Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave in biologia cellulare, come, quanto è importante la tensione nel soddisfare il checkpoint del mandrino e qual è il ruolo sull'attaccamento del mandrino nel comportamento cromosomico nella miosi? Il principale vantaggio di questa tecnica è che è una tecnica non letale che permette allo sperimentatore di applicare tensione o riposizionare cromosomi in una cellula vivente. Per iniziare, preparare uno scivolo di 75 per 25 millimetri con un foro circolare di 20 millimetri di diametro tagliato fuori dal centro.
Quindi, eseguire una copertura di 25 per 25 millimetri numero 1,5 fessura attraverso una fiamma bruciatore bunsen per due secondi. Applicare il grasso sottovuoto attorno al bordo del foro nello scivolo di vetro. Quindi, posizionare il coperchio scivolare sopra il foro e premerlo per formare una tenuta stretta.
Capovolgere la diapositiva e riempire bene la dissezione appena creata con olio di alocarbonio. Dopo aver ottenuto alcuni grilli maschi adulti, usa le forbici sezionanti per tagliare attraverso la superficie dorsale parallela al lungo asse dell'addome, direttamente dietro le gemme delle ali. Quindi, spremere delicatamente l'addome per spingere i teste attraverso il taglio nell'esoscheletro.
Utilizzando le forcep, posizionare bene i teste isolati nella dissezione. Al microscopio di sezionamento, utilizzare forcep di puntamento fini per dividere i tester in pezzi più piccoli e rimuovere qualsiasi grasso. Quindi, stendere il contenuto dei teste sotto l'olio sulla superficie della fessura del coperchio.
Continuare a diffondere il contenuto dei teste fino a quando la porzione di diffusione è appena visibile ad occhio nudo. Se necessario, possono essere utilizzati pozzi di dissezione caricati con olio aggiuntivo. In primo luogo, posizionare l'estremità di un tubo di vetro nella fiamma del bruciatore bunsen.
Tenere l'estremità del tubo per creare un angolo di 150 gradi e un'area estesa di tubi di vetro stretti. Rompere il tubo nella regione sottile in modo che la regione sottile che si estende dall'angolo creato in precedenza sia lunga circa 10 millimetri. Utilizzando la microforgia, sciogliere la punta dell'ago di vetro, formando un angolo di 45 gradi tra l'ago e il filo di platino della microforgia.
Quindi, allontanare il vetro dal filo spegnendo contemporaneamente il calore. Posizionare la diapositiva preparata in precedenza sul palco di un microscopio a contrasto di fase invertito. Quindi, trova le celle divisorie e centrale nel campo visivo usando l'ingrandimento più basso possibile.
Posizionare il microneedle nel supporto dell'ago del micromanipolatore. Quindi, posizionare manualmente il microneedle nel percorso luminoso del microscopio. Mettere a fuoco il microscopio diversi piani focali sopra il piano contenente le celle.
Successivamente, utilizzare il controller joystick per riposizionare il microriplesso più volte per trovare l'ombra dell'ago negli assi x e y. Riregolare la posizione dell'ago fino a quando la posizione della punta è visibile, quindi regolare la posizione dell'ago lungo l'asse z fino a quando la punta non è a fuoco. Quindi, rifocalizzarsi sulle cellule e mettere a fuoco il microscopio appena sopra il piano cellulare.
Quindi, riregolare la posizione dell'ago in modo che la punta sia a fuoco in questo piano focale. Ripetete questo processo utilizzando l'obiettivo di ingrandimento più elevato e un'impostazione di sensibilità più elevata. Rifocalizzarsi sulle celle e regolarne la posizione, in modo che rimangano al centro del campo visivo.
Usa il joystick per controllare il microneedle mentre spinge i cromosomi all'interno della cellula. Assicurarsi che la punta dell'ago rimanga nel piano sopra le cellule. Per spostare il cromosoma, concentrati su un cromosoma vicino alla parte superiore della cellula.
Quindi, regolare l'asse z sul joystick per mettere a fuoco la punta dell'ago e spostare l'ago con il joystick in x e y. Posizionare la punta dell'ago direttamente sul cromosoma di interesse e spingerlo nella direzione desiderata. Applicare abbastanza tensione per separare il cromosoma dal mandrino.
Infine, posizionare il cromosoma ovunque all'interno della cellula. Utilizzando questo protocollo, è possibile riposizionare, applicare tensione e staccare completamente un cromosoma da un mandrino usando la micromanipolazione. In questo esempio, a due cromosomi manipolati è stato tenuto il contatto con il mandrino per essere continuamente spinto con un ago di micromanipolazione.
Una volta padroneggiati, i campioni possono essere preparati per la manipolazione e il micromanipolatore può essere posizionato in 15-20 minuti. Gli esperimenti di micromanipolazione possono richiedere da pochi secondi a diverse ore. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di manipolare i cromosomi sul lato della cellula più lontano dallo slittamento di copertura.
Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori nel campo della biologia cellulare per esplorare il checkpoint del mandrino nelle cavallette e nella mantide religiosa.
