti i quattro genotipi sono significativamente differenti gli uni dagli altri (p < 0,05; HSD di Tukey), e così, la figura 2 illustra come il REQS può essere utilizzato per rilevare un effetto del genotipo sui livelli di attività di esercizio.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57751/57751fig1.jpg"> Figura 1: la reqs Dimostrato in questa fotografia è il REQS utilizzato in questa procedura. L'unità di monitor attività (A) ruota attorno al suo asse orizzontale, guidato da un braccio rotante (B). La velocità di rotazione è regolabile tramite una manopola (C), e il funzionamento della macchina è controllato da un interruttore on/off (D). L'inserto (E) Mostra un primo piano della connessione dati tra l'unità di monitoraggio di attività e la presa telefonica rotante. <a href="/files/ftp_upload/57751/57751fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57751/57751fig2.jpg"> Figura 2: confronto tra attività di esercitazione come misurato da Rich in quattro diversi ceppi DGRP. Asse x: genotipo animale. Asse y: animale attività misurata come incroci di fascio al 10 animali per 5 min. R: DGRP2 linea 897; B: linea DGRP2 810; C: linea DGRP2 703; D: DGRP2 linea 371. Il grafico riportato qui combina dati da maschi e femmine, come non c'era effetto significativo sesso per queste linee specifiche (ANOVA; p = 0,557). Tuttavia, c'è un effetto di forte genotipo (ANOVA; p < 2 x 10-16), e tutti i singoli confronti tra i quattro genotipi sono altamente significativi (di Tukey HSD; p < 0,05). Black diamond: media genotipo; linea nera: + /-una deviazione standard (deviazione standard). <a href="/files/ftp_upload/57751/57751fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Tempo</td>
			<td>Activity(1)</td>
			<td>Activity(2)</td>
			<td>Activity(3)</td>
			<td>Activity(4)</td>
			<td>Activity(5)</td>
		</tr>
<tr>
<td>12:25</td>
			<td>21</td>
			<td>86</td>
			<td>48</td>
			<td>32</td>
			<td>76</td>
		</tr>
<tr>
<td>12:30</td>
			<td>31</td>
			<td>55</td>
			<td>58</td>
			<td>74</td>
			<td>119</td>
		</tr>
<tr>
<td>12:35</td>
			<td>27</td>
			<td>45</td>
			<td>47</td>
			<td>80</td>
			<td>125</td>
		</tr>
<tr>
<td>12:40</td>
			<td>28</td>
			<td>55</td>
			<td>34</td>
			<td>83</td>
			<td>91</td>
		</tr>
<tr>
<td>12:45</td>
			<td>36</td>
			<td>56</td>
			<td>45</td>
			<td>67</td>
			<td>103</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: esempio di output di dati accurati dal software DAMSystem308. Ogni colonna di "Activity(#)" rappresenta un flaconcino da 10 mosche, con attività registrate ad intervalli di 5 min.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Tempo</td>
			<td>Activity(1)</td>
			<td>Activity(2)</td>
			<td>Activity(3)</td>
			<td>Activity(4)</td>
			<td>Activity(5)</td>
			<td>Colpa?</td>
		</tr>
<tr>
<td>12:00</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>Sì</td>
		</tr>
<tr>
<td>12:05</td>
			<td>98</td>
			<td>1</td>
			<td>36</td>
			<td>0</td>
			<td>8</td>
			<td>No</td>
		</tr>
<tr>
<td>12:10</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>Sì</td>
		</tr>
<tr>
<td>12:15</td>
			<td>88</td>
			<td>24</td>
			<td>44</td>
			<td>1</td>
			<td>9</td>
			<td>No</td>
		</tr>
<tr>
<td>12:20</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>Sì</td>
		</tr>
<tr>
<td>12:25</td>
			<td>106</td>
			<td>51</td>
			<td>41</td>
			<td>0</td>
			<td>15</td>
			<td>No</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 2: Esempio di output di dati difettosi con perdita di pacchetti dal software DamSystem308. Ogni colonna rappresenta un flaconcino da 10 mosche, con attività registrate ad intervalli di 5 min. F. 12:00, 12:10 e 12:20 Visualizza "0" registrazioni di attività in tutte le colonne, che indica un problema con la connessione dati (colpa? "Sì" nell'ultima colonna).
Tabella 3: dati di esempio utilizzati per generare Nella figura 2. <a href="/files/ftp_upload/57751/Table_3.xlsx">Per favore clicca qui per scaricare questo file.</a>
File supplementare 1: File di output non trasformati come prodotte dal software DAMSystem308. Colonna 1 registra il numero di punto di tempo. Colonna 2 la data dell'esperimento, colonna 3 records e il tempo in che ogni punto del tempo viene registrato. 4-10 le colonne non vengono utilizzate, e colonne 11-42 rappresentano le registrazioni da 32 slot di monitor attività. <a href="/files/ftp_upload/57751/Supplemental_File.txt">Per favore clicca qui per scaricare questo file.</a>

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Measuring Exercise Levels in Drosophila melanogaster Using the Rotating Exercise Quantification System REQS

La rotazione esercitare quantificazione sistema (Rich) può indurre esercizio in Drosophila melanogaster attraverso rotazione misurando contemporaneamente la quantità di attività svolta dagli animali. Qui, presentiamo un protocollo punto-per-punto dettagliare come misurare i livelli di attività degli animali vivendo rotazionale esercizio trattamenti utilizzando il reqs

Misurazione dei livelli di esercizio in Drosophila melanogaster utilizzando il sistema di quantificazione esercizio rotanti (Rich)

Drosophila melanogaster is a new model organism for studies in exercise biology. To date, two main exercise systems, the Power Tower and the Treadwheel ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

Measuring Exercise Levels in Drosophila melanogaster Using the Rotating Exercise Quantification System (REQS)

7.4K Views.  University of Alabama at Birmingham. La rotazione esercitare quantificazione sistema (Rich) può indurre esercizio in Drosophila melanogaster attraverso rotazione misurando contemporaneamente la quantità di attività svolta dagli animali. Qui, presentiamo un protocollo punto-per-punto dettagliare come misurare i livelli di attività degli animali vivendo rotazionale esercizio trattamenti utilizzando il reqs

Video: Measuring Exercise Levels in Drosophila melanogaster Using the Rotating Exercise Quantification System REQS

Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster

Pigmentation is a morphologically simple but highly variable trait that often has adaptive significance. It has served extensively as a model for understanding the development and evolution of morphological phenotypes. Abdominal pigmentation in Drosophila melanogaster has been particularly useful, allowing researchers to identify the loci that underlie inter- and intraspecific variations in morphology. Hitherto, however, D. melanogaster abdominal pigmentation has been largely assayed qualitatively, through scoring, rather than quantitatively, which limits the forms of statistical analysis that can be applied to pigmentation data. This work describes a new methodology that allows for the quantification of various aspects of the abdominal pigmentation pattern of adult D. melanogaster. The protocol includes specimen mounting, image capture, data extraction, and analysis. All the software used for image capture and analysis feature macros written for open-source image analysis. The advantage of this approach is the ability to precisely measure pigmentation traits using a methodology that is highly reproducible across different imaging systems. While the technique has been used to measure variation in the tergal pigmentation patterns of adult D. melanogaster, the methodology is flexible and broadly applicable to pigmentation patterns in myriad different organisms.

Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster

This work presents a method to quickly and precisely quantify the abdominal pigmentation of Drosophila melanogaster using digital image analysis. This method streamlines the procedures between phenotype acquisition and data analysis and includes specimen mounting, image acquisition, pixel value extraction, and trait measurement.

Quantificazione della pigmentazione addominale in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Pigmentation is a morphologically simple but highly variable trait that often has adaptive significance. It has served extensively as a model for ...

Ricerca

Genetica

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

Heart disease is the number one cause of human death worldwide. Numerous studies have shown strong connections between obesity and cardiac malfunction in humans, but more tools and research efforts are needed to better elucidate the mechanisms involved. For over a century, the genetically highly tractable model of Drosophila has been instrumental in the discovery of key genes and molecular pathways that proved to be highly conserved across species. Many biological processes and disease mechanisms are functionally conserved in the fly, such as development (e.g., body plan, heart), cancer, and neurodegenerative disease. Recently, the study of obesity and secondary pathologies, such as heart disease in model organisms, has played a highly critical role in the identification of key regulators involved in metabolic syndrome in humans.
Here, we propose to use this model organism as an efficient tool to induce obesity, i.e., excessive fat accumulation, and develop an efficient protocol to monitor fat content in the form of TAGs accumulation. In addition to the highly conserved, but less complex genome, the fly also has a short lifespan for rapid experimentation, combined with cost-effectiveness. This paper provides a detailed protocol for High Fat Diet (HFD) feeding in Drosophila to induce obesity and a high throughput triacylglyceride (TAG) assay for measuring the associated increase in fat content, with the aim to be highly reproducible and efficient for large-scale genetic or chemical screening. These protocols offer new opportunities to efficiently investigate regulatory mechanisms involved in obesity, as well as provide a standardized platform for drug discovery research for rapid testing of the effect of drug candidates on the development or prevention of obesity, diabetes and related metabolic diseases.

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

This is a high fat diet feeding protocol to induce obesity in Drosophila, a model for understanding fundamental molecular mechanisms implicated in lipotoxicity. It also provides a high throughput triacylglyceride assay for measuring fat accumulation in Drosophila and potentially other (insect) models under various dietary, environmental, genetic or physiological conditions.

Dieta grassa alta alimentazione e Throughput elevato dosaggio di Triacylglyceride in Drosophila Melanogaster

Heart disease is the number one cause of human death worldwide. Numerous studies have shown strong connections between obesity and cardiac malfunction in ...

Measuring mRNA Levels Over Time During the Yeast S. cerevisiae Hypoxic Response

Complex changes in gene expression typically mediate a large portion of a cellular response. Each gene may change expression with unique kinetics as the gene is regulated by the particular timing of one of many stimuli, signaling pathways or secondary effects. In order to capture the entire gene expression response to hypoxia in the yeast S. cerevisiae, RNA-seq analysis was used to monitor the mRNA levels of all genes at specific times after exposure to hypoxia. Hypoxia was established by growing cells in ~100% N2 gas. Importantly, unlike other hypoxic studies, ergosterol and unsaturated fatty acids were not added to the media because these metabolites affect gene expression. Time points were chosen in the range of 0 - 4 h after hypoxia because that period captures the major changes in gene expression. At each time point, mid-log hypoxic cells were quickly filtered and frozen, limiting exposure to O2 and concomitant changes in gene expression. Total RNA was extracted from cells and used to enrich for mRNA, which was then converted to cDNA. From this cDNA, multiplex libraries were created and eight or more samples were sequenced in one lane of a next-generation sequencer. A post-sequencing pipeline is described, which includes quality base trimming, read mapping and determining the number of reads per gene. DESeq2 within the R statistical environment was used to identify genes that change significantly at any one of the hypoxic time points. Analysis of three biological replicates revealed high reproducibility, genes of differing kinetics and a large number of expected O2-regulated genes. These methods can be used to study how the cells of various organisms respond to hypoxia over time and adapted to study gene expression during other cellular responses.

Measuring mRNA Levels Over Time During the Yeast S. cerevisiae Hypoxic Response

Here, we present a protocol using RNA-seq to monitor mRNA levels over time during the hypoxic response of S. cerevisiae cells. This method can be adapted to analyze gene expression during any cellular response.

Misurazione dei livelli di mRNA nel tempo durante la risposta Hypoxic lievito s. cerevisiae

Complex changes in gene expression typically mediate a large portion of a cellular response. Each gene may change expression with unique kinetics as the ...

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of tissues, we have developed numerous modifications and improvements to our original fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol. To facilitate throughput and cost effectiveness, all steps, from probe generation to signal detection, are performed using exon 96-well microtiter plates. Digoxygenin (DIG)-labelled antisense RNA probes are produced using either cDNA clones or genomic DNA as templates. After tissue fixation and permeabilization, probes are hybridized to transcripts of interest and then detected using a succession of anti-DIG antibody conjugated to biotin, streptavidin conjugated to horseradish peroxidase (HRP) and fluorescently conjugated tyramide, which in the presence of HRP, produces a highly reactive intermediate that binds to electron dense regions of immediately adjacent proteins. These amplification and localization steps produce a robust and highly localized signal that facilitates both cellular and subcellular transcript localization. The protocols provided have been optimized to produce highly specific signals in a variety of tissues and developmental stages. References are also provided for additional variations that allow the simultaneous detection of multiple transcripts, or transcripts and proteins, at the same time.

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

The described RNA in situ hybridization protocol allows the detection of RNA in whole Drosophila embryos or dissected tissues. Using 96-well microtiter plates and tyramide signal amplification, transcripts can be detected at high resolution, sensitivity, and throughput, and at a relatively low cost.

Ibridazione fluorescente In Situ ad alta risoluzione in embrioni della drosofila e tessuti mediante amplificazione del segnale Tyramide

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene expression, but whether looping is responsible for or a result of alterations in gene expression is still unknown. Until recently, how chromatin looping affects the regulation of gene activity and cellular function has been relatively ambiguous, and limitations in existing methods to manipulate these structures prevented in-depth exploration of these interactions. To resolve this uncertainty, we engineered a method for selective and reversible chromatin loop re-organization using CRISPR-dCas9 (CLOuD9). The dynamism of the CLOuD9 system has been demonstrated by successful localization of CLOuD9 constructs to target genomic loci to modulate local chromatin conformation. Importantly, the ability to reverse the induced contact and restore the endogenous chromatin conformation has also been confirmed. Modulation of gene expression with this method establishes the capacity to regulate cellular gene expression and underscores the great potential for applications of this technology in creating stable de novo chromatin loops that markedly affect gene expression in the contexts of cancer and development.

Chromatin looping plays a significant role in gene regulation; however, there have been no technological advances that allow for selective and reversible modification of chromatin loops. Here we describe a powerful system for chromatin loop re-organization using CRISPR-dCas9 (CLOuD9), demonstrated to selectively and reversibly modulate gene expression at targeted loci.

CRISPR-mediata di riorganizzazione della struttura della cromatina Loop

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

The TreadWheel: Interval Training Protocol for Gently Induced Exercise in Drosophila melanogaster

The incidence of complex metabolic diseases has increased as a result of a widespread transition towards lifestyles of increased caloric intake and lowered activity levels. These multifactorial diseases arise from a combination of genetic, environmental, and behavioral factors. One such complex disease is Metabolic Syndrome (MetS), which is a cluster of metabolic disorders, including hypertension, hyperglycemia, and abdominal obesity. Exercise and dietary intervention are the primary treatments recommended by doctors to mitigate obesity and its subsequent metabolic diseases. Exercise intervention, in particular aerobic interval training, stimulates favorable changes in the common risk factors for Type 2 Diabetes Mellitus (T2DM), Cardiovascular Disease (CVD), and other conditions. With the influx of evidence describing the therapeutic effect exercise has on metabolic health, establishing a system that models exercise in a controlled setting provides a valuable tool for assessing the effects of exercise in an experimental context. Drosophila melanogaster is a great tool for investigating the physiological and molecular changes that result from exercise intervention. The flies have short lifespans and similar mechanisms of metabolizing nutrients when compared to humans. To induce exercise in Drosophila, we developed a machine called the TreadWheel, which utilizes the fly&#39;s innate, negative geotaxis tendency to gently induce climbing. This enables researchers to perform experiments on large cohorts of genetically diverse flies to better understand the genotype-by-environment interactions underlying the effects of exercise on metabolic health.

The TreadWheel: Interval Training Protocol for Gently Induced Exercise in Drosophila melanogaster

The TreadWheel uses rotational motion to gently induce exercise in adult Drosophila melanogaster by exploiting flies&#39; innate, negative geotaxis. It allows for analysis of the interactions between exercise and factors, such as genotype, sex, and diet, and their effect on physiological and molecular assays to assess metabolic health.

Il TreadWheel: Protocollo di allenamento intervallo per delicatamente indotto da esercizio in Drosophila melanogaster

The incidence of complex metabolic diseases has increased as a result of a widespread transition towards lifestyles of increased caloric intake and ...

Purification of Low-abundant Cells in the Drosophila Visual System

Recent improvements in the sensitivity of next generation sequencing have facilitated the application of transcriptomic and genomic analyses to small numbers of cells. Utilizing this technology to study development in the Drosophila visual system, which boasts a wealth of cell type-specific genetic tools, provides a powerful approach for addressing the molecular basis of development with precise cellular resolution. For such an approach to be feasible, it is crucial to have the capacity to reliably and efficiently purify cells present at low abundance within the brain. Here, we present a method that allows efficient purification of single cell clones in genetic mosaic experiments. With this protocol, we consistently achieve a high cellular yield after purification using fluorescence activated cell sorting (FACS) (~25% of all labeled cells), and successfully performed transcriptomics analyses on single cell clones generated through mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM). This protocol is ideal for applying transcriptomic and genomic analyses to specific cell types in the visual system, across different stages of development and in the context of different genetic manipulations.

Here, we present a cell dissociation protocol for efficiently isolating cells present at low abundance within the Drosophila visual system through fluorescence activated cell sorting (FACS).

Purificazione di basso-abbondanti cellule nel sistema visivo della drosofila

Recent improvements in the sensitivity of next generation sequencing have facilitated the application of transcriptomic and genomic analyses to small ...

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

Advances in sequencing technology have made whole-genome and whole-exome datasets more accessible for both clinical diagnosis and cutting-edge human genetics research. Although a number of in silico algorithms have been developed to predict the pathogenicity of variants identified in these datasets, functional studies are critical to determining how specific genomic variants affect protein function, especially for missense variants. In the Undiagnosed Diseases Network (UDN) and other rare disease research consortia, model organisms (MO) including Drosophila, C. elegans, zebrafish, and mice are actively used to assess the function of putative human disease-causing variants. This protocol describes a method for the functional assessment of rare human variants used in the Model Organisms Screening Center Drosophila Core of the UDN. The workflow begins with gathering human and MO information from multiple public databases, using the MARRVEL web resource to assess whether the variant is likely to contribute to a patient&#39;s condition as well as design effective experiments based on available knowledge and resources. Next, genetic tools (e.g., T2A-GAL4 and UAS-human cDNA lines) are generated to assess the functions of variants of interest in Drosophila. Upon development of these reagents, two-pronged functional assays based on rescue and overexpression experiments can be performed to assess variant function. In the rescue branch, the endogenous fly genes are &#34;humanized&#34;&#160;by replacing the orthologous Drosophila gene with reference or variant human transgenes. In the overexpression branch, the reference and variant human proteins are exogenously driven in a variety of tissues. In both cases, any scorable phenotype (e.g., lethality, eye morphology, electrophysiology) can be used as a read-out, irrespective of the disease of interest. Differences observed between reference and variant alleles suggest a variant-specific effect, and thus likely pathogenicity. This protocol allows rapid, in vivo assessments of putative human disease-causing variants of genes with known and unknown functions.

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

The goal of this protocol is to outline the design and performance of in vivo experiments in Drosophila melanogaster to assess the functional consequences of rare gene variants associated with human diseases.

Studio funzionale in vivo sulle varianti umane rare associate alla malattia utilizzando la Drosophila

Advances in sequencing technology have made whole-genome and whole-exome datasets more accessible for both clinical diagnosis and cutting-edge human ...

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

There is much to understand about the onset and progression of neurodegenerative diseases, including the underlying genes responsible. Forward genetic screening using chemical mutagens is a useful strategy for mapping mutant phenotypes to genes among Drosophila and other model organisms that share conserved cellular pathways with humans. If the mutated gene of interest is not lethal in early developmental stages of flies, a climbing assay can be conducted to screen for phenotypic indicators of decreased brain functioning, such as low climbing rates. Subsequently, secondary histological analysis of brain tissue can be performed in order to verify the neuroprotective function of the gene by scoring neurodegeneration phenotypes. Gene mapping strategies include meiotic and deficiency mapping that rely on these same assays can be followed by DNA sequencing to identify possible nucleotide changes in the gene of interest.

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

We present a protocol using a forward genetic approach to screen for mutants exhibiting neurodegeneration in Drosophila melanogaster. It incorporates a climbing assay, histology analysis, gene mapping and DNA sequencing to ultimately identify novel genes related to the process of neuroprotection.

In Vivo Avanti Schermo Genetico per Identificare Nuovi Geni Neuroprotettivi in Drosophila melanogaster

There is much to understand about the onset and progression of neurodegenerative diseases, including the underlying genes responsible. Forward genetic ...

Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches

Drosophila flight muscle is a powerful model to study diverse processes such as transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and mechanobiology, which all influence muscle development and myofibrillogenesis. Omics data, such as those generated by mass spectrometry or deep sequencing, can provide important mechanistic insights into these biological processes. For such approaches, it is beneficial to analyze tissue-specific samples to increase both selectivity and specificity of the omics fingerprints. Here we present a protocol for dissection of fluorescent-labeled flight muscle from live pupae to generate highly enriched muscle samples for omics applications. We first describe how to dissect flight muscles at early pupal stages (&#60;48 h after puparium formation [APF]), when the muscles are discernable by green fluorescent protein (GFP) labeling. We then describe how to dissect muscles from late pupae (&#62;48 h APF) or adults, when muscles are distinguishable under a dissecting microscope. The accompanying video protocol will make these technically demanding dissections more widely accessible to the muscle and Drosophila research communities. For RNA applications, we assay the quantity and quality of RNA that can be isolated at different time points and with different approaches. We further show that Bruno1 (Bru1) is necessary for a temporal shift in myosin heavy chain (Mhc) splicing, demonstrating that dissected muscles can be used for mRNA-Seq, mass spectrometry, and reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) applications. This dissection protocol will help promote tissue-specific omics analyses and can be generally applied to study multiple biological aspects of myogenesis.

Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches

Drosophila flight muscle is a powerful model to study transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and mechanobiology. We present a protocol for dissection of fluorescent-labeled flight muscle from live pupae to generate highly enriched samples ideal for proteomics and deep-sequencing. These samples can offer important mechanistic insights into diverse aspects of muscle development.