Agradecemos a aquisição do filme S3-Manuela Weitkunat. Agradecemos a Reinhard Fässler generoso apoio. Este trabalho foi financiado pela EMBO Young Investigator programa (F.S.), o Conselho Europeu de investigação no âmbito do sétimo programa-quadro da União Europeia (FP/2007-2013) / ERC Grant 310939 (F.S.), a sociedade Max Planck (S.B.L., F.S.), o centro nacional de la Recherche Scientifique (CNRS) (F.S.), a iniciativa de excelência AMIDEX de Universidade de Aix-Marseille (F.S.), o LabEX-informar (F.S.) e a Boehringer Ingelheim Fonds (S.B.L.).

1. fase pupas
<ol><li>Configure um cruzamento com fêmeas virgens de 20-40 e cerca de 20 machos por garrafa de comida de mosca (figura 1A). Alternativamente, se os estoques serão usados, flip cada estoque em odres novos. Para obter suficiente pupas, considere a criação duas garrafas por genótipo.</li>
	<li>Incube as garrafas a 25 ° C (ou 27 ° C, de acordo com o projeto experimental) por cinco a seis dias (figura 1B). Nota: Manter invertendo as moscas a cada dois ou três dias para evitar superlotação e para garantir um fornecimento contínuo de pupas.</li>
	<li>Use um pincel molhado para coletar pré-pupa branca das paredes das garrafas e transferi-los para as lâminas de vidro (Figura 1). A encenação o tempo tal que as pupas alcançar o desejado idade quando começar ao vivo de imagens sob o microscópio. Nota: Estes pré-pupa parece mais velhas pupas em termos de sua forma, mas eles são ainda brancos como larvas. O início da fase de prepupal é definido como 0 h depois da formação do casulo (0 h APF).</li>
	<li>Remover grupos de mosca alimento grudar as pupas com um pincel molhado e orientar o lado ventral das pupas em direção a lâmina de vidro usando um microscópio (Figura 1). Descarte de pupas que ainda estão se movendo (muito jovem) ou que começaram a virar marrom (muito velho). Isso garante que todas as pupas têm a mesma idade (0 - 1 h APF).</li>
	<li>Rotule os slides com genótipo, data e hora da coleta. Transferir as lâminas de vidro para uma placa de Petri cada e adicionar um lenço molhado para evitar que as pupas de secar (Figura 1E).</li>
	<li>Armazene as pupas na incubadora a 25 ° C ou 27 ° C, até que eles atinjam a idade desejada. Continuar com os próximos passos 1 h antes de imagem, para que as pupas têm o desejado idade quando começar a imagem ao vivo (etapa 3), por exemplo, às 13h APF para o filme mostrado na Figura 2A-D. Nota: O mais antigo viável tempo ponto de partida é depois da cabeça-eversão das pupas ocorrem em 8-10 h APF a 27 ° C.</li>
</ol>2. prepare pupas para a imagem latente
<ol><li>Certifique-se de que as pupas agora manter a lâmina de vidro assim como naturalmente furam às paredes das garrafas por causa da comida de mosca residual. Não cola extra é necessária. Se as pupas não fica bem o suficiente por causa da alta umidade, abra a caixa de Petri para alguns min para deixá-los secar. Alternativamente, transferi-los para a fita dupla-face sobre uma lâmina de vidro, mas geralmente, isso não é necessário.</li>
	<li>
Janela aberta no caso para a imagem latente dos músculos de voo indirecto pupal (Figura 1F; Pular para seção 2.3 para a imagem latente dos músculos abdominais).<ol>
<li>Oriente as pupas degola para a lâmina de vidro com o anterior voltado para longe o pesquisador sob um estereomicroscópio. Ajuste o zoom de 2x.</li>
		<li>Usando uma das extremidades da biologia grau #5 pinças, suavemente fazer um buraco no caso da pupa dorsal à ala onde o abdome termina e começa o tórax.</li>
		<li>Para cortar aberto o caso pupal, suavemente mover a pinça para a extremidade anterior do tórax na asa, mas não danificar o tecido da asa vulnerável. Nota: Se o fluido pinga da pupa, está danificado; descartá-lo e começar de novo com uma pupa diferente.</li>
		<li>Levante a seção do caso pupal acima do tórax com a pinça e cortar esta seção com uma tesoura afiada, bem no lado oposto da linha média dorsal.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Janela aberta no caso de pupa para a imagem latente dos músculos abdominais (Figura 1)<ol>
<li>Oriente as pupas degola para a lâmina de vidro com a face anterior para o pesquisador sob um estereomicroscópio. Ajuste o zoom de 2x.</li>
		<li>Usando uma das extremidades da biologia grau #5 pinças, suavemente fazer um buraco no caso da pupa dorsal à ala onde termina o tórax e abdômen começa.</li>
		<li>Para cortar aberto o caso pupal, movimente suavemente a pinça em direcção a extremidade posterior do abdômen. Nota: Se o fluido pinga da pupa, está danificado; descartá-lo e começar de novo com uma pupa diferente.</li>
		<li>Levante a seção do caso pupal acima o abdômen com a pinça e cortar esta seção com uma tesoura afiada, bem no lado oposto da linha média dorsal.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Pupas de montagem (Figura 1 H)<ol>
<li>Use um pincel molhado para transferir pupas até cinco para um slide de plástico com um sulco (custom-built, reutilizáveis, veja discussão e lista de materiais). Adicione uma ou duas lamelas de espaçador para cada lado, dependendo da profundidade do sulco e a espessura das pupas. Colocar uma pequena gota de água por baixo de cada lamela de espaçador para torná-lo manter o slide e deixar algum espaço entre o groove e as espaçador de lamelas de cada lado. Nota: As lamelas do espaçador podem também ser permanentemente ligadas ao slide com super bonder, antecipadamente.</li>
		<li>Oriente as pupas tais que a abertura no caso pupal virado para cima, usando o pincel. Certifique-se de posicionamento cuidadoso das pupas no ângulo correto para a boa qualidade de imagem. Otimize o ângulo para cada tecido e ponto de tempo no desenvolvimento. Nota: Uma pequena quantidade de água no sulco faz das pupas de posicionamento mais fácil. Escorra o excesso de água com o pincel depois para evitar o afogamento.</li>
		<li>Segure uma lamela (18 x 18 mm) acima as pupas sem tocá-los. Coloque pequenas gotas (cerca de 0,5 µ l) de solução de glicerol 50% acima de cada caso pupal, abrindo no sentido do lamela com uma pipeta de 20 µ l. Nota: Este procedimento assegura que as gotas de tem o mesmo espaçamento como as pupas.</li>
		<li>Vire a lamela e posicione-o acima as pupas à mão ou usando fórceps (padrão #5) enquanto descansava um lado da lamela sobre as espaçador lamelas junto as pupas. Em seguida, delicadamente solte a lamela sobre as pupas. Certifique-se de que as aberturas de caso pupal são devidamente protegidas com 50% de glicerol para boa qualidade de imagem e para evitar as pupas de secar.</li>
		<li>Dobre mais uma extremidade de um pedaço de fita adesiva e agarrá-lo com pinça (padrão #5) para esse fim. Coloque delicadamente a fita que cobre uma borda da lamela superior, coverslip(s) o espaçador e o slide plástico em um lado. Não comprima a fita, ainda. Primeiro, vire o slide e repita para o outro lado.</li>
		<li>Use os dois dedos indicadores para pressionar para baixo a fita simultaneamente em ambos os lados. Este procedimento assegura que as pupas não são deslocadas.</li>
		<li>Verifique se as pupas estão bem em contacto com a lamela. Para uma qualidade de imagem ideal as pupas devem ser espremidas suavemente por baixo da lamela. Se necessário, ajuste o número de lamelas de espaçador.</li>
		<li>Rotule o slide por escrito sobre a fita-cola.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. viver de imagem de pupas
<ol><li>O método de montagem permite que a imagem das pupas em microscópios invertidos (Figura 1I) e em microscópios na posição vertical (Figura 1J). Especialmente apropriado para geração de imagens ao vivo está digitalizando microscópios confocal, dois fotões microscópios e microscópios confocal de fiação disco independentemente se eles são invertidos ou eretas. Para filmes a longo prazo, use um palco de temperatura controlada, se disponível.</li>
	<li>Usando a ocular e uma lâmpada UV ou a transmissão de luz, localize uma pupa e foco dentro a pupa.</li>
	<li>Usando a câmera, encontrar a estrutura desejada e ajustar o nível de zoom.</li>
	<li>Para filmes a longo prazo, definir um z-pilha que engloba a estrutura de juros bem (por exemplo, os músculos de voo indirecto, seus locais de fixação, as células de tendão ou uma combinação do acima mencionada) e escolher um intervalo de tempo. Considere fazer uma média para melhor qualidade de imagem. Para filmes de alta velocidade, a curto prazo, escolha um único z-plano para atingir uma taxa de quadros alta.</li>
	<li>Ajuste a potência do laser para dar o melhor sinal possível mas pouca saturação. No entanto, poder do laser muito alto pode danificar a pupa ao longo do tempo.</li>
	<li>Começar a imagem e retornar de vez em quando para ver o filme e reajustar o posicionamento do z-pilha se necessário.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57312/57312fig1.jpg"> Figura 1: fluxo de trabalho para geração de imagens ao vivo da morfogênese músculo-tendão em pupas de drosófila . Veja o protocolo para obter detalhes. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57312/57312fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<ol>
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Os autores não têm nada para divulgar.

O protocolo apresentado descreve como imagem morfogênese músculo-tendão em vida pupas de drosófila usando uma variedade de proteínas fluorescente etiquetadas. Esta na vivo estratégia de imagem pode ser usado para estudar processos de desenvolvimento em seu ambiente natural de todo o organismo.
É crucial para uma experiência bem sucedida encontrar o ponto correto do desenvolvimento tempo para analisar. Por exemplo, dorsolongitudinal os músculos de voo indirecto iniciem acessório para seus destinos de tendão a h ≈16 APF23 enquanto músculos abdominais desenvolvem mais tarde e anexar em ambas as extremidades apenas entre 30 e 40 h APF26. Por conseguinte, literatura publicada anteriormente deve ser usada para encontrar pontos de certo tempo de desenvolvimento para analisar ou, se o tecido ou estrutura de interesse não foi estudada em detalhe antes, do desenvolvimento global tem de ser caracterizada primeiro.
Para pupas de montagem com êxito nas corrediças de plástico sob medidas, é importante que os sulcos têm dimensões adequadas: os sulcos precisam ser 1.0-1.5 mm largura e 0,3 - 0,4 mm de profundidade. Esta profundidade permite ajustar a distância exacta para a superior da lamela com lamelas de espaçador conforme necessário. No entanto, pelo menos uma lamela de espaçador deve ser usada para evitar desperdício do glicerol 50% da amostra por forças capilares. O posicionamento correcto das pupas no sulco requer alguma experiência e devem ser otimizada, tal que a estrutura de juros é tão próxima quanto possível da lamela.
Se um grande número de pupas é suposto ser fotografada na sessão de um microscópio, podem todos ser montados previamente e em seguida armazenados na incubadora até de imagem para garantir o sincronismo do desenvolvimento adequado. As pupas devem sobreviver a todo o procedimento e também pelo menos tentar eclose se manteve no slide, depois da imagem latente. A taxa de sobrevivência pode ser usada como uma leitura para verificar se as condições de imagem prejudicar as pupas.
As configurações de imagem devem ser escolhidas com cuidado de acordo com as condições experimentais. Para filmes a curto prazo, uma taxa de quadros alta contra uma alta relação sinal-ruído deve ser equilibrado, enquanto poder relativamente alta do laser pode ser usado sem danificar as pupas demais. No entanto, para filmes de longa duração, a potência do laser tem de ser mantido a um nível moderado e as pupas não devem ser fotografadas continuamente, mas sim em determinados pontos de tempo, por exemplo, a cada 20 min. Para garantir que a estrutura de interesse não se move fora do campo de visão, é necessário reajustar o posicionamento da z-pilha entre pontos de tempo. A nosso conhecimento, a abertura do caso pupal por si só não afeta cronometrando do desenvolvimento. No entanto, uma fase de temperatura controlada deve ser usada para filmes a longo prazo para garantir o sincronismo do desenvolvimento adequado. Com estas considerações em mente, podem ser adquiridos filmes altamente informativas.
O protocolo apresentado pode ser usado para visualizar Morfogênese músculo-tendão, não só mas também outros tecidos em desenvolvimento, por exemplo, a asa de epitélio da29. São necessárias apenas três modificações para este protocolo: (1) a abertura do caso pupal acima da asa em vez do tórax ou abdômen, (2) posicionamento de pupas com a asa para a topo da lamela e (3) a utilização de proteínas diferentes marcador fluorescente. Com o avanço da tecnologia CRISPR/Cas9, proteínas fluorescentes mais endogenamente etiquetadas estará disponíveis, porque tornou-se mais simples para atingir loci endógena em Drosophila30,31 , 32. no futuro, isto permitirá elucidar a dinâmica de numerosas proteínas, células e tecidos inteiras no seu ambiente fisiológico em detalhe.

O aparelho músculo-tendão permite animais incluindo os seres humanos para mover partes do corpo. Os blocos de construção moleculares do sistema músculo-tendão são altamente conservados. Portanto, conceitos de desenvolvimento do músculo-tendão relevante para a biologia do músculo humano, por exemplo morfogênese de músculo, acessório do músculo-tendão e auto-organização Miofibrilha, podem ser estudados usando Drosophila melanogaster como um facilmente acessíveis modelo do sistema. O sistema de pupa de Drosophila tem várias vantagens experimentais. Em primeiro lugar, na fase de pupa – quando são formados os músculos adultos – o organismo é séssil e, portanto, fácil para a imagem em um microscópio durante um período de horas ou mesmo dias. Em segundo lugar, muitos forma músculos perto debaixo da superfície pupal para que eles podem ser fotografados dentro do organismo intacto, parcialmente translúcido. Em terceiro lugar, os músculos podem ser investigados em seu ambiente natural, onde eles estão conectados para o exoesqueleto formando através de células de tendão e tensão do tecido é acumulado. Isto não é possível em sistemas de cultura de células de músculo. E, finalmente, uma infinidade de ferramentas genéticas está disponível em Drosophila. Entre estes estão muitos marcadores de fluorescente etiquetados que permitam a rotulagem dos tipos de células específicas ou estruturas subcelulares para imagem latente na vivo.
A tabela 1 resume os marcadores mais importantes para estudar a morfogênese músculo-tendão. Isso inclui marcadores overexpressed usando o GAL4-UAS-sistema1 e endogenamente a tag proteína marcadores2,3,4. A vantagem do GAL4-UAS-sistema é que os marcadores são geralmente expressas em níveis elevados, resultando em um sinal forte que pode facilmente ser fotografado em pupas de toda a montagem. Além disso, especificidade de tecido é possível escolhendo drivers de GAL4 cuidadosamente. A vantagem das proteínas de fusão expressado sob controle endógeno é que a dinâmica das respectivas proteínas pode ser estudadas na vivo, enquanto eles também podem ser usados como marcadores para diferentes tipos de células ou estruturas subcelulares específicas, por exemplo, ΒPS-integrina-GFP para sites de fixação muscular. Juntos, estes marcadores fornecem alta flexibilidade no delineamento experimental e a escolha de problemas de pesquisa que pode ser resolvido agora e no futuro.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2">Rotulado de estrutura</td>
			<td colspan="2">Marcador</td>
			<td colspan="2">Expressão e localização</td>
			<td colspan="2">Classe</td>
			<td colspan="2">Número conservado em estoque</td>
			<td colspan="2">Comentário</td>
			<td>Ref.</td>
		</tr><tr><td colspan="2" rowspan="15">Músculo</td>
			<td colspan="2">
Mef2-GAL4</td>
			<td colspan="2">todos os mioblastos e todos os músculos em todas as fases</td>
			<td colspan="2">Linha GAL4</td>
			<td colspan="2">BL 27390</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td colspan="2">
1151-GAL4</td>
			<td colspan="2">precursores de músculo adulto e myotubes início até ≈24 h APF</td>
			<td colspan="2">Linha de GAL4, armadilha potenciador</td>
			<td colspan="2">-</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>6</td>
		</tr><tr><td colspan="2">
Act79B-GAL4</td>
			<td colspan="2">saltar o músculo sobre diferenciação</td>
			<td colspan="2">Linha GAL4</td>
			<td colspan="2">-</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>7</td>
		</tr><tr><td colspan="2">
Act88F-GAL4</td>
			<td colspan="2">músculos de voo indirecto começando ≈14 h APF</td>
			<td colspan="2">Linha GAL4</td>
			<td colspan="2">-</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>7</td>
		</tr><tr><td colspan="2">
Act88F- Cameleon 3.1</td>
			<td colspan="2">músculos de voo indirecto começando ≈14 h APF</td>
			<td colspan="2">Potenciador de Act88F / promotor condução 3.1 Cameleon</td>
			<td colspan="2">-</td>
			<td colspan="2">Indicador de CA2 +</td>
			<td>8</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Act88F-GFP</td>
			<td colspan="2">músculos de voo indirecto começando ≈14 h APF</td>
			<td colspan="2">GFP-fusão (mosca TransgeneOme linha)</td>
			<td colspan="2">fTRG78 e fTRG10028</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>4</td>
		</tr><tr><td colspan="2">
Ele- nls-GFP</td>
			<td colspan="2">precursores de músculo adulto, nucleares, até ≈24 h APF nos músculos de voo indirecto</td>
			<td colspan="2">potenciador/promotor com repórter nls-GFP</td>
			<td colspan="2">-</td>
			<td colspan="2">fragmento de potenciador de 1,5 kb</td>
			<td>9</td>
		</tr><tr><td colspan="2">
MHC-Tau-GFP</td>
			<td colspan="2">microtúbulos em modelos DLM e em diferenciar os músculos</td>
			<td colspan="2">potenciador/promotor com repórter Tau-GFP</td>
			<td colspan="2">BL 53739</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>10</td>
		</tr><tr><td colspan="2">ΒTub60D-GFP</td>
			<td colspan="2">microtúbulos em myotubes (por exemplo, nos músculos de voo indirecto de h ≈14 AFP, diminuindo fortemente após ≈48 h APF)</td>
			<td colspan="2">GFP-fusão (mosca TransgeneOme linha)</td>
			<td colspan="2">fTRG958</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>4</td>
		</tr><tr><td colspan="2">MHC-GFP (weeP26)</td>
			<td colspan="2">sarcômeros (filamento grosso) em todos os músculos do corpo (por exemplo, nos músculos de voo indirecta a partir ≈30 h APF)</td>
			<td colspan="2">GFP-armadilha</td>
			<td colspan="2">-</td>
			<td colspan="2">Use heterozigotos, rotula um subconjunto de isoforma</td>
			<td>11</td>
		</tr><tr><td colspan="2">SLS-GFP</td>
			<td colspan="2">sarcômeros (Z-disco) em todos os músculos do corpo (por exemplo, nos músculos de voo indirecta a partir ≈30 h APF)</td>
			<td colspan="2">GFP-armadilha (linha FlyTrap)</td>
			<td colspan="2">-</td>
			<td colspan="2">G53, uso heterozigoto</td>
			<td>2</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Zasp66-GFP</td>
			<td colspan="2">Z-disco em todos os músculos do corpo</td>
			<td colspan="2">GFP-armadilha (linha FlyTrap)</td>
			<td colspan="2">BL 6824</td>
			<td colspan="2">ZCL0663</td>
			<td>
2 , 12
</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Zasp52-GFP</td>
			<td colspan="2">Z-disco em todos os músculos do corpo</td>
			<td colspan="2">GFP-armadilha (linha FlyTrap)</td>
			<td colspan="2">BL 6838</td>
			<td colspan="2">G00189</td>
			<td>
2 , 12
</td>
		</tr><tr><td colspan="2">HTS-GFP</td>
			<td colspan="2">ligação da actina; expressa no epitélio, mioblastos e myotubes</td>
			<td colspan="2">GFP-fusão (mosca TransgeneOme linha)</td>
			<td colspan="2">fTRG585</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>4</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Dlg1-GFP</td>
			<td colspan="2">junções célula epitelial, mioblastos e membranas nos músculos em todas as fases</td>
			<td colspan="2">GFP-fusão (mosca TransgeneOme linha)</td>
			<td colspan="2">fTRG502</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>4</td>
		</tr><tr><td colspan="2" rowspan="5">Local de fixação do músculo</td>
			<td colspan="2">ΒPS-integrina-GFP</td>
			<td colspan="2" fo:page-break-inside="avoid">sites de fixação muscular (por exemplo, partida ≈18 h AFP nos músculos de voo indirecto)</td>
			<td colspan="2">GFP-batida-em</td>
			<td colspan="2">-</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>13</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Talin-GFP e - mCherry</td>
			<td colspan="2">sites de fixação muscular (por exemplo, partida ≈18 h AFP nos músculos de voo indirecto)</td>
			<td colspan="2">GFP-armadilha (linha MiMIC)</td>
			<td colspan="2">-</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>3</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Talin-GFP</td>
			<td colspan="2">sites de fixação muscular (por exemplo, partida ≈18 h AFP nos músculos de voo indirecto)</td>
			<td colspan="2">GFP-fusão (mosca TransgeneOme linha)</td>
			<td colspan="2">fTRG587</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>4</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Laia-GFP</td>
			<td colspan="2">sites de fixação muscular (por exemplo, partida ≈18 h AFP nos músculos de voo indirecto)</td>
			<td colspan="2">GFP-armadilha (linha FlyTrap)</td>
			<td colspan="2">Kyoto 110951 (ZCL3111)</td>
			<td colspan="2">ZCL3111, ZCL3192</td>
			<td>2</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Vinc-GFP e - RFP</td>
			<td colspan="2">sites de fixação muscular (por exemplo, partida ≈18 h AFP nos músculos de voo indirecto)</td>
			<td colspan="2">GFP-fusão (transgene)</td>
			<td colspan="2">-</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>13</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Tendão</td>
			<td colspan="2">
Sr-GAL4</td>
			<td colspan="2">células de tendão do tórax, durante a fase de pupa</td>
			<td colspan="2">Linha de GAL4, armadilha potenciador</td>
			<td colspan="2">BL 26663</td>
			<td colspan="2">homozigótica letal</td>
			<td>14</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Músculos e tendões</td>
			<td colspan="2">
Duf-GAL4</td>
			<td colspan="2">músculos e epitélios, início precoce</td>
			<td colspan="2">Linha GAL4</td>
			<td colspan="2">BL 66682</td>
			<td colspan="2">kirre-rP298, marcador de célula do fundador</td>
			<td>15</td>
		</tr><tr><td colspan="2" rowspan="7">UAS-repórteres</td>
			<td colspan="2">
UAS- GFP-Gma</td>
			<td colspan="2">emperramento do actínio</td>
			<td colspan="2">Linha UAS</td>
			<td colspan="2">BL 31776</td>
			<td colspan="2">domínio de ligação de actina de Moesin fundido a GFP</td>
			<td>16</td>
		</tr><tr><td colspan="2">
UAS- mCherry-Gma</td>
			<td colspan="2">emperramento do actínio</td>
			<td colspan="2">Linha UAS</td>
			<td colspan="2">-</td>
			<td colspan="2">GMA fundidos para mCherry</td>
			<td>17</td>
		</tr><tr><td colspan="2">
UAS- Lifeact-GFP</td>
			<td colspan="2">emperramento do actínio</td>
			<td colspan="2">Linha UAS</td>
			<td colspan="2">BL 35544</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>18</td>
		</tr><tr><td colspan="2">
UAS- Lifeact-Ruby</td>
			<td colspan="2">emperramento do actínio</td>
			<td colspan="2">Linha UAS</td>
			<td colspan="2">BL 35545</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>18</td>
		</tr><tr><td colspan="2">
UAS-CD8-GFP</td>
			<td colspan="2">vinculação de membrana</td>
			<td colspan="2">Linha UAS</td>
			<td colspan="2">várias acções, por exemplo: BL 32184</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>19</td>
		</tr><tr><td colspan="2">
UAS-CD8-mCherry</td>
			<td colspan="2">vinculação de membrana</td>
			<td colspan="2">Linha UAS</td>
			<td colspan="2">BL 27391 e 27392</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>20</td>
		</tr><tr><td colspan="2">
UAS-Palma-mCherry</td>
			<td colspan="2">ligação de membrana através de palmitoylation</td>
			<td colspan="2">Linha UAS</td>
			<td colspan="2">BL 34514</td>
			<td colspan="2">
UAS- brainbow</td>
			<td>21</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 1: Fluorescente etiquetado marcadores de proteína adequadas para estudar músculo-tendão morfogênese na vivo.
Aqui, descrevemos em detalhe como imagem da morfogênese músculo-tendão em pupas de vida pode ser realizada facilmente e com sucesso (Figura 1). Alternativamente, podem ser corrigidas pupas, dissecados e immunostained, que permite o uso de anticorpos para rotular também proteínas, para o qual não vivo marcadores estão disponíveis22. Neste caso, a qualidade de imagem é geralmente maior, porque não há nenhum movimento e a estrutura de interesse pode ser colocada em estreita proximidade com a lamela. No entanto, dissecção e fixação podem levar a danos e molecular ou dinâmica de tecido, por exemplo, músculo tremer, só pode ser estudada em organismo vivo.

<table><tbody><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Leica</td><td>MZ6</td><td>product has been replaced by Leica M60</td></tr><tr><td>fly food in bottles (or vials)</td><td>-</td><td>-</td><td>standard culture medium</td></tr><tr><td>paint brush</td><td>da Vinci</td><td>1526Y</td><td>size 1</td></tr><tr><td>microscope slides</td><td>Thermo Scientific</td><td>VWR: 631-1303</td><td>76 x 26 mm</td></tr><tr><td>double-sided tape (optional)</td><td>Scotch</td><td>6651263</td><td>12 mm x 6.3 m</td></tr><tr><td>petri dishes</td><td>Greiner Bio-One</td><td>632102</td><td>94 x 16 mm</td></tr><tr><td>paper tissues</td><td>Th.Geyer</td><td>7695251</td><td></td></tr><tr><td>forceps #5 (Dumont, inox, standard)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td>0.1 mm x 0.06 mm tip</td></tr><tr><td>forceps #5 (Dumont, inox, biology grade)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td>0.05 mm x 0.02 mm tip</td></tr><tr><td>Cohan-Vannas spring scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-02</td><td>straight tip</td></tr><tr><td>plastic slides with a groove (reusable)</td><td>custom-built</td><td>-</td><td>75 x 26 x 4 mm plexi glass slide with 1.0-1.5 mm wide and 0.3-0.4 mm deep groove</td></tr><tr><td>coverslips</td><td>Marienfeld</td><td>107032</td><td>18 x 18 mm, No. 1.5H</td></tr><tr><td>glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>49781</td><td>dilute to 50 % in water</td></tr><tr><td>adhesive tape</td><td>Tesa</td><td>57370-02</td><td>1.5 mm x 10 m</td></tr></tbody></table>

in vivo imaging of muscle-tendon morphogenesis in drosophila pupae

Músculos, juntamente com os tendões e o esqueleto permitem animais incluindo os seres humanos para mover partes do corpo. Morfogênese de músculo é altamente conservado de animais para os seres humanos. Portanto, o poderoso sistema de Drosophila modelo pode ser usado para estudar os conceitos de desenvolvimento de músculo-tendão que também pode ser aplicado a biologia do músculo humano. Aqui, descrevemos em detalhe como morfogênese do sistema músculo-tendão adulto pode facilmente ser fotografada em vida, desenvolvimento de pupas de Drosophila . Portanto, o método permite investigar proteínas, células e tecidos em seu ambiente fisiológico. Além de um protocolo passo a passo com dicas úteis, nós fornecemos uma visão abrangente das proteínas marcador fluorescente etiquetado que são apropriados para estudar o sistema músculo-tendão. Para destacar as aplicações versáteis do protocolo, mostramos filmes exemplo variando de visualização de eventos morfogenéticas a longo prazo – ocorrendo na escala de tempo de horas e dias – para visualização de processos dinâmicos a curto prazo como contracções musculares ocorrendo em escala de tempo de segundos. Tomados em conjunto, o presente protocolo deverá permitir o leitor a projetar e executar experimentos de geração de imagens ao vivo para investigar morfogênese músculo-tendão no organismo intacto.

Vários tecidos podem ser imagem na vivo no desenvolvimento de pupas voar, tornando-os um sistema modelo ideal para estudar a morfogênese dos órgãos adultos. Entre estes estão os músculos de voo indirecto, o epitélio do tórax, incluindo as células de tendão, o epitélio de asa, músculos abdominais e o coração22,23,24,25,26 , 27. aqui, focamos nas imagens ao vivo da morfogênese de músculos e tendões. Para uma descrição detalhada do músculo de voo indirecto e morfogênese do músculo abdominal e métodos adicionais para estudar Biologia do músculo em Drosophila, remetemos o leitor para Weitkunat e Schnorrer 201422.
Viver a imagem dos músculos de voo indirecto
Para estudar o desenvolvimento a longo prazo dos músculos do voo indireta consiste dos músculos dorsolongitudinal (webcam) e os músculos dorsoventral (DVMs), globular Moesin domínio de ligação de actina marcado com GFP (UAS -GFP-Gma) foi expressa em todos os os músculos usando o fator potenciador de miócito 2 (Mef2)-GAL4 condutor (Fig. 2A-D, Filme S1). Antes da imagem, uma janela no caso pupal foi aberta acima do tórax, como mostrado na Figura 1F. Em um microscópio de dois fotões, z-pilhas foram adquiridos a cada 20 min para 21 h iniciando no ≈11 h após a formação do casulo (11 h APF). Neste quadro de tempo, a webcam (verde sobreposições na Figura 2A'-D') primeiro iniciar o apego às células do tendão (Figura 2A) e em seguida dividido enquanto os ligamentos musculares maduras (Figura 2B). Em seguida, os myotubes encurtar (Figura 2), até finalmente chegarem a fase màxima compactada em 30 h APF (Figura 2D). Tomados em conjunto, este filme destaca as mudanças dramáticas na morfologia do músculo que ocorrem na escala de tempo de horas.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57312/57312fig2.jpg"> Figura 2: viver a imagem latente da morfogênese de músculos e tendões do voo indirecto. (A-D) Pontos de um filme de dois fotões (filme S1) usando Mef2-GAL4, UAS- GFP-Gma como um marcador para actina dos músculos de voo indirecto consistindo dos músculos dorsolongitudinal (webcam, realçado em verde na '-D') e o (músculos dorsoventral DVMs, realçadas em azul na '-D'). Barras de escala são 100 µm. (E-H) pontos de tempo de um filme de dois fotões (filme S2) usando Duf-GAL4UAS-CD8-GFP como marcador para músculos de voo indirecto e o epitélio do tórax, incluindo células de tendão. Painéis E'-H' mostrar uma sobreposição com um modelo do sistema músculo-tendão em cada ponto de tempo, destacar as extensões de tempo celulares formada por epitélio de tendão (magenta) em contacto com os músculos (verde). Barras de escala são 100 µm (estimativa de tamanho de imagens estruturas). (Eu-L) Tempo pontos de duas cores, girando disco confocal cinema (filme S3) com foco na iniciação de acessório do músculo-tendão. As células de tendão são rotuladas com sr-GAL4UAS-palm-mCherry (magenta) e a dorsolongitudinal indirecta voo músculos com Mhc -Tau-GFP (verde). Barras de escala são 10 µm. o tempo é indicado como hh: mm após a formação do casulo (APF). Note que nem todos os filmes foram adquiridos em um palco de temperatura controlada, portanto, pode desviar-se do desenvolvimento sincronismo. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57312/57312fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Para estudar a morfogênese de tendão e músculo ao mesmo tempo, membrana-limite GFP (UAS -CD8-GFP) foi expressada usando Dumbfounded (Duf)-GAL4 como motorista, que é expressa em células o tendão e os músculos de voo indirecto (Figura 2E -H, filme S2). Um z-pilha foi tirada em um microscópio de dois fotões a cada 20 min, começando às 16h APF para 20 h. Enquanto os myotubes compacto (sobreposição verde na Figura 2E'-H'), o tendão células extensões de tempo celular de forma que alongar com tempo (magenta sobreposição na Figura 2E'-H'). Tomados em conjunto, este filme destaca a estreita interação entre o tendão e o músculo células na vivo.
Para investigar a interação músculo-tendão mais detalhadamente, realizou-se a imagem de duas cores, alta ampliação. Pupas com cadeia pesada de miosina (Mhc)-Tau-GFP na webcam e UAS -palmitoylated-mCherry (UAS -palm-mCherry), conduzido por listra (sr)-GAL4 nos tendões foram fotografada a cada 5 min, começando às 12h APF para 4,5 h em um disco girando microscópio confocal (Figura 2I-L, filme S3). A 12 h APF, os myotubes migrar para suas células-alvo do tendão ao formando filopodia longa em suas pontas (Figura 2I). Posteriormente, os músculos e tendões tecidos interdigitate (Figura 2J, K) para formar uma ligação estável. Como o acessório amadurece, menos filopodia forma e interface músculo-tendão suaviza (Figura 2 L). Assim, a imagem de duas cores, alta ampliação pode ser usada para revelar a dinâmica celular detalhadamente o organismo vivo.
Viver a imagem dos músculos abdominais
Para geração de imagens ao vivo dos músculos abdominais (Figura 3filme S4), Mef2-GAL4> UAS-CD8-GFP foi usado como um marcador e uma janela foi aberta acima no abdômen no caso pupal como detalhado na Figura 1. Semelhante ao filme de músculo voo indireto representado na Figura 2A-D, a formação e o crescimento dos músculos abdominais podem ser seguidos ao longo de muitas horas de desenvolvimento (55 h no filme S4). Durante este tempo, os mioblastos fundem-se para formar o crescimento myotubes (Figura 3A). As dicas de myotube migram para os alvos de tendão, e após fixar as células de tendão, formam-se as unidades contráteis dos músculos, os sarcômeros, (Figura 3B-D).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57312/57312fig3.jpg"> Figura 3: viver de imagem da morfogênese do músculo abdominal. (A-D) Pontos de um filme (filme S4) usando Mef2-GAL4UAS-CD8-GFP como marcador para seguir morfogênese do músculo abdominal. Painéis A'-E' Mostrar sobreposições com modelos de um conjunto de músculos abdominais (verde) que se forma de novo durante a fase de pupa. Barras de escala são 100 µm. tempo é indicado como hh: mm APF. O filme foi adquirido à temperatura ambiente. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57312/57312fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Viver da imagem latente de se contraindo os músculos
Em contraste com a Figura 2 e Figura 3, a Figura 4 mostra a dinâmica muscular ocorrendo na escala de tempo de segundos: a gravação ao vivo de contrações musculares. Pupas expressando GFP-βPS-integrina sob controle endógeno foram fotografadas com uma resolução de tempo de 0,65 s em um único plano z em um microscópio confocal (Filme S5). No exemplo apresentado na Figura 4, os sítios de fixação de três DVMs (Figura 4A) foram fotografados por 10 minutos, começando a 42 h APF. Durante este tempo, contração de cinco eventos foram observados (Figura 4B-F), mostrando que os sarcômeros são montados já bem o suficiente para suportar contrações coordenadas neste ponto de tempo no desenvolvimento. Portanto, imagem latente de contracções musculares pode ser usado como uma leitura funcional para sarcomerogenesis já durante o desenvolvimento indireto voo músculo28, em oposição por exemplo testes de voo, que só pode ser realizada após a eclosão.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57312/57312fig4.jpg"> Figura 4: ao vivo por imagens do se contraindo os músculos. (A) primeiro tempo-ponto de um filme (filme S5) apresentando espasmos dos músculos de voo indirecto dorsoventral em 42 h APF usando βPS-integrina-GFP como marcador. No campo de visão é o músculo acessório sites de DVM II 2, DVM III 1 e DVM III 2. (B-F) Cor sobreposições de cinco eventos de contração individual, cada um mostrando o quadro antes da contração muscular (magenta) e o primeiro quadro do evento contração (verde). Note-se que as fibras musculares individuais se contrair independentemente uns dos outros. Setas destacam-se o movimento de contrair. O tempo de resolução do filme é 0,65 s. barras de escala são 25 µm. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57312/57312fig4large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Viver a imagem latente de proteínas endogenamente marcadas
Semelhante ao βPS-integrina-GFP, uma grande coleção de proteínas da fusão expressado em Drosophila sob controle endógeno tem sido gerado2,3,4. Estas linhas de voar podem ser usadas para estudar, por exemplo, a Localização subcellular ou os perfis de expressão de proteínas de interesse. A coleção é especialmente útil se os anticorpos específicos não estão disponíveis ou dinâmica da proteína precisa ser investigado na vivo sem fixação. A Figura 5 mostra três exemplos de proteínas da fusão endogenamente expressa da biblioteca de TransgeneOme (fTRG) voar, Hu li tai shao (Hts)-GFP (Figura 5A, B), Talin-GFP (Figura 5, D) e ( βTubulin60D-GFP Figura 5E, F). A expressão destas proteínas pode ser estudada em todos os tecidos que expressá-las naturalmente. Aqui, nós mostramos o epitélio do tórax (Figura 5AC, E) e os músculos de voo indirecto ou seus sítios de ligação (Figura 5BD, F) como exemplos.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57312/57312fig5.jpg"> Figura 5: imagens ao vivo de endogenamente marcados proteínas. (A, B) Máximos projeções de z-pilhas tomadas de pupas expressando Hts-GFP. (C, D) Máximos projeções de z-pilhas tomadas de pupas expressando GFP-Talin. (E, F) Máximos projeções de z-pilhas tomadas de pupas expressando GFP-βTubulin60D. Painéis A, C e E mostram o epitélio do tórax em 18, 24 e 18 h APF, respectivamente e painéis B, D e F mostram os músculos de voo indirecto ou seus sites de apego a 30 h APF. Barras de escala são 25 µm. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57312/57312fig5large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

Aqui, apresentamos um método fácil de usar e versátil para executar ao vivo de imagens de processos de desenvolvimento em geral e músculo-tendão morfogênese em particular na vida pupas de Drosophila .

Na Vivo Imagem latente da morfogênese músculo-tendão em pupas de Drosophila

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from ...

in-vivo-imaging-of-muscle-tendon-morphogenesis-in-drosophila-pupae

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

11.3K visualizações.  Max Planck Institute of Biochemistry. Aqui, apresentamos um método fácil de usar e versátil para executar ao vivo de imagens de processos de desenvolvimento em geral e músculo-tendão morfogênese em particular na vida pupas de Drosophila .

Vídeo: In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track during live cell imaging. These processes include: retinal rotation, cell growth and organismal movement. Additionally, irregularities in the topology of the epithelium, including subtle bumps and folds often introduced as the pupa is prepared for imaging, make it challenging to acquire in-focus images of more than a few ommatidia in a single focal plane. The workflow outlined here remedies these issues, allowing easy analysis of cellular processes during Drosophila pupal eye development. Appropriately-staged pupae are arranged in an imaging rig that can be easily assembled in most laboratories. Ubiquitin-DE-Cadherin:GFP and GMR-GAL4&#8211;driven UAS-&#945;-catenin:GFP are used to visualize cell boundaries in the eye epithelium 1-3. After deconvolution is applied to fluorescent images captured at multiple focal planes, maximum projection images are generated for each time point and enhanced using image editing software. Alignment algorithms are used to quickly stabilize superfluous motion, making individual cell behavior easier to track.

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.

Vivo-imaging da<em&gt; Drosophila</em&gt; Pupal Eye

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Biologia do Desenvolvimento

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have been used to study many biological processes, such as cell proliferation, differentiation, growth, migration, apoptosis, competition, cell-cell signaling, and compartmental boundary formation. However, methods for the long-term ex vivo culture and live imaging of the imaginal discs have not been satisfactory, despite many efforts. Recently, we developed a method for the long-term ex vivo culture and live imaging of imaginal discs for up to 18 h. In addition to using a high insulin concentration in the culture medium, a low-melting agarose was also used to embed the disc to prevent it from drifting during the imaging period. This report uses the eye-antennal discs as an example. Photoreceptor R3/4-specific m&#948;0.5-Ga4 expression was followed to demonstrate that photoreceptor differentiation and ommatidial rotation can be observed during a 10 h live imaging period. This is a detailed protocol describing this simple method.

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

This protocol describes a detailed method for the long-term ex vivo culture and live imaging of a Drosophila imaginal disc. It demonstrates photoreceptor differentiation and ommatidial rotation within the 10 h period of live imaging of the eye disc. The protocol is simple and does not require expensive setup.

Longo prazo Imagens ao vivo de<em&gt; Drosophila</em&gt; Disco para os olhos

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches

Drosophila flight muscle is a powerful model to study diverse processes such as transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and mechanobiology, which all influence muscle development and myofibrillogenesis. Omics data, such as those generated by mass spectrometry or deep sequencing, can provide important mechanistic insights into these biological processes. For such approaches, it is beneficial to analyze tissue-specific samples to increase both selectivity and specificity of the omics fingerprints. Here we present a protocol for dissection of fluorescent-labeled flight muscle from live pupae to generate highly enriched muscle samples for omics applications. We first describe how to dissect flight muscles at early pupal stages (&#60;48 h after puparium formation [APF]), when the muscles are discernable by green fluorescent protein (GFP) labeling. We then describe how to dissect muscles from late pupae (&#62;48 h APF) or adults, when muscles are distinguishable under a dissecting microscope. The accompanying video protocol will make these technically demanding dissections more widely accessible to the muscle and Drosophila research communities. For RNA applications, we assay the quantity and quality of RNA that can be isolated at different time points and with different approaches. We further show that Bruno1 (Bru1) is necessary for a temporal shift in myosin heavy chain (Mhc) splicing, demonstrating that dissected muscles can be used for mRNA-Seq, mass spectrometry, and reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) applications. This dissection protocol will help promote tissue-specific omics analyses and can be generally applied to study multiple biological aspects of myogenesis.

Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches

Drosophila flight muscle is a powerful model to study transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and mechanobiology. We present a protocol for dissection of fluorescent-labeled flight muscle from live pupae to generate highly enriched samples ideal for proteomics and deep-sequencing. These samples can offer important mechanistic insights into diverse aspects of muscle development.

Dissecção de músculos de vôo de Drosophila melanogaster para abordagens Omics

Drosophila flight muscle is a powerful model to study diverse processes such as transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and ...

Genética

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Visualizing developing organ formation as well as progession and treatment of disease often heavily relies on the ability to optically interrogate molecular and functional changes in intact living organisms. Most existing optical imaging methods are inadequate for imaging at dimensions that lie between the penetration limits of modern optical microscopy (0.5-1mm) and the diffusion-imposed limits of optical macroscopy (&gt;1cm) [1]. Thus, many important model organisms, e.g. insects, animal embryos or small animal extremities, remain inaccessible for in-vivo optical imaging. 
Although there is increasing interest towards the development of nanometer-resolution optical imaging methods, there have not been many successful efforts in improving the imaging penetration depth. The ability to perform in-vivo imaging beyond microscopy limits is in fact met with the difficulties associated with photon scattering present in tissues. Recent efforts to image entire embryos for example [2,3] require special chemical treatment of the specimen, to clear them from scattering, a procedure that makes them suitable only for post-mortem imaging. These methods however evidence the need for imaging larger specimens than the ones usually allowed by two-photon or confocal microscopy, especially in developmental biology and in drug discovery.
We have developed a new optical imaging technique named Mesoscopic Fluorescence Tomography [4], which appropriate for non-invasive in-vivo imaging at dimensions of 1mm-5mm. The method exchanges resolution for penetration depth, but offers unprecedented tomographic imaging performance and it has been developed to add time as a new dimension in developmental biology observations (and possibly other areas of biological research) by imparting the ability to image the evolution of fluorescence-tagged responses over time. As such it can accelerate studies of morphological or functional dependencies on gene mutations or external stimuli, and can importantly, capture the complete picture of development or tissue function by allowing longitudinal time-lapse visualization of the same, developing organism.
The technique utilizes a modified laboratory microscope and multi-projection illumination to collect data at 360-degree projections. It applies the Fermi simplification to Fokker-Plank solution of the photon transport equation, combined with geometrical optics principles in order to build a realistic inversion scheme suitable for mesoscopic range. This allows in-vivo whole-body visualization of non-transparent three-dimensional structures in samples up to several millimeters in size.
We have demonstrated the in-vivo performance of the technique by imaging three-dimensional structures of developing Drosophila tissues in-vivo and by following the morphogenesis of the wings in the opaque Drosophila pupae in real time over six consecutive hours.

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Mesoscopic fluorescence tomography operates beyond the penetration limits of tissue-sectioning fluorescence microscopy. The technique is based on multi-projection illumination and a photon transport description. We demonstrate in-vivo whole-body 3D visualization of the morphogenesis of GFP-expressing wing imaginal discs in Drosophila melanogaster.

Mesoscópica de fluorescência para Tomografia In-vivo Imaging de desenvolvimento Drosophila</em

Visualizing  developing organ formation as well as progession and treatment of disease often  heavily relies on the ability to optically interrogate ...

Biologia

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits are required to control this behavior. Failure to produce the rhythmic pattern of contractions can be indicative of neurological abnormalities. We previously found that defects in protein O-mannosylation, a posttranslational protein modification, affect the axon morphology of sensory neurons and result in abnormal coordinated muscle contractions in embryos. Here, we present a relatively simple method for recording and analyzing the pattern of peristaltic muscle contractions by live imaging of late stage embryos up to the point of hatching, which we used to characterize the muscle contraction phenotype of protein O-mannosyltransferase mutants. Data obtained from these recordings can be used to analyze muscle contraction waves, including frequency, direction of propagation and relative amplitude of muscle contractions at different body segments. We have also examined body posture and taken advantage of a fluorescent marker expressed specifically in muscles to accurately determine the position of the embryo midline. A similar approach can also be utilized to study various other behaviors during development, such as embryo rolling and hatching.

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Here, we present a method to record embryonic muscle contractions in Drosophila embryos in a non-invasive and detail-oriented manner.

Imagens ao vivo e análise de contrações musculares no embrião de Drosophila

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits ...

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

Within multicellular organisms, mature tissues and organs display high degrees of order in the spatial arrangements of their constituent cells. A remarkable example is given by sensory epithelia, where cells of the same or distinct identities are brought together via cell-cell adhesion showing highly organized planar patterns. Cells align to one another in the same direction and display equivalent polarity over large distances. This organization of the mature epithelia is established over the course of morphogenesis. To understand how the planar arrangement of the mature epithelia is achieved, it is crucial to track cell orientation and growth dynamics with high spatiotemporal fidelity during development in vivo. Robust analytical tools are also essential to identify and characterize local-to-global transitions. The Drosophila pupa is an ideal system to evaluate oriented cell shape changes underlying epithelial morphogenesis. The pupal developing epithelium constitutes the external surface of the immobile body, allowing long-term imaging of intact animals. The protocol described here is designed to image and analyze cell behaviors at both global and local levels in the pupal abdominal epidermis as it grows. The methodology described can be easily adapted to the imaging of cell behaviors at other developmental stages, tissues, subcellular structures, or model organisms.

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

This protocol is designed for the imaging and analysis of the dynamics of cell orientation and tissue growth in the Drosophila abdominal epithelia as the fruit fly undergoes metamorphosis. The methodology described here can be applied to the study of different developmental stages, tissues, and subcellular structures in Drosophila or other model organisms.

Imagem e Análise da Dinâmica de Orientação e Crescimento tecidual na Epitélia Drosophila em Desenvolvimento durante os estágios pupal

Within multicellular organisms, mature tissues and organs display high degrees of order in the spatial arrangements of their constituent cells. A ...

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal lines have enabled biological processes to be studied in the context of a living, and in some instances even behaving, organism. In this protocol we will describe how to anesthetize intact Drosophila larvae, using the volatile anesthetic desflurane, to follow the development and plasticity of synaptic populations at sub-cellular resolution1-3. While other useful methods to anesthetize Drosophila melanogaster larvae have been previously described4,5,6,7,8, the protocol presented herein demonstrates significant improvements due to the following combined key features: (1) A very high degree of anesthetization; even the heart beat is arrested allowing for lateral resolution of up to 150 nm1, (2) a high survival rate of &gt; 90% per anesthetization cycle, permitting the recording of more than five time-points over a period of hours to days2 and (3) a high sensitivity enabling us in 2 instances to study the dynamics of proteins expressed at physiological levels. In detail, we were able to visualize the postsynaptic glutamate receptor subunit GluR-IIA expressed via the endogenous promoter1 in stable transgenic lines and the exon trap line FasII-GFP1. (4) In contrast to other methods4,7 the larvae can be imaged not only alive, but also intact (i.e. non-dissected) allowing observation to occur over a number of days1. The accompanying video details the function of individual parts of the in vivo imaging chamber2,3, the correct mounting of the larvae, the anesthetization procedure, how to re-identify specific positions within a larva and the safe removal of the larvae from the imaging chamber.

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

This protocol describes a reliable method for anesthetization and imaging of intact Drosophila melanogaster larvae. We have utilized the volatile anesthetic desflurane to allow for repetitive imaging at sub-cellular resolution and re-identification of structures for up to a few days1.

Na imagem in vivo de larvas Drosophila Intact no Sub-celular Resolução

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal ...

<meta charset="utf8"></head><body>Imagem ao vivo estendida da morfogênese da perna de pupa de Drosophila sem pupúrio

Long-Term Live Imaging of Drosophila Pupal Leg Development After Puparium Removal

Over the past decades, significant progress has been made in understanding the mechanisms of cell fate determination. However, the process by which fate-determined cells form three-dimensional organismal shapes remains unclear. Recent advances in confocal microscopy have facilitated efforts to observe cell dynamics during development through live imaging. The Drosophila melanogaster pupa is ideal for live imaging due to its immobility, transparent pupal cuticle, and the availability of fluorescent reporter lines. A primary challenge for imaging is the puparium, the cuticle surrounding the pupa, which obstructs optical imaging. While previous methods involved either partial or complete removal of the puparium, maintaining pupal viability for extended periods after this procedure has remained challenging. Here, a simple method is presented for days-long live imaging of the Drosophila leg during the pupal stage, involving complete puparium removal. The method includes removing the puparium from a pupa adhered to double-sided tape, followed by assembling a small chamber on a glass-bottom dish to enclose the pupa and a drop of water. This setup is straightforward, reliable, and supports extended pupal survival by preventing desiccation. Long-term live imaging of the Drosophila pupa has significantly contributed to capturing how the adult leg undergoes dramatic three-dimensional structural changes over 2-3 days. These changes include the transient formation of an intriguing structure (the Parthenon-like structure) by epithelial cells, rapid tissue narrowing, joint formation, and bristle elongation. This method is applicable to the observation of various tissues and can potentially be combined with other techniques, such as optical gene induction, to advance the understanding of cell dynamics during the final shape formation of tissues in the pupal stage.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor em destaque: Descobrindo estruturas epiteliais dinâmicas durante o desenvolvimento de Drosophila

Here, a protocol is presented for long-term live imaging of the Drosophila leg during the pupal stage, involving complete removal of the puparium. This protocol can also be applied to other tissues.

Imagem ao vivo de longo prazo do desenvolvimento da perna de pupa de Drosophila após a remoção do pupário

Over the past decades, significant progress has been made in understanding the mechanisms of cell fate determination. However, the process by which ...

Na Vivo Imagem latente da morfogênese músculo-tendão em pupas de Drosophila

Resumo

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Na imagem in vivo de larvas Drosophila Intact no Sub-celular Resolução

Imagem ao vivo de longo prazo do desenvolvimento da perna de pupa de Drosophila após a remoção do pupário

Imagem ao vivo de longo prazo do desenvolvimento da perna de pupa de Drosophila após a remoção do pupário

Imagem ao vivo de longo prazo do desenvolvimento da perna de pupa de Drosophila após a remoção do pupário