Name: in vivo imaging of muscle-tendon morphogenesis in drosophila pupae
Uploaded: 2018-02-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae at JoVE.com

Si ringrazia Manuela Weitkunat per l'acquisizione di film S3. Siamo grati a Reinhard Fässler per il generoso sostegno. Questo lavoro è stato supportato da EMBO Young Investigator programma (F.S.), il Consiglio europeo della ricerca nell'ambito settimo programma dell'Unione europea quadro (FP/2007-2013) / ERC Grant 310939 (F.S.), la società Max Planck (S.B.L., F.S.), il Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS) (F.S.), l'iniziativa di eccellenza OKTIM Università di Aix-Marseille (F.S.), informare LabEX (F.S.) e la Boehringer Ingelheim Fonds (S.B.L.).

1. fase pupe
<ol><li>Impostare una croce con 20-40 Vergine femmine e maschi circa 20 a bottiglia di alimento (Figura 1A). In alternativa, se verranno utilizzate scorte, è possibile capovolgere ogni stock in nuove bottiglie. Per ottenere abbastanza pupe, considerare la creazione due bottiglie al genotipo.</li>
	<li>Incubare le bottiglie a 25 ° C (o 27 ° C secondo il disegno sperimentale) per cinque o sei giorni (Figura 1B). Nota: Tenere lanciando le mosche ogni due o tre giorni per evitare il sovraffollamento e per garantire un approvvigionamento continuo di pupe.</li>
	<li>Utilizzare un pennello bagnato per raccogliere membranose bianchi dalle pareti delle bottiglie e trasferirli alle diapositive di vetro (Figura 1). La messa in scena del tempo tali che le pupe raggiungono la desiderata età quando a partire dal vivo imaging sotto il microscopio. Nota: Questi membranose come pupe più vecchi in termini di loro forma, ma sono ancora bianchi come larve. L'inizio della fase di prepupa è definito come 0 h dopo la formazione del pupario (0h APF).</li>
	<li>Rimuovere macchie di cibo volo attaccando per le pupe con un pennello bagnato e orientare il lato ventrale delle pupe verso il vetrino utilizzando uno stereomicroscopio (Figura 1). Scartare le pupe che sono ancora in movimento (troppo giovane) o che hanno iniziato a girare il colore marrone (troppo vecchio). Questo assicura che tutte le pupe hanno la stessa età (0 - 1 h APF).</li>
	<li>Marcare i vetrini con genotipo, data e ora della raccolta. Trasferire i vetrini in una capsula di petri e aggiungere un panno umido per evitare che le pupe secchino (Figura 1E).</li>
	<li>Memorizzare le pupe in un incubatore a 25 ° C o 27 ° C, fino a quando raggiungono l'età desiderata. Continuare con i passaggi successivi 1 h prima di formazione immagine, in modo che le pupe hanno desiderato età quando a partire dal vivo imaging (passaggio 3), ad esempio a 13 h APF per il film mostrato nella Figura 2A-D. Nota: Il più presto fattibile tempo punto di partenza è dopo testa-rovesciamento delle pupe che si verificano a 8-10 h APF a 27 ° C.</li>
</ol>2. preparare pupe per l'Imaging
<ol><li>Assicurarsi che le pupe ora incolli sul vetrino, come naturalmente si attaccano alle pareti delle bottiglie a causa di residui alimentari volare. Nessuna colla supplementare è richiesta. Se le pupe non si attacchino abbastanza bene a causa della elevata umidità, aprire la capsula di Petri per qualche minuto per farli asciugare. In alternativa, trasferirli al nastro biadesivo su un vetrino, ma di solito, questo non è necessario.</li>
	<li>
Finestra aperta nel caso pupal per l'imaging dei muscoli di volo indiretto (Figura 1F; Passare alla sezione 2.3 per l'imaging dei muscoli addominali).<ol>
<li>Orientare le pupe che attacca sul vetrino con l'anteriore si allontani il ricercatore sotto un microscopio stereoscopico. Regolare lo zoom 2x.</li>
		<li>Utilizzando un'estremità della biologia del grado 5 # forcipe, delicatamente colpire un foro sul caso pupal dorsale nell'ala dove finisce l'addome e il torace comincia.</li>
		<li>Per sezionare aperto il caso pupal, delicatamente spostare la pinza all'estremità anteriore del torace lungo l'ala, ma evitare di danneggiare il tessuto vulnerabile ala. Nota: Se perdite di fluido dalla pupa, è danneggiato; eliminarlo e ricominciare da capo con una pupa differente.</li>
		<li>Sollevare la sezione del caso pupal sopra il torace con le pinze e poi tagliare questa sezione con le forbici fine, taglienti sul lato opposto della linea mediana dorsale.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Finestra aperta nel caso pupal per l'imaging dei muscoli addominali (Figura 1)<ol>
<li>Orientare le pupe che attacca sul vetrino con l'anteriore rivolta verso il ricercatore sotto un microscopio stereoscopico. Regolare lo zoom 2x.</li>
		<li>Utilizzando un'estremità della biologia del grado 5 # forcipe, delicatamente colpire un foro sul caso pupal dorsale nell'ala dove finisce il torace e l'addome inizia.</li>
		<li>Per sezionare aperto il caso pupal, muovete delicatamente la pinza verso l'estremità posteriore dell'addome. Nota: Se perdite di fluido dalla pupa, è danneggiato; eliminarlo e ricominciare da capo con una pupa differente.</li>
		<li>Sollevare la sezione del caso pupal sopra l'addome con il forcipe e poi tagliare questa sezione con le forbici fine, taglienti sul lato opposto della linea mediana dorsale.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Mount pupe (Figura 1 H)<ol>
<li>Utilizzare un pennello bagnato per trasferire fino a cinque pupe a una diapositiva in plastica con una scanalatura (Vedi costruito su misura, riutilizzabile, la discussione ed elenco dei materiali). Aggiungere uno o due vetrini coprioggetti distanziale per ciascun lato a seconda della profondità della scanalatura e lo spessore delle pupe. Mettere una piccola goccia di acqua sotto ogni vetrino coprioggetti distanziale per farlo aderire alla diapositiva e lasciare spazio tra il groove e i coprioggetti distanziale su ogni lato. Nota: Lamelle distanziatore possono anche essere fissate in modo permanente alla diapositiva con colla super, in anticipo.</li>
		<li>Orientare le pupe tale che l'apertura nel caso pupal sia rivolta verso l'alto utilizzando il pennello. Assicurare un posizionamento accurato delle pupe l'angolo corretto per buona qualità delle immagini. Ottimizzare l'angolo per ogni tessuto e punto di tempo inerente allo sviluppo. Nota: Una piccola quantità di acqua nella scanalatura rende il posizionamento delle pupe più facile. Scolare l'acqua in eccesso con il pennello in seguito per evitare l'annegamento.</li>
		<li>Tenere un vetrino coprioggetti (18 x 18 mm) sopra le pupe senza toccarli. Posizionare piccole goccioline (circa 0,5 µ l) di soluzione di glicerolo al 50% ogni caso pupal aprono il coprioggetto usando una pipetta di 20 µ l di cui sopra. Nota: Questa procedura assicura che le goccioline hanno la stessa spaziatura le pupe.</li>
		<li>Capovolgere il vetrino coprioggetto e posizionarlo sopra le pupe a mano o con forcipe (standard #5) mentre ci si riposa un lato del coprivetrino su lamelle distanziale accanto le pupe. Successivamente, dolcemente cadere il coprioggetto sulle pupe. Assicurarsi che le aperture di caso pupale correttamente vengono coperte con 50% glicerolo per la buona qualità delle immagini e per impedire le pupe asciugarsi.</li>
		<li>Piegare oltre un'estremità di un pezzo di nastro adesivo e afferrarla con la pinzetta (standard #5) a tal fine. Posizionare delicatamente il nastro che si estende su un bordo del coprivetrino superiore, il coverslip(s) distanziale e scivolo di plastica su un lato. Non premere verso il basso il nastro, ancora. In primo luogo, girarsi la diapositiva e ripetere per l'altro lato.</li>
		<li>Utilizzare entrambi i dito indice per premere verso il basso il nastro contemporaneamente su entrambi i lati. Questa procedura assicura che le pupe non sono sfollate.</li>
		<li>Controllare che le pupe siano bene a contatto con il vetrino coprioggetti. Per la qualità delle immagini ottima le pupe dovrebbero essere spremute delicatamente sotto il vetrino coprioggetti. Se necessario, regolare il numero di vetrini coprioggetti distanziale.</li>
		<li>Etichettare la diapositiva di scrittura sul nastro appiccicoso.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. live Imaging delle pupe
<ol><li>Il metodo di montaggio consente di formazione immagine delle pupe Microscopi rovesciati (Figura 1I) sia su microscopi (Figura 1J). Particolarmente adatto per formazione immagine diretta esegue la scansione di microscopi confocali, due-fotone microscopi e microscopi confocali di filatura disco indipendentemente dal fatto se essi sono invertiti o in posizione verticale. Per i film a lungo termine, è necessario utilizzare una fase temperatura controllata se disponibile.</li>
	<li>Utilizzando l'oculare e una lampada UV o trasmissione luce, individuare una pupa e un fuoco dentro la pupa.</li>
	<li>Con la fotocamera, trovare la struttura desiderata e regolare il livello di zoom.</li>
	<li>Per i film a lungo termine, definire un z-stack che comprende la struttura di interesse ben (ad esempio, i muscoli di volo indiretto, loro siti di attaccamento, le cellule del tendine o una combinazione del suddetto) e scegliere un intervallo di tempo. Prendere in considerazione facendo una media per una migliore qualità di immagine. Per i film ad alta velocità, a breve termine, scegliere un singolo z-aereo per raggiungere un frame rate elevato.</li>
	<li>Regolare la potenza del laser per dare il miglior segnale possibile ma poco saturazione. Tuttavia, anche ad alta potenza laser può danneggiare la pupa nel corso del tempo.</li>
	<li>Avviare imaging e tornare di tanto in tanto controllare il film e riadattare il posizionamento dello stack z se necessario.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57312/57312fig1.jpg"> Figura 1: flusso di lavoro per formazione immagine dal vivo della morfogenesi muscolo-tendinee in Drosophila pupe. Vedi protocollo per dettagli. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57312/57312fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

<ol>
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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Il protocollo presentato descrive come immagine morfogenesi muscolo-tendinee in vita Drosophila pupe utilizzando una varietà di proteine fluorescente etichettate. Questo in vivo imaging strategia può essere utilizzato per studiare i processi di sviluppo nel loro ambiente naturale dell'intero organismo.
È fondamentale per un esperimento riuscito trovare il punto corretto tempo inerente allo sviluppo per analizzare. Ad esempio, i muscoli di volo indiretto di dorsolongitudinal avviare attaccamento verso i loro obiettivi di tendine a ≈16 h APF23 mentre i muscoli addominali si sviluppano più tardi e allegare su entrambe le estremità solo tra 30 e 40 h APF26. Di conseguenza, la letteratura precedentemente pubblicata deve essere utilizzato per trovare i punti di momento di sviluppo per analizzare o, se il tessuto o la struttura di interesse non è stato studiato in dettaglio prima, lo sviluppo complessivo deve essere caratterizzato in primo luogo.
Per pupe di montaggio con successo sui vetrini in plastica su misura, è importante che le scanalature hanno dimensioni idonee: la necessità di scanalature di essere 1,0-1,5 mm larga e 0,3 - 0,4 mm di profondità. Questa profondità permette di regolare la distanza precisa per il coprioggetto superiore con distanziale coprioggetti come necessario. Tuttavia, almeno un vetrino coprioggetti distanziatore dovrebbero essere utilizzato per evitare un consumo eccessivo del glicerolo di 50% dal campione da forze capillari. Il corretto posizionamento delle pupe nella scanalatura richiede alcune esperienza e dovrebbe essere ottimizzati tale che la struttura di interesse è il più vicina possibile per il vetrino coprioggetti.
Se un gran numero di pupe è supposto per essere imaged in sessione uno microscopio, possono tutti essere montati in anticipo e poi conservati in un incubatore fino imaging per garantire la corretta tempi inerente allo sviluppo. Le pupe dovrebbero sopravvivere l'intera procedura e anche almeno cercare di eclose se mantenuto sulla diapositiva dopo formazione immagine. Il tasso di sopravvivenza può essere utilizzato come una lettura per verificare se le condizioni di imaging danneggiano le pupe.
Le impostazioni di imaging dovrebbero essere scelti con cura secondo i requisiti sperimentali. Per i film a breve termine, un frame rate elevato contro un elevato rapporto segnale-rumore deve essere bilanciata, mentre relativamente ad alta potenza laser può essere utilizzato senza danneggiare troppo le pupe. Tuttavia, per i film a lungo termine, la potenza del laser deve essere mantenuto ad un livello moderato e le pupe non dovrebbero essere imaged continuamente ma piuttosto a determinati punti di tempo, ad esempio, ogni 20 min. Per garantire che la struttura di interesse non si muove fuori del campo di vista, potrebbe essere necessario riadattare il posizionamento dello z-stack tra intervalli di tempo. A nostra conoscenza, l'apertura del caso pupal non pregiudica per sé tempistica inerente allo sviluppo. Tuttavia, una fase di temperatura controllata dovrebbe essere utilizzata per i film a lungo termine per garantire la corretta tempi inerente allo sviluppo. Tenendo presenti queste considerazioni, film altamente informativo può essere acquisito.
Il protocollo presentato consente di visualizzare non solo morfogenesi muscolo-tendinee, ma anche altri tessuti in via di sviluppo, ad esempio, l'ala epitelio29. Sono necessarie solo tre modifiche al presente protocollo: (1) l'apertura del caso pupal sopra l'ala invece il torace o dell'addome, (2) posizionamento di pupe con l'ala verso il coprioggetto superiore e (3) l'uso di proteine differenti marcatore fluorescente. Con l'avanzamento della CRISPR/Cas9-tecnologia, sempre più in modo endogeno con tag proteine fluorescenti sarà disponibile, perché è diventato più semplice per indirizzare endogeni loci nella Drosophila30,31 , 32. in futuro, questo vi permetterà di chiarire le dinamiche di numerose proteine, cellule e tessuti intero nel loro ambiente fisiologico in dettaglio.

L'apparato muscolo-tendinee permette animali compreso gli esseri umani per spostare le loro parti del corpo. I mattoni molecolari del sistema muscolo-tendinee sono altamente conservati. Di conseguenza, concetti di sviluppo muscolo-tendinee pertinente per la biologia del muscolo umano, ad esempio la morfogenesi del muscolo, muscolo-tendinee attaccamento e autorganizzazione Miofibrilla, possono essere studiati utilizzando Drosophila melanogaster come un facilmente accessibile modello di sistema. Il sistema di pupal Drosophila ha diversi vantaggi sperimentali. In primo luogo, nella fase pupal – quando si formano i muscoli adulti – l'organismo è sessile e quindi facile da immagine su un microscopio su un periodo di ore o addirittura giorni. In secondo luogo, forma molti muscoli abbastanza sotto la superficie pupal vicino così che essi possono essere imaged all'interno dell'organismo intatto, parzialmente traslucido. In terzo luogo, i muscoli possono essere studiati nel loro ambiente naturale, dove sono collegati per l'esoscheletro formatura tramite le cellule del tendine e si costruisce la tensione dei tessuti. Questo non è possibile in sistemi di colture cellulari del muscolo. E infine, una pletora di strumenti genetici è disponibile in Drosophila. Tra questi ci sono molti marcatori fluorescente con tag che permettono di etichettatura di tipi cellulari specifici o strutture subcellulari per l'imaging in vivo.
La tabella 1 riassume i più importanti marcatori utilizzati per lo studio della morfogenesi muscolo-tendinee. Esso comprende marcatori sovraespressi utilizzando il sistema GAL4-UAS1 e in modo endogeno con tag proteina marcatori2,3,4. Il vantaggio del sistema GAL4-UAS è che i marcatori sono generalmente espressi ad alti livelli, risultante in un segnale forte che può facilmente essere imaged in intero-monta pupe. Inoltre, tessuto specificità può essere ottenuta scegliendo con cura i driver GAL4. Il vantaggio delle proteine di fusione espresso sotto controllo endogeno è che la dinamica delle rispettive proteine può essere studiato in vivo, mentre può essere utilizzati anche come marcatori per diversi tipi di cellule o specifiche strutture subcellulari, ad esempio, ΒPS-integrina-GFP per siti di attacco del muscolo. Insieme, questi indicatori forniscono elevata flessibilità nel disegno sperimentale e la scelta dei problemi di ricerca che può essere risolto ora e in futuro.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2">Struttura con etichetta</td>
			<td colspan="2">Marcatore</td>
			<td colspan="2">Espressione e localizzazione</td>
			<td colspan="2">Classe</td>
			<td colspan="2">Numero di azioni</td>
			<td colspan="2">Commento</td>
			<td>Rif.</td>
		</tr><tr><td colspan="2" rowspan="15">Muscolo</td>
			<td colspan="2">
MEF2-GAL4</td>
			<td colspan="2">tutti i mioblasti e tutti i muscoli in tutte le fasi</td>
			<td colspan="2">Gal4 linea</td>
			<td colspan="2">BL 27390</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td colspan="2">
1151-GAL4</td>
			<td colspan="2">precursori del muscolo adulto e primi miotubi fino alle h ≈24 APF</td>
			<td colspan="2">Linea di Gal4, trappola enhancer</td>
			<td colspan="2">-</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>6</td>
		</tr><tr><td colspan="2">
Act79B-GAL4</td>
			<td colspan="2">salto del muscolo su differenziazione</td>
			<td colspan="2">Gal4 linea</td>
			<td colspan="2">-</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>7</td>
		</tr><tr><td colspan="2">
Act88F-GAL4</td>
			<td colspan="2">muscoli di volo indiretto a partire ≈14 h APF</td>
			<td colspan="2">Gal4 linea</td>
			<td colspan="2">-</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>7</td>
		</tr><tr><td colspan="2">
Act88F- Cameleon 3.1</td>
			<td colspan="2">muscoli di volo indiretto a partire ≈14 h APF</td>
			<td colspan="2">Act88F enhancer / promotore guida 3.1 Cameleon</td>
			<td colspan="2">-</td>
			<td colspan="2">Indicatore di CA2 +</td>
			<td>8</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Act88F-GFP</td>
			<td colspan="2">muscoli di volo indiretto a partire ≈14 h APF</td>
			<td colspan="2">GFP-fusione (linea di volo TransgeneOme)</td>
			<td colspan="2">fTRG78 e fTRG10028</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>4</td>
		</tr><tr><td colspan="2">
Lui- nls-GFP</td>
			<td colspan="2">precursori del muscolo adulto, nucleari, fino al ≈24 h APF nei muscoli di volo indiretto</td>
			<td colspan="2">Enhancer/promotore con reporter nls-GFP</td>
			<td colspan="2">-</td>
			<td colspan="2">frammento del rinforzatore di 1,5 kb</td>
			<td>9</td>
		</tr><tr><td colspan="2">
MHC-Tau-GFP</td>
			<td colspan="2">microtubuli in modelli di DLM e nella differenziazione di muscoli</td>
			<td colspan="2">Enhancer/promotore con reporter Tau-GFP</td>
			<td colspan="2">BL 53739</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>10</td>
		</tr><tr><td colspan="2">ΒTub60D-GFP</td>
			<td colspan="2">microtubuli in miotubi (ad es. nei muscoli di volo indiretto da ≈14 h AFP, diminuendo fortemente dopo ≈48 h APF)</td>
			<td colspan="2">GFP-fusione (linea di volo TransgeneOme)</td>
			<td colspan="2">fTRG958</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>4</td>
		</tr><tr><td colspan="2">MHC-GFP (weeP26)</td>
			<td colspan="2">sarcomeri (filamento spesso) in tutti i muscoli del corpo (ad es. nei muscoli di volo indiretto a partire da 30 h APF)</td>
			<td colspan="2">GFP-trappola</td>
			<td colspan="2">-</td>
			<td colspan="2">utilizzare eterozigoti, un sottoinsieme di isoforma di etichette</td>
			<td>11</td>
		</tr><tr><td colspan="2">SLS-GFP</td>
			<td colspan="2">sarcomeri (Z-disco) in tutti i muscoli del corpo (ad es. nei muscoli di volo indiretto a partire da 30 h APF)</td>
			<td colspan="2">GFP-trappola (linea acchiappamosche)</td>
			<td colspan="2">-</td>
			<td colspan="2">G53, uso eterozigotico</td>
			<td>2</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Zasp66-GFP</td>
			<td colspan="2">Z-disco in tutti i muscoli del corpo</td>
			<td colspan="2">GFP-trappola (linea acchiappamosche)</td>
			<td colspan="2">BL 6824</td>
			<td colspan="2">ZCL0663</td>
			<td>
2 , 12
</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Zasp52-GFP</td>
			<td colspan="2">Z-disco in tutti i muscoli del corpo</td>
			<td colspan="2">GFP-trappola (linea acchiappamosche)</td>
			<td colspan="2">BL 6838</td>
			<td colspan="2">G00189</td>
			<td>
2 , 12
</td>
		</tr><tr><td colspan="2">HTS-GFP</td>
			<td colspan="2">associazione di actina; espresso in miotubi, mioblasti e dell'epitelio</td>
			<td colspan="2">GFP-fusione (linea di volo TransgeneOme)</td>
			<td colspan="2">fTRG585</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>4</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Dlg1-GFP</td>
			<td colspan="2">giunzioni delle cellule epiteliali, mioblasti e membrane nei muscoli in tutte le fasi</td>
			<td colspan="2">GFP-fusione (linea di volo TransgeneOme)</td>
			<td colspan="2">fTRG502</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>4</td>
		</tr><tr><td colspan="2" rowspan="5">Luogo del collegamento del muscolo</td>
			<td colspan="2">ΒPS-integrina-GFP</td>
			<td colspan="2" fo:page-break-inside="avoid">siti di muscolo allegato (ad es., partenza ≈18 h AFP nei muscoli di volo indiretto)</td>
			<td colspan="2">GFP-knock-in</td>
			<td colspan="2">-</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>13</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Talin-GFP e - mCherry</td>
			<td colspan="2">siti di muscolo allegato (ad es., partenza ≈18 h AFP nei muscoli di volo indiretto)</td>
			<td colspan="2">GFP-trappola (MiMIC linea)</td>
			<td colspan="2">-</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>3</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Talin-GFP</td>
			<td colspan="2">siti di muscolo allegato (ad es., partenza ≈18 h AFP nei muscoli di volo indiretto)</td>
			<td colspan="2">GFP-fusione (linea di volo TransgeneOme)</td>
			<td colspan="2">fTRG587</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>4</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Ilk-GFP</td>
			<td colspan="2">siti di muscolo allegato (ad es., partenza ≈18 h AFP nei muscoli di volo indiretto)</td>
			<td colspan="2">GFP-trappola (linea acchiappamosche)</td>
			<td colspan="2">Kyoto 110951 (ZCL3111)</td>
			<td colspan="2">ZCL3111, ZCL3192</td>
			<td>2</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Vinc-GFP e - RFP</td>
			<td colspan="2">siti di muscolo allegato (ad es., partenza ≈18 h AFP nei muscoli di volo indiretto)</td>
			<td colspan="2">GFP-fusione (transgene)</td>
			<td colspan="2">-</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>13</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Tendine</td>
			<td colspan="2">
Sr-GAL4</td>
			<td colspan="2">cellule del tendine di torace, durante fase pupal</td>
			<td colspan="2">Linea di Gal4, trappola enhancer</td>
			<td colspan="2">BL 26663</td>
			<td colspan="2">omozigotica letale</td>
			<td>14</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Muscolo e tendine</td>
			<td colspan="2">
DUF-GAL4</td>
			<td colspan="2">muscoli ed epiteli, esordio precoce</td>
			<td colspan="2">Gal4 linea</td>
			<td colspan="2">BL 66682</td>
			<td colspan="2">Kirre-rP298, indicatore di cella del fondatore</td>
			<td>15</td>
		</tr><tr><td colspan="2" rowspan="7">UAS-reporter</td>
			<td colspan="2">
UAS- GFP-Gma</td>
			<td colspan="2">associazione di actina</td>
			<td colspan="2">Linea UAS</td>
			<td colspan="2">BL 31776</td>
			<td colspan="2">dominio legante l'actina di moesina fusa alla GFP</td>
			<td>16</td>
		</tr><tr><td colspan="2">
UAS- mCherry-Gma</td>
			<td colspan="2">associazione di actina</td>
			<td colspan="2">Linea UAS</td>
			<td colspan="2">-</td>
			<td colspan="2">GMA fusa a mCherry</td>
			<td>17</td>
		</tr><tr><td colspan="2">
UAS- Lifeact-GFP</td>
			<td colspan="2">associazione di actina</td>
			<td colspan="2">Linea UAS</td>
			<td colspan="2">BL 35544</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>18</td>
		</tr><tr><td colspan="2">
UAS- Lifeact-Ruby</td>
			<td colspan="2">associazione di actina</td>
			<td colspan="2">Linea UAS</td>
			<td colspan="2">BL 35545</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>18</td>
		</tr><tr><td colspan="2">
UAS-CD8-GFP</td>
			<td colspan="2">associazione di membrana</td>
			<td colspan="2">Linea UAS</td>
			<td colspan="2">varie azioni, ad esempio: BL 32184</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>19</td>
		</tr><tr><td colspan="2">
UAS-CD8-mCherry</td>
			<td colspan="2">associazione di membrana</td>
			<td colspan="2">Linea UAS</td>
			<td colspan="2">BL 27391 e 27392</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>20</td>
		</tr><tr><td colspan="2">
UAS-Palma-mCherry</td>
			<td colspan="2">associazione di membrana attraverso palmitoilazione</td>
			<td colspan="2">Linea UAS</td>
			<td colspan="2">BL 34514</td>
			<td colspan="2">
UAS- brainbow</td>
			<td>21</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 1: Etichetta fluorescente proteine marker adatto per lo studio del muscolo-tendine morfogenesi in vivo.
Qui, descriviamo dettagliatamente come formazione immagine della morfogenesi muscolo-tendinee in pupe vivente può essere eseguita facilmente e con successo (Figura 1). In alternativa, possono essere fissati pupe, sezionato e immunostained, che consente l'utilizzo di anticorpi per etichettare anche proteine per cui no vivo marcatori sono disponibili22. In questo caso, la qualità delle immagini è generalmente superiore perché non c'è nessun movimento e la struttura di interesse può essere collocata in prossimità del vetrino coprioggetti. Tuttavia, la dissezione e la fissazione può portare a danni e molecolari o dinamiche di tessuto, per esempio, spasmi muscolari, può essere studiato solo nell'organismo vivente.

<table><tbody><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Leica</td><td>MZ6</td><td>product has been replaced by Leica M60</td></tr><tr><td>fly food in bottles (or vials)</td><td>-</td><td>-</td><td>standard culture medium</td></tr><tr><td>paint brush</td><td>da Vinci</td><td>1526Y</td><td>size 1</td></tr><tr><td>microscope slides</td><td>Thermo Scientific</td><td>VWR: 631-1303</td><td>76 x 26 mm</td></tr><tr><td>double-sided tape (optional)</td><td>Scotch</td><td>6651263</td><td>12 mm x 6.3 m</td></tr><tr><td>petri dishes</td><td>Greiner Bio-One</td><td>632102</td><td>94 x 16 mm</td></tr><tr><td>paper tissues</td><td>Th.Geyer</td><td>7695251</td><td></td></tr><tr><td>forceps #5 (Dumont, inox, standard)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td>0.1 mm x 0.06 mm tip</td></tr><tr><td>forceps #5 (Dumont, inox, biology grade)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td>0.05 mm x 0.02 mm tip</td></tr><tr><td>Cohan-Vannas spring scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-02</td><td>straight tip</td></tr><tr><td>plastic slides with a groove (reusable)</td><td>custom-built</td><td>-</td><td>75 x 26 x 4 mm plexi glass slide with 1.0-1.5 mm wide and 0.3-0.4 mm deep groove</td></tr><tr><td>coverslips</td><td>Marienfeld</td><td>107032</td><td>18 x 18 mm, No. 1.5H</td></tr><tr><td>glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>49781</td><td>dilute to 50 % in water</td></tr><tr><td>adhesive tape</td><td>Tesa</td><td>57370-02</td><td>1.5 mm x 10 m</td></tr></tbody></table>

in vivo imaging of muscle-tendon morphogenesis in drosophila pupae

Muscoli insieme lo scheletro e tendini permettono animali compreso gli esseri umani per spostare le loro parti del corpo. Morfogenesi del muscolo è altamente conservata dagli animali agli esseri umani. Di conseguenza, il potente sistema di modello di Drosophila utilizzabile per approfondire concetti di sviluppo muscolo-tendine che può essere applicato anche alla biologia del muscolo umano. Qui, descriviamo dettagliatamente come morfogenesi del sistema muscolo-tendinee adulto può essere facilmente imaged in vita, lo sviluppo di Drosophila pupe. Quindi, il metodo consente di indagare le proteine, cellule e tessuti nel loro ambiente fisiologico. Oltre a un protocollo di passo-passo con consigli utili, forniamo una panoramica completa delle proteine marker fluorescente contrassegnati che sono adatti per lo studio del sistema muscolo-tendinee. Per evidenziare le applicazioni del protocollo, abbiamo Visualizza esempio film che vanno dalla visualizzazione degli eventi morfogenetici a lungo termine – che si verificano sulla scala del tempo di ore e giorni – visualizzazione di processi dinamici a breve termine come contrazioni muscolari che si verificano su scala di tempo di secondi. Presi insieme, questo protocollo dovrebbe consentire al lettore di progettare ed eseguire esperimenti live-imaging per indagare la morfogenesi del muscolo-tendine nell'organismo intatto.

Vari tessuti possono essere imaged in vivo nello sviluppo pupe volare, che li rende un sistema modello ideale per studiare la morfogenesi di organi adulti. Tra questi sono i muscoli di volo indiretto, l'epitelio di torace, comprese le cellule del tendine, l'epitelio dell'ala, muscoli addominali e il cuore22,23,24,25,26 , 27. qui, ci concentriamo su formazione immagine dal vivo della morfogenesi del muscolo e tendine. Per una descrizione dettagliata del muscolo voli indiretti e morfogenesi dei muscoli addominali e ulteriori metodi per lo studio della biologia del muscolo in Drosophila, rimandiamo il lettore a Weitkunat e Schnorrer 201422.
Live imaging dei muscoli di volo indiretto
Per studiare lo sviluppo a lungo termine dei muscoli del volo indiretto che consiste dei muscoli dorsolongitudinal (DLMs) e i muscoli dorsoventral (DVMs), moesina globulare actina-associazione dominio contrassegnato con GFP (UAS -GFP-Gma) è stata espressa in tutte le i muscoli utilizzando il fattore di rinforzatore del Myocyte 2 (Mef2)-GAL4 driver (Figura 2A-D, Film S1). Prima di formazione immagine, è stata aperta una finestra nel caso pupal sopra il torace come mostrato in Figura 1F. Su un microscopio a due fotoni, z-stack sono stati acquisiti ogni 20 min per h 21 a partire da ≈11 h dopo la formazione del pupario (11h APF). In questo lasso di tempo, la DLMs (verde sovrapposizioni nella Figura 2A'-D') prima di avviare collegamento alle cellule del tendine (Figura 2A) e quindi di dividere mentre gli allegati muscolari mature (Figura 2B). Successivamente, i miotubi accorciano (Figura 2) fino a raggiungere infine la fase compattata al massimo a 30 h APF (Figura 2D). Presi insieme, questo film mette in evidenza i drammatici cambiamenti nella morfologia del muscolo che si verificano sulla scala del tempo di ore.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57312/57312fig2.jpg"> Figura 2: Live imaging della morfogenesi di muscolo e tendine di voli indiretti. (A-D) Punti da un filmato di due fotoni (film S1) utilizzando Mef2tempo-GAL4, UAS- GFP-Gma come marcatore per l'actina nei muscoli del volo indiretto che consiste dei muscoli dorsolongitudinal (DLMs, evidenziata in verde nell'A '-D') e la (muscoli dorsoventral DVMs, evidenziata in blu nell'A '-D'). Barre della scala sono 100 µm. (E-H) tempo punti da un filmato di due fotoni (film S2) utilizzando Duf-GAL4UAS-CD8-GFP come indicatore per i muscoli di volo indiretto e l'epitelio di torace compreso le cellule del tendine. Pannelli E'-H' mostrare una sovrapposizione con un modello del sistema muscolo-tendinee in ogni punto del tempo, evidenziando le estensioni lungo cellulare formata dall'epitelio del tendine (magenta) a contatto con i muscoli (verde). Barre della scala sono 100 µm (stimato dalla dimensione delle strutture imaged). (I-L) Tempo punti da un film di confocal di due colori, filatura disco (film S3) concentrandosi sull'iniziazione allegato muscolo-tendinee. Le cellule del tendine sono etichettate con sr-GAL4UAS-palm-mCherry (magenta) e il dorsolongitudinal indiretta volo muscoli con Mhc -Tau-GFP (green). Barre della scala sono 10 µm. tempo è indicato come HH: mm dopo formazione pupario (APF). Si noti che non tutti i film sono stati acquistati su un palco a temperatura controllata, pertanto, può divergere tempistica inerente allo sviluppo. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57312/57312fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Per lo studio della morfogenesi del tendine e del muscolo allo stesso tempo, membrana-limita GFP (UAS -CD8-GFP) è stato espresso utilizzando Dumbfounded (Duf)-GAL4 come un driver, che si esprime sia nelle cellule del tendine e i muscoli di volo indiretto (Figura 2E -H, film S2). Uno z-stack è stata presa su un microscopio a due fotoni ogni 20 min a partire a 16 h APF per 20 h. Mentre i miotubi compatto (sovrapposizione verde in Figura 2E'-H'), il tendine cellule estensioni lungo cellulare modulo che allungano con tempo (magenta sovrapposizione in Figura 2E'-H'). Presi insieme, questo film mette in evidenza la stretta interazione tra il tendine e muscolo cellule in vivo.
Per studiare l'interazione muscolo-tendinee più in dettaglio, due colori, ad alto ingrandimento imaging è stata eseguita. Pupe con catena pesante della miosina (Mhc)-Tau-GFP nella DLMs e UAS -palmitoilazione-mCherry (UAS -palm-mCherry) guidato da striscia (sr)-GAL4 nei tendini erano imaged ogni 5 min a partire da 12 h APF per 4,5 h su un disco che gira microscopio confocale (Figura 2I-L, film S3). A 12 h APF, i miotubi migrano verso loro cellule bersaglio del tendine formando lungo filopodi sulla loro punta (Figura 2I). Successivamente, i muscolo e tendine tessuti interdigitazione (Figura 2J, K) per formare un collegamento stabile. Come l'allegato matura, meno filopodi modulo e l'interfaccia muscolo-tendinee leviga (Figura 2 L). Così, due colori, ad alto ingrandimento imaging consente di rivelare la dinamica cellulare in dettaglio nell'organismo vivente.
Live imaging dei muscoli addominali
Per formazione immagine diretta dei muscoli addominali (Figura 3film S4), Mef2-GAL4> UAS-CD8-GFP è stato usato come un indicatore e una finestra è stata aperta sopra l'addome nel caso pupal come descritto in dettaglio nella Figura 1. Simile al film di muscolo voli indiretti rappresentato in Figura 2A-D, la formazione e la crescita dei muscoli addominali possono essere seguite su molte ore di sviluppo (55H nel film S4). Durante questo periodo, i mioblasti fusibile per formare miotubi (Figura 3A) in crescita. I suggerimenti di miotubi migrano verso i loro obiettivi di tendine, e dopo il collegamento per le cellule del tendine, si formano le unità contrattile dei muscoli, i sarcomeri, (Figura 3B-D).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57312/57312fig3.jpg"> Figura 3: Live imaging della morfogenesi del muscolo addominale. (A-D) Punti da un filmato (Movie S4) utilizzando Mef2tempo-GAL4UAS-CD8-GFP come marcatore di seguire la morfogenesi dei muscoli addominali. Pannelli A'-E' mostrare sovrapposte con modelli di un insieme di muscoli addominali (verde) che si forma de novo durante la fase di pupa. Barre della scala sono 100 µm. tempo è indicato come HH: mm APF. Il film è stato acquisito a temperatura ambiente. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57312/57312fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Live imaging di contraendo i muscoli
In contrasto con la Figura 2 e Figura 3, Figura 4 Mostra dinamiche muscolari che si verificano sulla scala del tempo di secondi: la registrazione dal vivo di contrazioni muscolari. Pupe esprimendo βPS-integrina-GFP sotto controllo endogeno erano imaged con una risoluzione temporale di 0.65 s in un unico piano z su un microscopio confocale (Film S5). Nell'esempio visualizzato nella Figura 4, i siti di collegamento di tre DVMs (Figura 4A) erano imaged per 10 min a partire da 42 h APF. Durante questo tempo, twitch cinque eventi sono stati osservati (fig. 4B-F), mostrando che i sarcomeri sono già assemblati abbastanza bene per sostenere sviluppo coordinate contrazioni in questo momento. Quindi, imaging di contrazioni muscolari può essere utilizzato come una lettura funzionale per sarcomerogenesis già durante lo sviluppo del muscolo voli indiretti28, al contrario ad esempio prove di volo, che può essere eseguita solo dopo eclosion.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57312/57312fig4.jpg"> Figura 4: Live imaging di contraendo i muscoli. (A) primo tempo-punto da un filmato (Movie S5) mostrando contrazioni dei muscoli dorsoventral voli indiretti alle 42h APF utilizzando βPS-integrina-GFP come indicatore. Nel campo di vista è il muscolo allegato siti DVM II 2, DVM III 1 e DVM III 2. (B-F) Colore sovrapposizioni di cinque eventi di twitch individuali, ognuna mostrando il telaio prima della contrazione (magenta) e il primo fotogramma dell'evento twitch (verde). Si noti che le singole fibre di muscolo contrarsi in modo indipendente gli uni dagli altri. Le frecce evidenziano il movimento contrazioni. La risoluzione di tempo del film è 0,65 s. barre della scala sono 25 µm. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57312/57312fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Live imaging di proteine etichettate in modo endogeno
Simile a βPS-integrina-GFP, una grande collezione di proteine di fusione espressa in Drosophila sotto controllo endogeno è stato generato2,3,4. Queste linee di volare possono essere utilizzate per studiare ad esempio la localizzazione subcellulare o i profili di espressione di proteine di interesse. La collezione è particolarmente utile se gli anticorpi specifici non sono disponibili o proteina dinamiche devono essere studiati in vivo senza fissazione. Figura 5 vengono illustrati tre esempi di proteine di fusione in modo endogeno espresse dalla libreria TransgeneOme (fTRG) Vola, Hu li tai shao (Hts)-GFP (Figura 5A, B), Talin-GFP (Figura 5, D) e βTubulin60D-GFP ( Figura 5E, F). L'espressione di queste proteine può essere studiata in tutti i tessuti che li esprimono naturalmente. Qui, indichiamo l'epitelio del torace (Figura 5AC, E) e i muscoli di volo indiretto o loro siti allegato (figura 5BD, F) come esempi.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57312/57312fig5.jpg"> Figura 5: Live imaging di endogenamente etichetta proteine. (A, B) Massime proiezioni di z-stack prese di pupe esprimendo Hts-GFP. (C, D) Massime proiezioni di z-stack prese di pupe esprimendo la Talin-GFP. (E, F) Massime proiezioni di z-stack prese di pupe esprimendo βTubulin60D-GFP. Pannelli A, C ed E mostrare l'epitelio del torace a 18, 24 e 18 h APF, rispettivamente e pannelli B, D e F mostrare i muscoli di volo indiretto o loro siti allegato a 30 h APF. Barre della scala sono 25 µm. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57312/57312fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

Qui, presentiamo un metodo facile da usare e versatile per eseguire dal vivo imaging dei processi di sviluppo nella morfogenesi generale e muscolo-tendinee in particolare nella vita della drosofila pupe.

In Vivo Formazione immagine del muscolo-tendine morfogenesi in Drosophila pupe

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from ...

in-vivo-imaging-of-muscle-tendon-morphogenesis-in-drosophila-pupae

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

11.3K Views.  Max Planck Institute of Biochemistry. Qui, presentiamo un metodo facile da usare e versatile per eseguire dal vivo imaging dei processi di sviluppo nella morfogenesi generale e muscolo-tendinee in particolare nella vita della drosofila pupe.

Video: In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track during live cell imaging. These processes include: retinal rotation, cell growth and organismal movement. Additionally, irregularities in the topology of the epithelium, including subtle bumps and folds often introduced as the pupa is prepared for imaging, make it challenging to acquire in-focus images of more than a few ommatidia in a single focal plane. The workflow outlined here remedies these issues, allowing easy analysis of cellular processes during Drosophila pupal eye development. Appropriately-staged pupae are arranged in an imaging rig that can be easily assembled in most laboratories. Ubiquitin-DE-Cadherin:GFP and GMR-GAL4&#8211;driven UAS-&#945;-catenin:GFP are used to visualize cell boundaries in the eye epithelium 1-3. After deconvolution is applied to fluorescent images captured at multiple focal planes, maximum projection images are generated for each time point and enhanced using image editing software. Alignment algorithms are used to quickly stabilize superfluous motion, making individual cell behavior easier to track.

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.

Live-imaging del<em&gt; Drosophila</em&gt; Pupa Eye

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have been used to study many biological processes, such as cell proliferation, differentiation, growth, migration, apoptosis, competition, cell-cell signaling, and compartmental boundary formation. However, methods for the long-term ex vivo culture and live imaging of the imaginal discs have not been satisfactory, despite many efforts. Recently, we developed a method for the long-term ex vivo culture and live imaging of imaginal discs for up to 18 h. In addition to using a high insulin concentration in the culture medium, a low-melting agarose was also used to embed the disc to prevent it from drifting during the imaging period. This report uses the eye-antennal discs as an example. Photoreceptor R3/4-specific m&#948;0.5-Ga4 expression was followed to demonstrate that photoreceptor differentiation and ommatidial rotation can be observed during a 10 h live imaging period. This is a detailed protocol describing this simple method.

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

This protocol describes a detailed method for the long-term ex vivo culture and live imaging of a Drosophila imaginal disc. It demonstrates photoreceptor differentiation and ommatidial rotation within the 10 h period of live imaging of the eye disc. The protocol is simple and does not require expensive setup.

A lungo termine Imaging in diretta di<em&gt; Drosophila</em&gt; Disco Eye

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches

Drosophila flight muscle is a powerful model to study diverse processes such as transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and mechanobiology, which all influence muscle development and myofibrillogenesis. Omics data, such as those generated by mass spectrometry or deep sequencing, can provide important mechanistic insights into these biological processes. For such approaches, it is beneficial to analyze tissue-specific samples to increase both selectivity and specificity of the omics fingerprints. Here we present a protocol for dissection of fluorescent-labeled flight muscle from live pupae to generate highly enriched muscle samples for omics applications. We first describe how to dissect flight muscles at early pupal stages (&#60;48 h after puparium formation [APF]), when the muscles are discernable by green fluorescent protein (GFP) labeling. We then describe how to dissect muscles from late pupae (&#62;48 h APF) or adults, when muscles are distinguishable under a dissecting microscope. The accompanying video protocol will make these technically demanding dissections more widely accessible to the muscle and Drosophila research communities. For RNA applications, we assay the quantity and quality of RNA that can be isolated at different time points and with different approaches. We further show that Bruno1 (Bru1) is necessary for a temporal shift in myosin heavy chain (Mhc) splicing, demonstrating that dissected muscles can be used for mRNA-Seq, mass spectrometry, and reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) applications. This dissection protocol will help promote tissue-specific omics analyses and can be generally applied to study multiple biological aspects of myogenesis.

Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches

Drosophila flight muscle is a powerful model to study transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and mechanobiology. We present a protocol for dissection of fluorescent-labeled flight muscle from live pupae to generate highly enriched samples ideal for proteomics and deep-sequencing. These samples can offer important mechanistic insights into diverse aspects of muscle development.

Dissezione dei muscoli di volo di Drosophila melanogaster per gli approcci Omics

Drosophila flight muscle is a powerful model to study diverse processes such as transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and ...

Genetica

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Visualizing developing organ formation as well as progession and treatment of disease often heavily relies on the ability to optically interrogate molecular and functional changes in intact living organisms. Most existing optical imaging methods are inadequate for imaging at dimensions that lie between the penetration limits of modern optical microscopy (0.5-1mm) and the diffusion-imposed limits of optical macroscopy (&gt;1cm) [1]. Thus, many important model organisms, e.g. insects, animal embryos or small animal extremities, remain inaccessible for in-vivo optical imaging. 
Although there is increasing interest towards the development of nanometer-resolution optical imaging methods, there have not been many successful efforts in improving the imaging penetration depth. The ability to perform in-vivo imaging beyond microscopy limits is in fact met with the difficulties associated with photon scattering present in tissues. Recent efforts to image entire embryos for example [2,3] require special chemical treatment of the specimen, to clear them from scattering, a procedure that makes them suitable only for post-mortem imaging. These methods however evidence the need for imaging larger specimens than the ones usually allowed by two-photon or confocal microscopy, especially in developmental biology and in drug discovery.
We have developed a new optical imaging technique named Mesoscopic Fluorescence Tomography [4], which appropriate for non-invasive in-vivo imaging at dimensions of 1mm-5mm. The method exchanges resolution for penetration depth, but offers unprecedented tomographic imaging performance and it has been developed to add time as a new dimension in developmental biology observations (and possibly other areas of biological research) by imparting the ability to image the evolution of fluorescence-tagged responses over time. As such it can accelerate studies of morphological or functional dependencies on gene mutations or external stimuli, and can importantly, capture the complete picture of development or tissue function by allowing longitudinal time-lapse visualization of the same, developing organism.
The technique utilizes a modified laboratory microscope and multi-projection illumination to collect data at 360-degree projections. It applies the Fermi simplification to Fokker-Plank solution of the photon transport equation, combined with geometrical optics principles in order to build a realistic inversion scheme suitable for mesoscopic range. This allows in-vivo whole-body visualization of non-transparent three-dimensional structures in samples up to several millimeters in size.
We have demonstrated the in-vivo performance of the technique by imaging three-dimensional structures of developing Drosophila tissues in-vivo and by following the morphogenesis of the wings in the opaque Drosophila pupae in real time over six consecutive hours.

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Mesoscopic fluorescence tomography operates beyond the penetration limits of tissue-sectioning fluorescence microscopy. The technique is based on multi-projection illumination and a photon transport description. We demonstrate in-vivo whole-body 3D visualization of the morphogenesis of GFP-expressing wing imaginal discs in Drosophila melanogaster.

Mesoscopici fluorescenza per Tomografia In-vivo Imaging di sviluppo Drosophila</em

Visualizing  developing organ formation as well as progession and treatment of disease often  heavily relies on the ability to optically interrogate ...

Biologia

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits are required to control this behavior. Failure to produce the rhythmic pattern of contractions can be indicative of neurological abnormalities. We previously found that defects in protein O-mannosylation, a posttranslational protein modification, affect the axon morphology of sensory neurons and result in abnormal coordinated muscle contractions in embryos. Here, we present a relatively simple method for recording and analyzing the pattern of peristaltic muscle contractions by live imaging of late stage embryos up to the point of hatching, which we used to characterize the muscle contraction phenotype of protein O-mannosyltransferase mutants. Data obtained from these recordings can be used to analyze muscle contraction waves, including frequency, direction of propagation and relative amplitude of muscle contractions at different body segments. We have also examined body posture and taken advantage of a fluorescent marker expressed specifically in muscles to accurately determine the position of the embryo midline. A similar approach can also be utilized to study various other behaviors during development, such as embryo rolling and hatching.

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Here, we present a method to record embryonic muscle contractions in Drosophila embryos in a non-invasive and detail-oriented manner.

Live Imaging e analisi delle contrazioni muscolari nell'embrione di Drosophila

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits ...

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

Within multicellular organisms, mature tissues and organs display high degrees of order in the spatial arrangements of their constituent cells. A remarkable example is given by sensory epithelia, where cells of the same or distinct identities are brought together via cell-cell adhesion showing highly organized planar patterns. Cells align to one another in the same direction and display equivalent polarity over large distances. This organization of the mature epithelia is established over the course of morphogenesis. To understand how the planar arrangement of the mature epithelia is achieved, it is crucial to track cell orientation and growth dynamics with high spatiotemporal fidelity during development in vivo. Robust analytical tools are also essential to identify and characterize local-to-global transitions. The Drosophila pupa is an ideal system to evaluate oriented cell shape changes underlying epithelial morphogenesis. The pupal developing epithelium constitutes the external surface of the immobile body, allowing long-term imaging of intact animals. The protocol described here is designed to image and analyze cell behaviors at both global and local levels in the pupal abdominal epidermis as it grows. The methodology described can be easily adapted to the imaging of cell behaviors at other developmental stages, tissues, subcellular structures, or model organisms.

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

This protocol is designed for the imaging and analysis of the dynamics of cell orientation and tissue growth in the Drosophila abdominal epithelia as the fruit fly undergoes metamorphosis. The methodology described here can be applied to the study of different developmental stages, tissues, and subcellular structures in Drosophila or other model organisms.

Imaging e analisi dell'orientamento dei tessuti e delle dinamiche di crescita nell'epiteliale della Drosophila in via di sviluppo durante le fasi pupali

Within multicellular organisms, mature tissues and organs display high degrees of order in the spatial arrangements of their constituent cells. A ...

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal lines have enabled biological processes to be studied in the context of a living, and in some instances even behaving, organism. In this protocol we will describe how to anesthetize intact Drosophila larvae, using the volatile anesthetic desflurane, to follow the development and plasticity of synaptic populations at sub-cellular resolution1-3. While other useful methods to anesthetize Drosophila melanogaster larvae have been previously described4,5,6,7,8, the protocol presented herein demonstrates significant improvements due to the following combined key features: (1) A very high degree of anesthetization; even the heart beat is arrested allowing for lateral resolution of up to 150 nm1, (2) a high survival rate of &gt; 90% per anesthetization cycle, permitting the recording of more than five time-points over a period of hours to days2 and (3) a high sensitivity enabling us in 2 instances to study the dynamics of proteins expressed at physiological levels. In detail, we were able to visualize the postsynaptic glutamate receptor subunit GluR-IIA expressed via the endogenous promoter1 in stable transgenic lines and the exon trap line FasII-GFP1. (4) In contrast to other methods4,7 the larvae can be imaged not only alive, but also intact (i.e. non-dissected) allowing observation to occur over a number of days1. The accompanying video details the function of individual parts of the in vivo imaging chamber2,3, the correct mounting of the larvae, the anesthetization procedure, how to re-identify specific positions within a larva and the safe removal of the larvae from the imaging chamber.

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

This protocol describes a reliable method for anesthetization and imaging of intact Drosophila melanogaster larvae. We have utilized the volatile anesthetic desflurane to allow for repetitive imaging at sub-cellular resolution and re-identification of structures for up to a few days1.

Imaging in vivo di intatto Larve di Drosophila a livello sub-cellulare Risoluzione

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal ...

<meta charset="utf8"></head><body>Imaging dal vivo esteso della morfogenesi della zampa pupale di Drosophila senza pupario

Long-Term Live Imaging of Drosophila Pupal Leg Development After Puparium Removal

Over the past decades, significant progress has been made in understanding the mechanisms of cell fate determination. However, the process by which fate-determined cells form three-dimensional organismal shapes remains unclear. Recent advances in confocal microscopy have facilitated efforts to observe cell dynamics during development through live imaging. The Drosophila melanogaster pupa is ideal for live imaging due to its immobility, transparent pupal cuticle, and the availability of fluorescent reporter lines. A primary challenge for imaging is the puparium, the cuticle surrounding the pupa, which obstructs optical imaging. While previous methods involved either partial or complete removal of the puparium, maintaining pupal viability for extended periods after this procedure has remained challenging. Here, a simple method is presented for days-long live imaging of the Drosophila leg during the pupal stage, involving complete puparium removal. The method includes removing the puparium from a pupa adhered to double-sided tape, followed by assembling a small chamber on a glass-bottom dish to enclose the pupa and a drop of water. This setup is straightforward, reliable, and supports extended pupal survival by preventing desiccation. Long-term live imaging of the Drosophila pupa has significantly contributed to capturing how the adult leg undergoes dramatic three-dimensional structural changes over 2-3 days. These changes include the transient formation of an intriguing structure (the Parthenon-like structure) by epithelial cells, rapid tissue narrowing, joint formation, and bristle elongation. This method is applicable to the observation of various tissues and can potentially be combined with other techniques, such as optical gene induction, to advance the understanding of cell dynamics during the final shape formation of tissues in the pupal stage.

<meta charset="utf8"></head><body>Autore in primo piano: Scoprire le strutture epiteliali dinamiche durante lo sviluppo della Drosophila

Here, a protocol is presented for long-term live imaging of the Drosophila leg during the pupal stage, involving complete removal of the puparium. This protocol can also be applied to other tissues.

Imaging dal vivo a lungo termine dello sviluppo della zampa pupale di Drosophila dopo la rimozione del pupario

Over the past decades, significant progress has been made in understanding the mechanisms of cell fate determination. However, the process by which ...

In Vivo Formazione immagine del muscolo-tendine morfogenesi in Drosophila pupe

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Live-imaging del

A lungo termine Imaging in diretta di

Dissezione dei muscoli di volo di Drosophila melanogaster per gli approcci Omics

Mesoscopici fluorescenza per Tomografia In-vivo Imaging di sviluppo Drosophila

Live Imaging e analisi delle contrazioni muscolari nell'embrione di Drosophila

Imaging e analisi dell'orientamento dei tessuti e delle dinamiche di crescita nell'epiteliale della Drosophila in via di sviluppo durante le fasi pupali

Imaging in vivo di intatto Larve di Drosophila a livello sub-cellulare Risoluzione

Imaging dal vivo a lungo termine dello sviluppo della zampa pupale di Drosophila dopo la rimozione del pupario

Imaging dal vivo a lungo termine dello sviluppo della zampa pupale di Drosophila dopo la rimozione del pupario

Imaging dal vivo a lungo termine dello sviluppo della zampa pupale di Drosophila dopo la rimozione del pupario